流式细胞术免疫标记简介完整ppt课件
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流式细胞术课件
90LS Sensor
散射光
散射光能被用来区分不同细胞群体的基本形态上 的差异 - 通常使用“散点图”来看散射光信号 - 散点图上的一个点就代表一个细胞颗粒的数 据
散点图——Dot Plot
lysed whole blood
测得的FS与SS信号通 过计算机处理，可得到 FS-SS图，由此可仅用 散射光信号对未染色的 活细胞进行分析或分选。
光学系统示意图
Flow Tip
SS and FL Detector
FS Detector
Laser
（1）激光光源
➢ 单波长、高强度、高稳定性
➢ 多采用氩离子激光器或氦氖激光器
➢ 一般选配2-4根激光，488nm 、633nm和 355nm、407nmUV激光
➢ 最多检测13个荧光参数
Optical Filters
- 相对细胞大小 - 相对细胞颗粒密度和内部复杂度 - 染色过细胞的相对荧光强度
流式细胞仪常检测的细胞特性
细胞组成
大小 粒度 DNA, RNA含量 蛋白质含量 钙离子, PH值, 膜电位
细胞功能
细胞表面/胞浆/核--特异性抗原 细胞活性 胞内细胞因子 激素结合位点 酶活性
基础研究
淋巴细胞功能、树突状细胞（DC）研究、造血干 细胞研究、细胞周期分析、细胞凋亡分析、凋亡相 关蛋白分析、细胞功能研究、多药耐药基因研究 （MDR）、肿瘤相关基因表达研究、RNA测定、 DNA测定、总蛋白测定、癌基因和抑癌基因表达产 物测定、血管内皮细胞研究
假三维等高图
三参数直方图
（四）流式细胞仪的多参数分析
多参数分析：当细胞标记了多色荧光，被激 发光激发后，得到的荧光信号和散射光信号可 根据需要进行组合分析。
《流式细胞术贝克曼》课件
贝克曼流式细胞仪的应用
免疫学研究
贝克曼流式细胞仪在免疫学研究 中广泛应用，可以用于检测免疫 细胞的表面标志物、功能活性以
及免疫细胞的分选和培养等。
血液学研究
贝克曼流式细胞仪可以用于血液 学研究，检测血细胞的表面标志 物、血型抗原等，以及进行血细
胞的分选和培养等。
肿瘤研究
贝克曼流式细胞仪可以用于肿瘤 研究，检测肿瘤细胞的表面标志 物、肿瘤抗原等，以及进行肿瘤
辐射安全
废弃物处理
正确操作仪器，避免对实验人员造成辐射 伤害。
按照规定处理实验废弃物，确保实验室环 境的安全和环保。
贝克曼流式细胞仪的特点
高通量
贝克曼流式细胞仪具有高通量的 特点，能够在短时间内处理大量 细胞样本，提高了实验效率和检
测速度。
高灵敏度
贝克曼流式细胞仪采用先进的光电 检测技术，能够检测到微弱的荧光 信号，具有高灵敏度，能够检测到 低浓度的细胞标记物。
多参数分析
贝克曼流式细胞仪可以同时检测多 个参数，包括细胞大小、颗粒性、 荧光信号等，从而对细胞进行多维 度的分析和分选。
贝克曼流式细胞仪的原理
流式细胞术原理
流式细胞术是一种在液流中快速检测和分选细胞的技术。通 过将单个细胞与荧光染料结合，利用激光束激发荧光，并通 过光电倍增管检测荧光信号，实现对细胞的快速分析和分选 。
贝克曼流式细胞仪的原理
贝克曼流式细胞仪是应用流式细胞术的仪器之一，其原理是 将待测细胞与荧光染料结合后，通过高压液流将细胞送入流 动室，在流动室内与激光束相遇，激发荧光信号，并通过光 电倍增管进行检测和记录。
用于检测精子细胞和卵 子细胞的活性与质量。
流式细胞术的发展历程
20世纪70年代
【精品】流式荧光免疫技术精品ppt课件
❖ 分析细胞受体 对细胞受体进行定量定性分析，可做单细胞测定， 也可从分析中剔除死亡细胞
❖ 分析肿瘤细胞的DNA、RNA含量 FCM在肿瘤学上的应用主要是利用DNA含量的测定 进行包括癌前病变及早期癌变的检出，指导化疗以 及预后评估等工作。
❖ 分析免疫细胞的功能 分离纯化的细胞群可用于多种细胞各功能的分析 例淋巴细胞和靶细胞共同培养后，可利用PI能渗透 到死细胞致核染色的特点，分析死亡靶细胞的比例， 了解淋巴细胞的细胞毒活性
数据处理系统：存储、显示、分析系统（计算机）
二.光信号的测定
❖ 散射光的测定 激光束上的低角度散射光被称为前
向散射光(FS)，主要反映细胞的大小；与激光束成 90度角收集的散射光信号称侧向散射光(SS)，主要
反映细胞的颗粒特性。
❖ 荧光 细胞亦可发出荧光(FL)
*最常用于单克隆抗体标记的三种荧光染料 FITC PE 藻红蛋白-得州红
❖ 免疫检测样品的制备 ❖ 细胞悬液的保存 ❖ 荧光染色 ❖ 细胞自发荧光 ❖ 质量控制
免疫检测样品的制备
❖ 外周血淋巴细胞样品的制备
常用淋巴细胞分离液分离外周血中单个核细胞
❖ 培养细胞的样品制备
悬浮生长—直接吹打 贴壁生长—蛋白消化酶+机械敲打+400目尼龙网过滤
❖ 新鲜组织细胞悬液的制备
机械法—剪碎法、网搓、研磨 酶处理法 –胰蛋白酶、胶原酶、胃蛋白酶 化学试剂处理法—EDTA 表面活性剂—破坏膜结构
什么是 FCM ？
流式细胞术：利用流式细胞仪对处于快 速流动的细胞或生物颗粒进行多参数、 快速的定量分析及分选的技术
激光技术+流体力学+光电测量技术+计 算机技术+细胞荧光化学技术+单克隆抗 体技术
流式细胞术免疫标记简介完整ppt课件
免疫标记技术
免疫标记技术（immunolabelling technique）:是指用荧光素、放射性同位 素、酶、发光剂或电子致密物质等作为 示踪剂，标记抗体或抗原进行的抗原抗 体反应。
流式细胞术检测蛋白质分子：免疫荧光 标记技术
“雪亮工程"是以区（县）、乡（镇） 、村（ 社区） 三级综 治中心 为指挥 平台、 以综治 信息化 为支撑 、以网 格化管 理为基 础、以 公共安 全视频 监控联 网应用 为重点 的“群 众性治 安防控 工程” 。
FACSCalibur流式细胞仪能够检测的荧 光（Fluorescence）信号
FL1 （第一荧光） -FITC(异硫氰酸荧光素） FL2 （第二荧光） -PE（藻红蛋白） FL3 （第三荧光） -PerCP, PeCy5等 PL4 （第四荧光） -APC（藻青蛋白）
双色直接染色
“雪亮工程"是以区（县）、乡（镇） 、村（ 社区） 三级综 治中心 为指挥 平台、 以综治 信息化 为支撑 、以网 格化管 理为基 础、以 公共安 全视频 监控联 网应用 为重点 的“群 众性治 安防控 工程” 。
正常外周血中通常存在的T细胞亚群
CD3+、CD4+、CD8-：T辅助/诱导细胞（Th/Ti），
占T细胞总数的60%~70%；
CD3+、CD4-、CD8+：T抑制/杀伤细胞（Ts/Tc） ，
20%~30%； CD3+ CD4+ CD8+ ： 1%~3%； CD3+ CD4- CD8-：1%~10%。
CD7+、CD1+、CD2+、CD3+、CD4+、CD8+、TCR+ （即CD4、CD8双阳性）
流式细胞术(免疫学检验课件)
Region设置 Gate设置
第四节 FCM的临床应用
一、淋巴细胞亚群分析
淋巴细胞是机体免疫系统中的一群重要细胞群， 是执行免疫功能和参与免疫调节的免疫活性细胞， 主要分为T细胞、B细胞和NK细胞3大类。
不同淋巴细胞表达的CD抗原都有独自的抗原特性， 在临床疾病发生过程中对各淋巴细胞的CD抗原进 行测定，对于判断机体免疫功能状态、了解免疫 相关疾病的发病机制具有十分重要的意义。
最常用的方法是酶消化法、机械法、化学处理法 和表面活性剂处理法等。
（四）石蜡包埋组织单细胞悬液制备
该制备方法的建立扩大了流式细胞术的应用范围， 有利于进行临床回顾性研究和利用。
常用的方法有二甲苯脱蜡法、组织清洁剂脱蜡法和 甲氧-双氧水处理法。
石蜡切片一般适宜厚度是40μm~50μm，脱蜡须彻底， 获取组织后，用酶进行消化处理，消化时间不宜过 长，以免细胞核被消化溶解，经过滤、漂洗后即可 获得单细胞悬液。
三、三参数直方图
三维坐标均为参数 （散射光或荧光）而 非细胞数
对复杂的细胞亚群观 察更为直观、准确， 但对其数据的统计分 析较难
四、多参数组合分析
FCM常常需要分析三个以上的参数，但软件技术 能够无法显示四维空间结构。
随着FCM多色荧光信号检测的发展，所得到的荧 光信号和散射光信号需根据需要进行组合分析以 获得所需的信息。
SSC信号的强弱与 细胞内颗粒结构的 质量成正比，用于 检测细胞内部结构 属性
前向散射光示意图 细胞大小
结构复杂程度
侧向散射光示意图
血
液
白
细
胞
粒细胞
散
点
单核细胞
图
淋巴细胞
荧光信号：由待检细胞上标记的特异性荧光染料 受激光激发后产生。
流式细胞术PPT课件
电荷式分选
lasers
–超声振动器(15-100kHz)
–液流充电系统
–高压偏转板
–收集装置(流式管、培养板)
断裂点(充电) 高压偏转板
29
四路分选原理
电荷式分选装置
30
分选指标
• 分选时间由三方面决定：进样速度、目标细胞所占比例、 需要收集的细胞数。
需要细胞数
目标细胞所占比例(%)
1
5
50
104
• Hoechst（343, 450）常见为Hoechst33342和Hoechst33258，非嵌入的 方式与DNA链上的A-T碱基对结合。能对活细胞染色，用于活细胞 DNA定量分析，如精子分选；还用于侧群细胞的分选。
• PY（派若宁 560, 573） RNA染料，能进入活细胞。
• AO（吖啶橙 509, 525） DNA、RNA染料，染色后DNA呈黄绿色荧光， RNA呈橙黄色荧光，可进行DNA/RNA双参数分析。
• 多色标记荧光素搭配原则：每个通道只能选择一种荧光素； 各个通道之间的荧光素可以随意搭配。
FACSCalibur常用四色搭配：FITC、PE、PerCP、APC。
33
B 根据抗原表达强弱合理选择 抗体
• 不同的荧光素强度有所不同；
CD5
• 高表达的抗原可用不太“亮” 的染料，更“亮”的荧光素分 配给表达低的抗原：
99%以上。 • 分选收获率是指被分选出的细胞与原来总细胞的百分比。 • 分选纯度和收获率永远是相互矛盾的，纯度提高，收获率
降低，反之亦然。
– 富集模式(enrich mode) – 纯化模式(purify mode) – 单细胞模式(single cell mode)
流式细胞术精品PPT课件
4
四、 流式细胞术的应用
1 细胞DNA含量检测：
细胞固定后用PI染色，因为PI特 异性结合于细胞DNA，荧光强度与PI 的结合量呈良好的线性关系，根据这 个原理，并通过专用的DNA分析软件， 可测出细胞的DNA含量。用于细胞周 期、细胞倍体以及凋亡的检测。
5
• 肿瘤诊断：
•
DNA异倍体的出现是癌变的一个重
• 一、 流式细胞术的概念 流式细胞术（FCM）就是对在的鞘
液包括下的细胞、粒子进行分析和分选 的技术，这种细胞或粒子是经过特异荧 光标记的。其特点是测量速度快，每秒 钟能测数千个乃至上万个细胞，且可进 行多参数测量，另一特点是在分析的同 时可把具有指定特征的细胞分离出来， 这就是分选技术。
1
二、流式细胞仪的工作原理
产生及发展，现在CD系统已有247种之多。
细胞用带有荧光的单克隆抗体标记后，用
流式细胞仪可对其进行检测分析，可分析
出荧光细胞的含量，也可分析出这种阳性
细胞的CD分子的相对含量。标记的方法一
般用直标法，也可用间标法。荧光探针多
为FITC、PE、PE-CY5、PerCP、CY5、
APC等。
9
淋巴细胞分类：
•
红细胞表面CD59缺失
18
5 细胞内蛋白的分析：
•
细胞破膜后将细胞内某一蛋白成分进行荧
光标记，用流式细胞仪进行测量分析，同表型
分析一样，可以测量出这种阳性细胞的数量和
这种蛋白的相对含量。并且，结合细胞表型分
析，进行多标记和多参数分析，可以检测出含
这种蛋白的细胞是属于哪一种表型的细胞。多
用间标法，荧光探针多为FITC。也可以与周期
27
•
流式细胞仪对一个样品提供的结果是否可
四、 流式细胞术的应用
1 细胞DNA含量检测：
细胞固定后用PI染色，因为PI特 异性结合于细胞DNA，荧光强度与PI 的结合量呈良好的线性关系，根据这 个原理，并通过专用的DNA分析软件， 可测出细胞的DNA含量。用于细胞周 期、细胞倍体以及凋亡的检测。
5
• 肿瘤诊断：
•
DNA异倍体的出现是癌变的一个重
• 一、 流式细胞术的概念 流式细胞术（FCM）就是对在的鞘
液包括下的细胞、粒子进行分析和分选 的技术，这种细胞或粒子是经过特异荧 光标记的。其特点是测量速度快，每秒 钟能测数千个乃至上万个细胞，且可进 行多参数测量，另一特点是在分析的同 时可把具有指定特征的细胞分离出来， 这就是分选技术。
1
二、流式细胞仪的工作原理
产生及发展，现在CD系统已有247种之多。
细胞用带有荧光的单克隆抗体标记后，用
流式细胞仪可对其进行检测分析，可分析
出荧光细胞的含量，也可分析出这种阳性
细胞的CD分子的相对含量。标记的方法一
般用直标法，也可用间标法。荧光探针多
为FITC、PE、PE-CY5、PerCP、CY5、
APC等。
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淋巴细胞分类：
•
红细胞表面CD59缺失
18
5 细胞内蛋白的分析：
•
细胞破膜后将细胞内某一蛋白成分进行荧
光标记，用流式细胞仪进行测量分析，同表型
分析一样，可以测量出这种阳性细胞的数量和
这种蛋白的相对含量。并且，结合细胞表型分
析，进行多标记和多参数分析，可以检测出含
这种蛋白的细胞是属于哪一种表型的细胞。多
用间标法，荧光探针多为FITC。也可以与周期
27
•
流式细胞仪对一个样品提供的结果是否可
流式细胞术简介及应用进展ppt课件
CBA反响微球探针复合体构造方式 图
(如可溶性血清蛋白分子的CBA 检测〕
;
Thanks for your attention!
;
;
三、流式细胞术运用的新进展
;
高速度：分析细胞数：1000个/s→60000个/s 高灵敏度：荧光分子数/细胞：3000→100个FITC； 高准确度：区分两个细胞：参数：相差5% →1%；
高精度：CV值：7% →< 1%; 多参数：荧光：1个 →12个参数； 高纯度：分选细胞：80-90% →99.9%; 其 它：荧光信号：线性检测→对数检测 光谱重叠：补偿修饰剔除联体细胞及碎片
电子程序化单细胞分选仪——Electronically programmable individual cell sorter, EPICS (Coulter公司〕
;
BD FACSCalibur型 FCM 〔单L，3F〕
;
Coulter EPICS XL/XL-MCL 〔单L，4F〕
;
BD FACSVantage SE 〔14F， four-way sorting〕
;
1、 Quantitative FCM (QFCM)
定量流式细胞术〔Quantitative FCM, QFCM〕 是用流式细胞仪对特定细胞外表抗原进展绝对 定量。其根本原理是采用某种规范物质获得一 条规范曲线或线性方程，然后获得待测抗原绝 对分子数。
;
2、cytometric bead array (CBA)
FCM是诸如生物学、生物技术、计算机科学、流膂力学、激光技术、高等 数学、临床医学、分子生物学、有机化学和生物物理学等到学科知识综 合运用的结晶。
现代流式细胞术，更是由于结合了单克隆抗体技术、定量细胞化学和定量 荧光细胞化学的运用，使其在生物学、临床医学、药物学等等众多研讨 领域的运用有了更加突飞猛进的开展
(如可溶性血清蛋白分子的CBA 检测〕
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Thanks for your attention!
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三、流式细胞术运用的新进展
;
高速度：分析细胞数：1000个/s→60000个/s 高灵敏度：荧光分子数/细胞：3000→100个FITC； 高准确度：区分两个细胞：参数：相差5% →1%；
高精度：CV值：7% →< 1%; 多参数：荧光：1个 →12个参数； 高纯度：分选细胞：80-90% →99.9%; 其 它：荧光信号：线性检测→对数检测 光谱重叠：补偿修饰剔除联体细胞及碎片
电子程序化单细胞分选仪——Electronically programmable individual cell sorter, EPICS (Coulter公司〕
;
BD FACSCalibur型 FCM 〔单L，3F〕
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Coulter EPICS XL/XL-MCL 〔单L，4F〕
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BD FACSVantage SE 〔14F， four-way sorting〕
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1、 Quantitative FCM (QFCM)
定量流式细胞术〔Quantitative FCM, QFCM〕 是用流式细胞仪对特定细胞外表抗原进展绝对 定量。其根本原理是采用某种规范物质获得一 条规范曲线或线性方程，然后获得待测抗原绝 对分子数。
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2、cytometric bead array (CBA)
FCM是诸如生物学、生物技术、计算机科学、流膂力学、激光技术、高等 数学、临床医学、分子生物学、有机化学和生物物理学等到学科知识综 合运用的结晶。
现代流式细胞术，更是由于结合了单克隆抗体技术、定量细胞化学和定量 荧光细胞化学的运用，使其在生物学、临床医学、药物学等等众多研讨 领域的运用有了更加突飞猛进的开展
流式细胞术ppt课件
可区分高FL细胞与低FL细胞。 一般的流式细胞仪装有一个激光光源（488nm），可
测出三个FL，即FL1、FL2、FL3，大型的流式细胞仪 装有三个激光光源（488nm、633nm和407nm），可测 出13个FL。
2、荧光信号
双色直接染色
二、荧光染料的选择
选择荧光染料要考虑: 1、流式细胞仪配置的激光可否激发该荧光染料； 2、流式细胞仪可否检测该荧光染料的发射波长； 3、使用多种荧光染料时，要考虑荧光染料之间的干扰。
二、荧光染料的选择
颜色补偿
➢荧光染料的发射波长范围一般宽于检测器检测到的波 长范围；检测范围之外的波长可能会进入相邻的检测器 被检测，从而造成荧光信号之间的干扰。流式细胞仪可 以通过“颜色补偿”校正这一干扰。 ➢ 单标管用于调补偿。
Fluorescein (FITC)
300 nm
400 nm
Excitation
500 nm
Wavelength
Emisson
600 nm
700 nm
400 nm
500 nm
600 nm
700 nm
Protein
Phycoerytherin (PE)
300 nm 400 nm
Excitation Emisson
500 nm
600 nm
700 nm
Protein
FITC和PE荧光光谱
直接染色
间接染色
样品制备过程中常见的问题及解决对策
常见问题 细胞密度低 非特异荧光
强
碎片多 细胞聚集
荧光弱
原因 细胞损失 抗体不纯、死细胞多
细胞死亡、机械损伤 消化不完全
抗体少、反应时间短
解决对策 增加离心时间、弃上清 选择纯度高的抗体、用同型 对照抗体或双标记排除非特
测出三个FL，即FL1、FL2、FL3，大型的流式细胞仪 装有三个激光光源（488nm、633nm和407nm），可测 出13个FL。
2、荧光信号
双色直接染色
二、荧光染料的选择
选择荧光染料要考虑: 1、流式细胞仪配置的激光可否激发该荧光染料； 2、流式细胞仪可否检测该荧光染料的发射波长； 3、使用多种荧光染料时，要考虑荧光染料之间的干扰。
二、荧光染料的选择
颜色补偿
➢荧光染料的发射波长范围一般宽于检测器检测到的波 长范围；检测范围之外的波长可能会进入相邻的检测器 被检测，从而造成荧光信号之间的干扰。流式细胞仪可 以通过“颜色补偿”校正这一干扰。 ➢ 单标管用于调补偿。
Fluorescein (FITC)
300 nm
400 nm
Excitation
500 nm
Wavelength
Emisson
600 nm
700 nm
400 nm
500 nm
600 nm
700 nm
Protein
Phycoerytherin (PE)
300 nm 400 nm
Excitation Emisson
500 nm
600 nm
700 nm
Protein
FITC和PE荧光光谱
直接染色
间接染色
样品制备过程中常见的问题及解决对策
常见问题 细胞密度低 非特异荧光
强
碎片多 细胞聚集
荧光弱
原因 细胞损失 抗体不纯、死细胞多
细胞死亡、机械损伤 消化不完全
抗体少、反应时间短
解决对策 增加离心时间、弃上清 选择纯度高的抗体、用同型 对照抗体或双标记排除非特
流式细胞术免疫标记简介34页PPT
55、
流式细胞术免疫标记简介
56、极端的法规，就是极端的不公。 ——西 塞罗 57、法律一旦成为人们的需要，人们 就不再 配享受 自由了 。—— 毕达哥 拉斯 58、法律规定的惩罚不是为了私人的 利益， 而是为 了公共 的利益 ；一部 分靠有 害的强 制，一 部分靠 榜样的 效力。 ——格 老秀斯 59、假如没有法律他们会更快乐的话 ，那么 法律作 为一件 无用之 物自己 就会消 灭。— —洛克
60、人民的幸福是至高无个的法。— —西塞 罗
谢谢！
51、 天 下 之 事 常成 于困约 ，而败 于奢靡 。——陆 游 52、 生 命 不 等 于是呼 吸，生 命是活 动。——卢 梭
53、 伟 大 的 事 业，需 要决心 ，能力 ，组织 和责任 感。 ——易 卜 生 54、 唯 书 籍 不 朽。——乔 特
流式细胞术免疫标记简介
56、极端的法规，就是极端的不公。 ——西 塞罗 57、法律一旦成为人们的需要，人们 就不再 配享受 自由了 。—— 毕达哥 拉斯 58、法律规定的惩罚不是为了私人的 利益， 而是为 了公共 的利益 ；一部 分靠有 害的强 制，一 部分靠 榜样的 效力。 ——格 老秀斯 59、假如没有法律他们会更快乐的话 ，那么 法律作 为一件 无用之 物自己 就会消 灭。— —洛克
60、人民的幸福是至高无个的法。— —西塞 罗
谢谢！
51、 天 下 之 事 常成 于困约 ，而败 于奢靡 。——陆 游 52、 生 命 不 等 于是呼 吸，生 命是活 动。——卢 梭
53、 伟 大 的 事 业，需 要决心 ，能力 ，组织 和责任 感。 ——易 卜 生 54、 唯 书 籍 不 朽。——乔 特
流式细胞术免疫标记简介(完整)
T细胞标志
T细胞及其亚群 T祖细胞（pro-T）的表型为CD34+、TdT+、CD10+、
CD7+ 未成熟T细胞标志CD3、CD4和CD8。 在T细胞发育过程中，CD7是最早出现的T细胞标志，
且贯穿表达在整个T细胞分化发育过程中。 胸腺细胞要分化发育为有功能的成熟T细胞，细胞
表面标志需经历一定的变化过程。
如与CFSE 进行不同细胞亚群增殖分析。
流式细胞术表面分子免疫标记操作举例
淋巴细胞亚群检测操作程序
一、实验原理：
人的淋巴细胞根据其生物功能和细胞表面抗原的表达可分为 三大类：T淋巴细胞、B淋巴细胞和NK自然杀伤细胞。T淋 巴细胞表达CD3；B淋巴细胞表达CD19；NK自然杀伤细胞 表达CD56或CD16，并且不表达CD3。利用各种单克隆抗体 与淋巴细胞表面抗原结合，再配多色荧光染料，即可以把 淋巴细胞区分为各种亚型。进面得到各亚群的比例。
（6）浆细胞（plasma cell）：激活B细胞进 一步分化成为产生抗体的浆细胞，这时获得 PC-1、PCA-1和CD138浆细胞特异抗原，CD85表 达增加，CD38抗原再出现。而SIg和上述B抗原 消失。CD79仍可存在于胞质中。
B细胞上的CD抗原分为：
①B细胞限制性（特异性）抗原： CD19、CD20、 CD21、 CD22、CD77 和CD79， 它们的表达只限 于B细胞上，在鉴别细胞系上是十分重要的标志。
（5）活化B细胞（activated B cell）：成熟 B细胞被抗原或丝裂原刺激后，成为活化B细胞， 继之增生和分化。在此过程伴随表达B细胞激 活抗原CD23、CD77、CD80、CD86和其他激活相 关 抗 原 如 CD25 、 CD26 、 CD30 、 CD69 、 CD70 、 CD71、CD38等。膜结合型Ig逐渐减少，分泌型 Ig逐渐增加。
相关主题
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标记某种细胞。如Treg细胞公认的标志为 CD4+CD25+FoxP3+. 表面分子标记可以与胞内分子标记相结合； 免疫荧光标记也可以与其它的标记方法相结合：如 与CFSE 进行不同细胞亚群增殖分析。
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流式细胞术表面分子免疫标记操作举例
淋巴细胞亚群检测操作程序
一、实验原理：
人的淋巴细胞根据其生物功能和细胞表面抗原的表达可分为 三大类：T淋巴细胞、B淋巴细胞和NK自然杀伤细胞。T淋 巴细胞表达CD3；B淋巴细胞表达CD19；NK自然杀伤细胞 表达CD56或CD16，并且不表达CD3。利用各种单克隆抗体 与淋巴细胞表面抗原结合，再配多色荧光染料，即可以把 淋巴细胞区分为各种亚型。进面得到各亚群的比例。
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（5）活化B细胞（activated B cell）：成熟 B细胞被抗原或丝裂原刺激后，成为活化B细胞， 继之增生和分化。在此过程伴随表达B细胞激 活抗原CD23、CD77、CD80、CD86和其他激活相 关 抗 原 如 CD25 、 CD26 、 CD30 、 CD69 、 CD70 、 CD71、CD38等。膜结合型Ig逐渐减少，分泌型 Ig逐渐增加。
当血小板被激活时，血小板中颗粒内容物释放，整合 到活化的血小板质膜内，成为一些激活抗原，如CD62 （P-选择素）、CD63及CD107a和CD107b。
红细胞系 血型糖蛋白A、H。
24
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流式细胞术免疫荧光标记抗体的选择
有特异性标志：选择一种即可，如CD3标记总T细胞； 没有明显的特异性标志：可以采用不同抗体组合，
表面标志需经历一定的变化过程。
9
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CD7+、CD2-、CD3-、CD4-、CD8-、TCR-
CD7+、CD2+、CD3+、CD4-、CD8-、TCR（即CD4、CD8双阴性）
CD7+、CD1+、CD2+、CD3+、CD4+、CD8+、TCR+ （即CD4、CD8双阳性）
CD7+、CD2+、 CD3+、CD4+、 CD8-、TCR+
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髓系细胞标记
包括CD11b、CD13、CD14、CD15、CD33、 CD36、CD45、CD68、CD41、CD42、 CD61、CD63和CD117等。
这些免疫标记种类繁杂，缺乏特异性和敏 感性（与淋巴细胞标记抗体相比）。
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3.髓系标记 从髓系祖细胞→终末分化的成熟细 胞（粒细胞、单核细胞、血小板和红细胞）间 各阶段细胞特征性标志还不十分清楚。
抗原 细胞内细胞因子 细胞增殖 细胞内钙离子浓度
3
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免疫标记技术
免疫标记技术（immunolabelling technique）:是 指用荧光素、放射性同位素、酶、发光剂或电 子致密物质等作为示踪剂，标记抗体或抗原进 行的抗原抗体反应。
流式细胞术检测蛋白质分子：免疫荧光标记技 术
4
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CD21、 CD22、CD77 和CD79， 它们的表达只限 于B细胞上，在鉴别细胞系上是十分重要的标志。 ②B细胞相关性抗原： CD5、CD9、CD10、CD23、 CD24 、 CD37 、 CD40 、 CD53 、 CD72 、 CD73 、 CD74 、 CDw75 、 CDw76 、 CDw78 、 CD81 、 CD82 、 CD83 、 CD84、CD85、CD86、CD124和CD139。 B细胞表面的受体SIg，是B细胞特异性识别抗原 的受体，也是B细胞重要的特征标志。
CD7+、CD2+、 CD3+、CD4-、 CD8+、TCR+
进入外周淋巴器官和血液，执行免疫功能
10
.
正常外周血中通常存在的T细胞亚群
CD3+、CD4+、CD8-：T辅助/诱导细胞（Th/Ti），
占T细胞总数的60%~70%；
CD3+、CD4-、CD8+：T抑制/杀伤细胞（Ts/Tc） ，
20%~30%； CD3+ CD4+ CD8+ ： 1%~3%； CD3+ CD4- CD8-：1%~10%。
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流式细胞术系列讲座之——免疫标记
流式细胞术免疫标记应用简介
1
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上次流式细胞术讲座内容（概述）
流式细胞术的一般介绍 流式细胞术在临床检测和科研中的应用
2
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流式细胞仪可检测的细胞参数
细胞结构 细胞大小 细胞颗粒性程度 细胞表面面积 核浆比例 DNA含量与细胞周
期 RNA含量
细胞功能 细胞表面蛋白抗原 细胞胞浆内蛋白性
检测细胞表面蛋白抗原 检测细胞胞浆内蛋白性抗原 检测细胞内细胞因子 优势：在同一细胞上同时检测
多种标志
6
血液系统各型细胞免疫. 标志
7
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造祖/干细胞
CD34+抗原在早期造血祖细胞内呈高水平表达，随着 细胞成熟其表达呈进化性下降，继而消失。
CD38抗原是造血干细胞向多系定向分化的标志之一， 并随一定的分化过程表达上调
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CD19、CD20、CD21、CD22和CD24都是B 细胞白血病和淋巴瘤最常用的标记抗体。
对中国人而言，CD19是特异性和敏感性最 高的。
CD19是一种早期的、谱系特异的泛B细胞 表面抗原，从最早期B细胞前体细胞阶段即 表达，持续存在直至B细胞终末阶段
外周血T细胞、单核细胞、粒细胞和血小板 表面不表达CD19。
（1）B祖细胞（pro-B）：此期最早表达的B细胞 特异性抗原是CD19，同时表达CD34、细胞核TdT、 HLA-DR、CD40、CyCD22。
（2）前B细胞（pre-B）：CD34和TdT消失，出现 CyCD79 、 CD10 、 CD20 、 CD9 、 CDw78 、 CD74 ， cμ+ （胞浆IgM重链）。
（2）以粒细胞为主，但也存在于单核细胞的抗原有： CD15和CD65。CD65是特异性髓系抗原，强表达在成熟 粒细胞，弱表达在单核细胞上。
（3）基本表达在粒细胞上的抗原有：CD16b和CD66。
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（4）以单核细胞为主，但也表达在粒细胞的抗 原有：CD14和CD33。CD14主要强表达在单核巨噬细胞，弱表达在粒细胞上。CD33抗原分布 只 限 于 造 血 系 统 内 ， 表 达 在 髓 系 祖 细 胞 CFUGEMM、CFU-GM、CFU-G、CFU-M以及相应的白血 病细胞上。 （5）基本只表达在单核细胞上的抗原有：CD16、 CD64、CD68、CD91、CDw136和CD65。CD68是目 前发现可靠的检测造血系统内单核-巨噬细胞 系统的特异标志。
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二、主要试剂： MultiTEST IMK Kit(美国BD Biosciences公司；CAT:340503)， 其中包括：1、CD3-FITC/CD8-PE/CD45-PreCP/CD4-APC 2、CD3-FITC/CD16+56-PE/CD45-PreCP/CD19-APC 3、FACSLysing Solution 三、实验操作： 1、标本采集：使用EDTA-K2抗凝真空采血管，抽取静脉血2ml。 2、染色和固定细胞： • 标本管编号A，取两只流式专用管A1、A2。 • A1管加入CD3-FITC/CD16+56-PE/CD45-PreCP/CD19-APC 20uL； • A2管加入CD3-FITC/CD8-PE/CD45-PreCP/CD4-APC 20Ul。 • A1、A2管中分别再加入全血100Ul，混均。 • 置室温，避光孵育15min。 • 加入FACSLysing溶血液2.0ml，置室温，避光孵育10min。 • 300g离心5min，弃上清液。 • PBS洗涤细胞两次，300g离心5min，弃上清液。 • 1%多聚甲醛0.5mL。 3、上机检测；分析结果；打印实验报告。
最近发现CD90（Thy-1）是比CD34更早的干、祖细胞 标志
结合多种分化抗原的表达可以作为造血细胞不同发育 阶段的标志。
如CD34+、CD33+细胞群为多能干细胞向髓系定向的标 志；
CD34+、CD19+多为多能干细胞向B系定向的祖细胞。 CD34+、TdT+、CD10+、CD7+则被认为是向T系定向
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（ 6 ） 造 血 干 、 祖 细 胞 抗 原 有 ： CD34 和 CD90 。 CD34 除 表 达 在 早 期 造 血 干 、 祖 细 胞外，还表达在约40%的AML和60%的ALL 上 （7）其他髓系相关抗原：这些抗原主要 存在于其他系细胞上，但在某些髓系细 胞上也有表达，如：CD4、CD7、CD9、 CD10、CD11b、CD11c、CD31、CD36、 CD38等。
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巨核细胞系
在 巨 核 细 胞 系 发 育 过 程 中 依 次 出 现 PPO 、 CD41a （ Ⅱb/Ⅲa ） 、 CD41b （ Ⅱb ） 和 CD61 （ Ⅲa ） 、 CD42 （Ⅰb）。还可表达CD36（强）。
正常情况下血小板处于静止状态。目前研制出的抗血 小板单抗如CD9、CDw17、CD31、CD36、CD41a、CD41b、 CD42a、 CD42b、CD61，主要都针对静止的血小板。
（6）浆细胞（plasma cell）：激活B细胞进 一步分化成为产生抗体的浆细胞，这时获得 PC-1、PCA-1和CD138浆细胞特异抗原，CD85表 达增加，CD38抗原再出现。而SIg和上述B抗原 消失。CD79仍可存在于胞质中。
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B细胞上的CD抗原分为： ①B细胞限制性（特异性）抗原： CD19、CD20、
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流式细胞术表面分子免疫标记操作举例
淋巴细胞亚群检测操作程序
一、实验原理：
人的淋巴细胞根据其生物功能和细胞表面抗原的表达可分为 三大类：T淋巴细胞、B淋巴细胞和NK自然杀伤细胞。T淋 巴细胞表达CD3；B淋巴细胞表达CD19；NK自然杀伤细胞 表达CD56或CD16，并且不表达CD3。利用各种单克隆抗体 与淋巴细胞表面抗原结合，再配多色荧光染料，即可以把 淋巴细胞区分为各种亚型。进面得到各亚群的比例。
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（5）活化B细胞（activated B cell）：成熟 B细胞被抗原或丝裂原刺激后，成为活化B细胞， 继之增生和分化。在此过程伴随表达B细胞激 活抗原CD23、CD77、CD80、CD86和其他激活相 关 抗 原 如 CD25 、 CD26 、 CD30 、 CD69 、 CD70 、 CD71、CD38等。膜结合型Ig逐渐减少，分泌型 Ig逐渐增加。
当血小板被激活时，血小板中颗粒内容物释放，整合 到活化的血小板质膜内，成为一些激活抗原，如CD62 （P-选择素）、CD63及CD107a和CD107b。
红细胞系 血型糖蛋白A、H。
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流式细胞术免疫荧光标记抗体的选择
有特异性标志：选择一种即可，如CD3标记总T细胞； 没有明显的特异性标志：可以采用不同抗体组合，
表面标志需经历一定的变化过程。
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CD7+、CD2-、CD3-、CD4-、CD8-、TCR-
CD7+、CD2+、CD3+、CD4-、CD8-、TCR（即CD4、CD8双阴性）
CD7+、CD1+、CD2+、CD3+、CD4+、CD8+、TCR+ （即CD4、CD8双阳性）
CD7+、CD2+、 CD3+、CD4+、 CD8-、TCR+
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髓系细胞标记
包括CD11b、CD13、CD14、CD15、CD33、 CD36、CD45、CD68、CD41、CD42、 CD61、CD63和CD117等。
这些免疫标记种类繁杂，缺乏特异性和敏 感性（与淋巴细胞标记抗体相比）。
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3.髓系标记 从髓系祖细胞→终末分化的成熟细 胞（粒细胞、单核细胞、血小板和红细胞）间 各阶段细胞特征性标志还不十分清楚。
抗原 细胞内细胞因子 细胞增殖 细胞内钙离子浓度
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免疫标记技术
免疫标记技术（immunolabelling technique）:是 指用荧光素、放射性同位素、酶、发光剂或电 子致密物质等作为示踪剂，标记抗体或抗原进 行的抗原抗体反应。
流式细胞术检测蛋白质分子：免疫荧光标记技 术
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CD21、 CD22、CD77 和CD79， 它们的表达只限 于B细胞上，在鉴别细胞系上是十分重要的标志。 ②B细胞相关性抗原： CD5、CD9、CD10、CD23、 CD24 、 CD37 、 CD40 、 CD53 、 CD72 、 CD73 、 CD74 、 CDw75 、 CDw76 、 CDw78 、 CD81 、 CD82 、 CD83 、 CD84、CD85、CD86、CD124和CD139。 B细胞表面的受体SIg，是B细胞特异性识别抗原 的受体，也是B细胞重要的特征标志。
CD7+、CD2+、 CD3+、CD4-、 CD8+、TCR+
进入外周淋巴器官和血液，执行免疫功能
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正常外周血中通常存在的T细胞亚群
CD3+、CD4+、CD8-：T辅助/诱导细胞（Th/Ti），
占T细胞总数的60%~70%；
CD3+、CD4-、CD8+：T抑制/杀伤细胞（Ts/Tc） ，
20%~30%； CD3+ CD4+ CD8+ ： 1%~3%； CD3+ CD4- CD8-：1%~10%。
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流式细胞术系列讲座之——免疫标记
流式细胞术免疫标记应用简介
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上次流式细胞术讲座内容（概述）
流式细胞术的一般介绍 流式细胞术在临床检测和科研中的应用
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流式细胞仪可检测的细胞参数
细胞结构 细胞大小 细胞颗粒性程度 细胞表面面积 核浆比例 DNA含量与细胞周
期 RNA含量
细胞功能 细胞表面蛋白抗原 细胞胞浆内蛋白性
检测细胞表面蛋白抗原 检测细胞胞浆内蛋白性抗原 检测细胞内细胞因子 优势：在同一细胞上同时检测
多种标志
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血液系统各型细胞免疫. 标志
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造祖/干细胞
CD34+抗原在早期造血祖细胞内呈高水平表达，随着 细胞成熟其表达呈进化性下降，继而消失。
CD38抗原是造血干细胞向多系定向分化的标志之一， 并随一定的分化过程表达上调
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CD19、CD20、CD21、CD22和CD24都是B 细胞白血病和淋巴瘤最常用的标记抗体。
对中国人而言，CD19是特异性和敏感性最 高的。
CD19是一种早期的、谱系特异的泛B细胞 表面抗原，从最早期B细胞前体细胞阶段即 表达，持续存在直至B细胞终末阶段
外周血T细胞、单核细胞、粒细胞和血小板 表面不表达CD19。
（1）B祖细胞（pro-B）：此期最早表达的B细胞 特异性抗原是CD19，同时表达CD34、细胞核TdT、 HLA-DR、CD40、CyCD22。
（2）前B细胞（pre-B）：CD34和TdT消失，出现 CyCD79 、 CD10 、 CD20 、 CD9 、 CDw78 、 CD74 ， cμ+ （胞浆IgM重链）。
（2）以粒细胞为主，但也存在于单核细胞的抗原有： CD15和CD65。CD65是特异性髓系抗原，强表达在成熟 粒细胞，弱表达在单核细胞上。
（3）基本表达在粒细胞上的抗原有：CD16b和CD66。
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（4）以单核细胞为主，但也表达在粒细胞的抗 原有：CD14和CD33。CD14主要强表达在单核巨噬细胞，弱表达在粒细胞上。CD33抗原分布 只 限 于 造 血 系 统 内 ， 表 达 在 髓 系 祖 细 胞 CFUGEMM、CFU-GM、CFU-G、CFU-M以及相应的白血 病细胞上。 （5）基本只表达在单核细胞上的抗原有：CD16、 CD64、CD68、CD91、CDw136和CD65。CD68是目 前发现可靠的检测造血系统内单核-巨噬细胞 系统的特异标志。
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二、主要试剂： MultiTEST IMK Kit(美国BD Biosciences公司；CAT:340503)， 其中包括：1、CD3-FITC/CD8-PE/CD45-PreCP/CD4-APC 2、CD3-FITC/CD16+56-PE/CD45-PreCP/CD19-APC 3、FACSLysing Solution 三、实验操作： 1、标本采集：使用EDTA-K2抗凝真空采血管，抽取静脉血2ml。 2、染色和固定细胞： • 标本管编号A，取两只流式专用管A1、A2。 • A1管加入CD3-FITC/CD16+56-PE/CD45-PreCP/CD19-APC 20uL； • A2管加入CD3-FITC/CD8-PE/CD45-PreCP/CD4-APC 20Ul。 • A1、A2管中分别再加入全血100Ul，混均。 • 置室温，避光孵育15min。 • 加入FACSLysing溶血液2.0ml，置室温，避光孵育10min。 • 300g离心5min，弃上清液。 • PBS洗涤细胞两次，300g离心5min，弃上清液。 • 1%多聚甲醛0.5mL。 3、上机检测；分析结果；打印实验报告。
最近发现CD90（Thy-1）是比CD34更早的干、祖细胞 标志
结合多种分化抗原的表达可以作为造血细胞不同发育 阶段的标志。
如CD34+、CD33+细胞群为多能干细胞向髓系定向的标 志；
CD34+、CD19+多为多能干细胞向B系定向的祖细胞。 CD34+、TdT+、CD10+、CD7+则被认为是向T系定向
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（ 6 ） 造 血 干 、 祖 细 胞 抗 原 有 ： CD34 和 CD90 。 CD34 除 表 达 在 早 期 造 血 干 、 祖 细 胞外，还表达在约40%的AML和60%的ALL 上 （7）其他髓系相关抗原：这些抗原主要 存在于其他系细胞上，但在某些髓系细 胞上也有表达，如：CD4、CD7、CD9、 CD10、CD11b、CD11c、CD31、CD36、 CD38等。
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巨核细胞系
在 巨 核 细 胞 系 发 育 过 程 中 依 次 出 现 PPO 、 CD41a （ Ⅱb/Ⅲa ） 、 CD41b （ Ⅱb ） 和 CD61 （ Ⅲa ） 、 CD42 （Ⅰb）。还可表达CD36（强）。
正常情况下血小板处于静止状态。目前研制出的抗血 小板单抗如CD9、CDw17、CD31、CD36、CD41a、CD41b、 CD42a、 CD42b、CD61，主要都针对静止的血小板。
（6）浆细胞（plasma cell）：激活B细胞进 一步分化成为产生抗体的浆细胞，这时获得 PC-1、PCA-1和CD138浆细胞特异抗原，CD85表 达增加，CD38抗原再出现。而SIg和上述B抗原 消失。CD79仍可存在于胞质中。
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B细胞上的CD抗原分为： ①B细胞限制性（特异性）抗原： CD19、CD20、
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