流式细胞仪PPT课件

1965年，Kamentsky用紫外吸收和可见光散射 两个参数同时测量未染色细胞，给出细胞中 核酸的含量和细胞大小。奠定了多参数流式 细胞测量的基础。
罗敏
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流 式 细 胞 仪--发展历史
1967年，Van Dilla和Los Alamos采用了层流流 动室和氩激光器，开发出了液流束、照明光 轴、检测系统三者相互垂直的流式细胞仪。 这成为目前各种流式细胞仪的基础。
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流 式 细 胞 仪--流式细胞术
流式细胞术（flow cytometry，FCM）
流式细胞术是应用流式细胞仪对悬浮液中的细 胞或细胞器进行快速测量和多参数检测的细胞 分析技术。同时依赖测量到的参数还可以用物 理的方法将一个群体中的细胞亚群分选出来， 即流式细胞分选术（cell sorting）。
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流 式 细 胞 仪--发展历史
20世纪80年代，流式细胞仪的数据采集、存 储、显示、分析日趋完善，随着样品制备方 法的增加，新的荧光染料和细胞标记物的出 现，使流式细胞仪的应用范围逐渐扩大。
20世纪90年代，与之配套的标本制备仪和自 动进样器的问世，以及适合临床应用的单克 隆抗体的增加，使流式细胞仪逐渐从科研单 位进入医院的中心实验室和检验科，成为现 代化的临床检验仪器的一部分。
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流式细胞仪--分类
流式细胞仪的分类
根据功能不同，可分为临床型和综合型（科研型）。 根据有无细胞分选功能，可分为流式细胞分析分选仪和 流式细胞分析仪。 根据结构不同，可分为一般流式细胞仪（零分辨率流式 细胞仪）和狭缝扫描流式细胞仪（高分辨率流式细胞 仪）。前者的激光光斑为椭圆形，光斑直径大于被检细 胞体积。后者激光光束为一条线状扁平光斑，直径在 3~5um。
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流 式 细 胞 仪--学习内容
流式细胞仪的基本原理 流式细胞仪的基本结构 流式细胞仪的性能指标 流式细胞仪的使用 流式细胞仪的应用 流式细胞仪实例
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I 流式细胞仪的基本原理
基本原理：
将悬浮分散的单细胞悬液，经特异性荧光染料染色 后，放 入样品管。
在气体压力的作用下，悬浮在样品管中的单细胞悬液形成 样品流垂直进入流式细胞仪的流动室，流动室充满鞘液， 在鞘液的约束下，细胞排列成单列由流动室的喷嘴喷出， 成为细胞液柱，
含量等理化指标。
示意图
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I 流式细胞仪的基本原理
细胞分选原理：
在压电晶体上加上频率为30kHz的信号，使之产生同频率的 机械振动，流动室也随之振动，这样通过测量区的液柱断 裂成一连串均匀的液滴。
在细胞形成液滴以前，各类细胞的特性已在测量区被测定 并储存。如果其特性与要分选的细胞相同时，仪器就在这 类细胞形成液滴时给该液滴充与指定的电荷，这样，当被 选定的细胞形成液滴时就带有特定的电荷，未被选定的细 胞形成的细胞液滴及不含细胞的空白液滴不被充电，也就 不带电荷。
流式细胞术综合应用了激光技术、流体力学、 细胞生物化学技术、荧光标记技术、单克隆抗 体技术、分子生物学技术、计算机技术及临床 医学等多门技术。
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流 式 细 胞 仪--发展历史
流式细胞仪的发展历史 1934年，Moldavan使悬浮的红细胞从一个毛 细玻璃管中流过，每个通过的细胞可被一个 光电装置记录下来。这就是流式细胞仪的雏 形。
液柱与水平方向的入射激光束垂直相交，相交点称为测量 区。通过测量区的细胞受激光照射后发出荧光，同时产生 光散射。这些信号分别被成90℃角方向放置的光电倍增荧 光检测器和前向角放置的光电二极管检测器接收，经过转 换器转换为电子信号。
电子信号经模/数转换输入计算机。计算机通过相应的软件
储存、计算、分析，就可以得到细胞的大小和活性、核酸
FCM与其他细胞分析技术相比，有如下特点：
高速度：每秒可检测1 000~5 000个细胞。 高灵敏度：每个细胞只要带有1 000~3 000个荧光分子就 能检出，两个细胞之间有5%的差别就可区分出来，光散 射的灵敏度为0.3um。 高精度：在细胞悬液中测量细胞，比其他分析技术的变 异系数更小，分辨率高。 高纯度：分选细胞的纯度可大于99%以上。 多参数：可同时定量检测单个细胞的DNA等多个参数。 在适当的条件，可对活细胞进行无害性分析和分选。
1969年，Fulwyler利用静电墨水喷射液滴偏转 技术，建立了流式细胞分选术。 Ehrlich和Wheeless利用飞点扫描技术和缝扫描 技术使零分辨率的流式细胞仪变成了低分辨 率的流式细胞仪。
史
20世纪70年代，随着Kohler和Milstein成功提 出了单克隆抗体技术和荧光标记技术，为特 异研究和分析细胞奠定了良好的基础。 1973年，美国BD公司和美国斯坦福大学合作， 研制开发并生产了世界上第一台商用流式细 胞仪FACS I。
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流 式 细 胞 仪--发展历史
目前，流式细胞仪同时朝着更加专业化和更加 普及化的两个不同的方向发展。 更加专业化是指仪器更精密、更灵敏地进行更 多参数的分析和更快、更纯地进行细胞分选。 更加普及化是指仪器更易于使用，使之成为实 验室里更常用的仪器。
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流式细胞仪--特点
带有电荷的液滴向下落入偏转板间的静电场时，依据所带 电荷符号向左或向右偏转，落入指定的收集器内，不带电 荷的液滴不发生偏转，垂直落入废液槽中排出，从而实现 细胞的分类。
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I 流式细胞仪的基本原理
荧光染色原理
免疫荧光染色：细胞膜上或细胞内的抗原分子与相应的荧 光素标记McAb作用一定时间后形成带有荧光素的抗原抗 体复合物，经激光激发后发出特定的荧光，其荧光强度与 被测定抗原分子含量呈比例关系，由此可求得被测细胞与 标记McAb相对应抗原的表达量和阳性细胞百分比。常用 的荧光染料有异硫氰酸荧光素（FITC）、藻红蛋白 （PE）、别藻青蛋白（APC）和Perdinin叶绿素（PerCP） 等，经488nm激光激发后其发射荧光光谱有差别，因而可 将其用于标记不同的McAb进行单色或多色免疫荧光染色。 目前，流式细胞术有单色、双色、三色、四色、五色荧光 分析，对细胞的分析更加精密、深入。