流式细胞仪技术ppt课件
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7
2. 液流系统
8
激光波长:
3.
488nm,
流
635nm
式
激光聚焦
细
胞
仪
工
作
原
流动室
理
9
提要
1 流式细胞仪使用的基本知识 2 流式细胞仪检测的生物学意义 3 流式细胞仪检测在临床诊断的应用
10
1 流式细胞仪使用的基本知识
前向散射光(FSC)与侧向散射光(SSC)的含义 荧光素的选择 检测通道的确定 自发荧光的产生
常用荧光染料(488nm,633nm激发)
Fluorescein Isothiocyanate (FITC) 异硫氰酸荧光素
Phycoerythrin (PE) 藻红素
Allophycocyanin (APC) 异藻蓝蛋白
Peridinin-Chlorophyll Protein (PerCP) 多甲藻黄素-叶绿素蛋白
到广泛的应用。
3
FCM基本结构
1.激光, 光路系统及光电倍增管 (探测器)
2.液流系统 3.计算机处理系统
4
FCM结构图
5
1. 激光, 光路系统及光电倍增管(探测器)原理示意图
6
光学系统 FCM的光学系统是由若干组透镜、滤光片、小孔组成，它 们分别将不同波长的荧光信号送入到不同的电子探测器。
流式细胞术
Flow Cytometry（FCM）
1
概述
流式细胞技术的发展
1930s~1950s:开始出现自动细胞分析技术（细胞的
计数，光电仪记录流过一根毛细管的细胞,结合了荧光素的 抗体去标记细胞内的特定蛋白，应用分层鞘流原理，成功 的设计红细胞光学自动数器。）
1960s晚期发展：（荧光检测细胞计 ，细胞分选器检测细
PE(RD1)
488
PerCP
488
APC
633
PI
488
ECD
488
PeCy5
488
发射波长(nm) 用途
525
免疫荧光
575
免疫荧光
670
免疫荧光
670
免疫荧光
620
DNA染色
620
免疫荧光
675
免疫荧光
颜色
绿色 橙色 红色 红色 橙红 橙红 红色
17
检测通道的确定
通道 FL1 FL2 FL3 FL4 FL2 - Area FL2 - Width
色彩补偿(Color Compensation):利用 电子或数学方法从一个信号减少另外一 个信号成分的技术，典型例子是校对一 个波长区域的荧光信号在垂直轴的第二 荧光的重叠。
24
25
26
光谱重叠的校正的示意图
27
两种发射荧光重叠的部分利用荧光(色彩)补偿调节来消除。 色彩补偿(Color Compensation):利用电子或数学方法从一个信号减少另外一个 信号成分的技术，是校对一个波长区域的荧光信号在垂直轴的第二荧光的重叠。
19
消除非特异性结合FcR阻断
对于小鼠细胞需要用于 FcR阻断剂(纯化的抗 FcII/III受体抗体)减少 非特异性荧光染色；
对于人和兔细胞可以应 用纯化同种的Ig或血清 预先阻断Fc受体
20
对照的设置
细胞固定和膜穿透后，应用同一克 隆的无荧光素结合抗体处理，能够 区分细胞因子特异和非特异染色
消除非特异性结合-FcR阻断
对照的设置
多色荧光补偿的调节 设门的意义
样品处理的要求
11
前向 散射 光
(FSC) 与侧 向散 射光
(SSC) 的含 义
FSC和SSC的原理
12
前向散射光
13
侧向散射光
14
血细胞双参数点图
15
荧光素的选择
荧光素的选择： 荧光强度 FITC<PE<APC 依次增加；弱 信号采用PE或 APC，强信号 采用FITC
发射波长 530/30 585/42 650 661/16
荧光颜色 绿色 橙色 橙红 红色
18
自发荧光的产生
末染色的细胞受到光照射后所发出的荧光称自 发荧光。用流式细胞计测定细胞的特异性荧光染料 的荧光时，这种自发荧光对所欲测定的特异性荧光 是一种本底信号，自发荧光在多种情况下都会干扰 特异性荧光信号，尤其是对低水平结合的荧光抗体 它能减低染色的和未染色的细胞间的区别，使我们 难以确定细胞中荧光信号的水平。自发荧光的强弱 与细胞的大小、细胞的类型、激发光的波长、发射 光的检测范围等都有关系。产生自发荧光的分子可 能是正常细胞的组成成分如核黄素、细胞色素等。
Tandem Dyes PE-Texas Red (ECD) PE-Cy5 (PC5) PE-Cy5.5 (PC5.5) (futures) PE-Cy7 (PC7) (futures)
Propidium iodide（PI ） 碘化丙碇
16
常用荧光染料的特性
荧光染料 激发波长 (nm)
FITC
488
多 色 荧
光 补 偿 的 调 节
28
设门的意义
1
细胞类型或
亚型的鉴定
2
特殊蛋白质
的分析
3
细胞的分选
29
细胞分选前后示意图
30
样品处理的要求
标本来源: 外周血、骨髓、培养细胞、组织(经尼龙网300目过滤) 制成单细胞悬液 标本浓度： 106/ml-外周血白细胞计数，白血病人血标本需PBS稀释 抗凝剂： EDTA、肝素-若抗凝不佳，有凝块，则不可检测。 溶血剂： 保持细胞形态、红细胞裂解完全。 反应温度： 26～27ºC，室温避光。 细胞处理：
流式细胞术( Flow Cytometry, FCM) 是一种对细胞或亚 细胞结构进行快速测量及分选的技术。它利用高能量的激光照 射高速流动的被荧光色素染色的单细胞（或微粒）,测量其产 生的散射光和发射荧光的强度，对细胞(或微粒) 的物理性状、 细胞的生理和生化反应、细胞免疫、血液病的诊断及治疗、移 植医学、肿瘤细胞的增殖及凋亡、临床病菌的检验等进行定性 或定量检测。在生物学、基础医学和临床诊断及治疗等领域得
胞的荧光信号 ，单克隆抗体技术 ，1973年，BD公司与美国 斯坦福大学合作，研制开发并生产了世界第一台商用流式 细胞仪FACS I。）
仪器特点：单个细胞通过狭窄， 激光束产生能够反 映细胞大小的信号，激光束激发不同的荧光素所标 记的细胞成分能发射出不同的荧光。
2
流式细胞仪技术在医学与生物学中 的应用
荧光素结合的Isotype Ig作为阴 性对照，阴性对照的抗体浓度 应该与抗细胞因子抗体的浓度 相同；
细胞内细胞因子检测,可设阳性 对照细胞。
21
激发光源与荧光标记物示意图
22
光谱重叠示意图
23
ຫໍສະໝຸດ Baidu 荧光补偿
流式细胞仪常用的荧光染料多数存在发 射光谱的重叠，流式细胞仪的光学滤片 系统最大限度地减少这些信号。
2. 液流系统
8
激光波长:
3.
488nm,
流
635nm
式
激光聚焦
细
胞
仪
工
作
原
流动室
理
9
提要
1 流式细胞仪使用的基本知识 2 流式细胞仪检测的生物学意义 3 流式细胞仪检测在临床诊断的应用
10
1 流式细胞仪使用的基本知识
前向散射光(FSC)与侧向散射光(SSC)的含义 荧光素的选择 检测通道的确定 自发荧光的产生
常用荧光染料(488nm,633nm激发)
Fluorescein Isothiocyanate (FITC) 异硫氰酸荧光素
Phycoerythrin (PE) 藻红素
Allophycocyanin (APC) 异藻蓝蛋白
Peridinin-Chlorophyll Protein (PerCP) 多甲藻黄素-叶绿素蛋白
到广泛的应用。
3
FCM基本结构
1.激光, 光路系统及光电倍增管 (探测器)
2.液流系统 3.计算机处理系统
4
FCM结构图
5
1. 激光, 光路系统及光电倍增管(探测器)原理示意图
6
光学系统 FCM的光学系统是由若干组透镜、滤光片、小孔组成，它 们分别将不同波长的荧光信号送入到不同的电子探测器。
流式细胞术
Flow Cytometry（FCM）
1
概述
流式细胞技术的发展
1930s~1950s:开始出现自动细胞分析技术（细胞的
计数，光电仪记录流过一根毛细管的细胞,结合了荧光素的 抗体去标记细胞内的特定蛋白，应用分层鞘流原理，成功 的设计红细胞光学自动数器。）
1960s晚期发展：（荧光检测细胞计 ，细胞分选器检测细
PE(RD1)
488
PerCP
488
APC
633
PI
488
ECD
488
PeCy5
488
发射波长(nm) 用途
525
免疫荧光
575
免疫荧光
670
免疫荧光
670
免疫荧光
620
DNA染色
620
免疫荧光
675
免疫荧光
颜色
绿色 橙色 红色 红色 橙红 橙红 红色
17
检测通道的确定
通道 FL1 FL2 FL3 FL4 FL2 - Area FL2 - Width
色彩补偿(Color Compensation):利用 电子或数学方法从一个信号减少另外一 个信号成分的技术，典型例子是校对一 个波长区域的荧光信号在垂直轴的第二 荧光的重叠。
24
25
26
光谱重叠的校正的示意图
27
两种发射荧光重叠的部分利用荧光(色彩)补偿调节来消除。 色彩补偿(Color Compensation):利用电子或数学方法从一个信号减少另外一个 信号成分的技术，是校对一个波长区域的荧光信号在垂直轴的第二荧光的重叠。
19
消除非特异性结合FcR阻断
对于小鼠细胞需要用于 FcR阻断剂(纯化的抗 FcII/III受体抗体)减少 非特异性荧光染色；
对于人和兔细胞可以应 用纯化同种的Ig或血清 预先阻断Fc受体
20
对照的设置
细胞固定和膜穿透后，应用同一克 隆的无荧光素结合抗体处理，能够 区分细胞因子特异和非特异染色
消除非特异性结合-FcR阻断
对照的设置
多色荧光补偿的调节 设门的意义
样品处理的要求
11
前向 散射 光
(FSC) 与侧 向散 射光
(SSC) 的含 义
FSC和SSC的原理
12
前向散射光
13
侧向散射光
14
血细胞双参数点图
15
荧光素的选择
荧光素的选择： 荧光强度 FITC<PE<APC 依次增加；弱 信号采用PE或 APC，强信号 采用FITC
发射波长 530/30 585/42 650 661/16
荧光颜色 绿色 橙色 橙红 红色
18
自发荧光的产生
末染色的细胞受到光照射后所发出的荧光称自 发荧光。用流式细胞计测定细胞的特异性荧光染料 的荧光时，这种自发荧光对所欲测定的特异性荧光 是一种本底信号，自发荧光在多种情况下都会干扰 特异性荧光信号，尤其是对低水平结合的荧光抗体 它能减低染色的和未染色的细胞间的区别，使我们 难以确定细胞中荧光信号的水平。自发荧光的强弱 与细胞的大小、细胞的类型、激发光的波长、发射 光的检测范围等都有关系。产生自发荧光的分子可 能是正常细胞的组成成分如核黄素、细胞色素等。
Tandem Dyes PE-Texas Red (ECD) PE-Cy5 (PC5) PE-Cy5.5 (PC5.5) (futures) PE-Cy7 (PC7) (futures)
Propidium iodide（PI ） 碘化丙碇
16
常用荧光染料的特性
荧光染料 激发波长 (nm)
FITC
488
多 色 荧
光 补 偿 的 调 节
28
设门的意义
1
细胞类型或
亚型的鉴定
2
特殊蛋白质
的分析
3
细胞的分选
29
细胞分选前后示意图
30
样品处理的要求
标本来源: 外周血、骨髓、培养细胞、组织(经尼龙网300目过滤) 制成单细胞悬液 标本浓度： 106/ml-外周血白细胞计数，白血病人血标本需PBS稀释 抗凝剂： EDTA、肝素-若抗凝不佳，有凝块，则不可检测。 溶血剂： 保持细胞形态、红细胞裂解完全。 反应温度： 26～27ºC，室温避光。 细胞处理：
流式细胞术( Flow Cytometry, FCM) 是一种对细胞或亚 细胞结构进行快速测量及分选的技术。它利用高能量的激光照 射高速流动的被荧光色素染色的单细胞（或微粒）,测量其产 生的散射光和发射荧光的强度，对细胞(或微粒) 的物理性状、 细胞的生理和生化反应、细胞免疫、血液病的诊断及治疗、移 植医学、肿瘤细胞的增殖及凋亡、临床病菌的检验等进行定性 或定量检测。在生物学、基础医学和临床诊断及治疗等领域得
胞的荧光信号 ，单克隆抗体技术 ，1973年，BD公司与美国 斯坦福大学合作，研制开发并生产了世界第一台商用流式 细胞仪FACS I。）
仪器特点：单个细胞通过狭窄， 激光束产生能够反 映细胞大小的信号，激光束激发不同的荧光素所标 记的细胞成分能发射出不同的荧光。
2
流式细胞仪技术在医学与生物学中 的应用
荧光素结合的Isotype Ig作为阴 性对照，阴性对照的抗体浓度 应该与抗细胞因子抗体的浓度 相同；
细胞内细胞因子检测,可设阳性 对照细胞。
21
激发光源与荧光标记物示意图
22
光谱重叠示意图
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ຫໍສະໝຸດ Baidu 荧光补偿
流式细胞仪常用的荧光染料多数存在发 射光谱的重叠，流式细胞仪的光学滤片 系统最大限度地减少这些信号。