流式细胞仪技术ppt课件
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流式细胞仪培训(ppt42张)
PMT用于检测较弱的SSC信号和荧光信号 ，光电二
极管用于检测较强的FSC信号
阈值
阈值：信号放大过程会产生不需要的脉冲信号，通常
来自于碎片。通过设定某一信号的最低强度值，可将 不需要的脉冲信号去除，这一设定值称为阈值。
荧光补偿
采用合适的方法校正荧光染料之间叠加所造成的误差
荧光补偿
补偿调整的实验过程
流式细胞仪的检测对象
藻类细胞
染色体
血细胞
原生动物细胞
任何存在于悬液中的直径为0.2-50微米的粒子或细胞都适用于流式分析
流式细胞仪工作原理示意图
流式的基本组 成： 1.流动室和 液流系统 2.光路系统 3.电系统
流式细胞仪可提供的信息
物理信息：通过散射光信号反映
相对细胞大小 相对细胞颗粒密度和内部复杂度
流式细胞仪原理与应用
陈玉婵
提
要
流式细胞仪简介 流式细胞仪工作原理 流式实验流程 流式细胞术的应用
流式细胞术的发展史
1930s~1950s:开始出现自动细胞分析技术（细 胞的计数，是通过光电仪记录流过一根毛细管 的细胞,用结合了荧光素的抗体去标记细胞内 的特定蛋白，应用分层鞘流原理，成功的设计 红细胞光学自动计数器。） 1960s晚期发展：荧光检测细胞计 、细胞分选 器检测细胞的荧光信号 、单克隆抗体技术 1973年，BD公司与美国斯坦福大学合作，研制 开发并生产了世界第一台商用流式细胞仪FACS I。
DNA含量分析-PI染色
细胞凋亡
细胞膜分析-PS外翻
PS（磷脂酰丝氨酸）正常暴露在胞膜的内表 面，凋亡时，PS外翻向细胞外表面。重组蛋白 Annexin-V可与PS结合
流式细胞仪ppt课件
DNA倍体
2N 2N 2N~4N 4N 4N
.
43
Normal Cell Cycle
M G2
G0
G1
s
C o u n t
DNA Analysis
G0G1
s G2M
0
200
400
600
800
1000
2N
4N
DNA content
.
44
.
45
DNA Analysis
300
225
150
Counts
75
.
18
3-D Histograms
.
19
免疫荧光分析
细胞表面的抗原(或细胞膜受体)与相关的 荧光抗体结合，形成带有荧光的抗原抗体复合 物。通过流式细胞仪测定其荧光量，即可得到 细胞群的不同抗原位点表达情况。
.
20
.
21
免疫荧光分析的意义：
流式细胞术与单克隆抗体结合，可对细 胞表面和细胞内抗原、癌基因蛋白及膜受体 进行定量检测，成为临床检验的一项重要指 标。流式免疫荧光技术不仅能将表达不同抗 原位点的细胞群区分开来，而且还能进一步 区分各细胞亚群。对于造血系统疾病、免疫 功能障碍及恶性肿瘤的诊断、治疗及预后评 估都起了重要作用。
.
3
FCM在生命科学中的应用,标志着细胞生物 学、肿瘤学、免疫学等进入了细胞和分子水平 的研究。为从微观认识细胞及横向比较特征提 供了精密、准确的方法和仪器.
.
4
流式细胞仪的发展史
1930 年 Caspersson 和Thorell 开始致力于细胞的计数 1934 年 Moldaven 是世界上最早设想使细胞检测自动化的人他试图用光 电仪记录流过一根毛细管的细胞
流式细胞术.ppt
信号检测与分析
当细胞携带荧光素标记物，通过激光照射 时，产生代表细胞内不同物质、不同波长 的荧光信号，这些信号以细胞为中心，向 空间360度立体角发射，产生散射光和荧光 信号。 以激发图
散射光信号
散射光信号不依赖任何样品的制备技术 （如染色），因此称为细胞的物理参数。
①T淋巴细胞及亚群： 外周血中成熟淋巴细胞主要属于
TCRαβ＋T细胞，可分为Th、Ts、Treg， TCRγδT细胞和NK1.1＋T细胞等，他们 都有一个共同的标志CD3。
a、辅助/诱导性T淋巴细胞（Th）占27-51%， 是主要的功能亚群，主要表达CD3＋CD4＋CD8 －。
b、抑制/细胞毒性T淋巴细胞（Ts）占15-44%， 是 主 要 的 效 应 性 T 细 胞 亚 群 ， 主 要 表 达 CD3＋ CD4 －CD8＋。
因此通过流式细胞仪计数和多参数分析淋巴细胞亚群对了解 淋巴细胞发育、分化、活化和功能成熟，鉴别新的淋巴细胞 亚群具有重要价值；更重要的是通过研究和分析疾病与特异 性淋巴细胞亚群或某些疾病，如免疫性疾病、感染性疾病、 肿瘤等的诊断、治疗、免疫功能重建和器官移植检测有着重 要临床意义。
（1）淋巴细胞及其亚群分析
（三）质料采集和分析过程中 的质量控制
1、标本采集处理
a、组织标本采集： b、标本固定：70%的乙醇固定效果好。 C、单细胞悬液的制备：细胞浓度调整为1×106/ml。 d、石蜡包埋组织的单细胞制备：一般不用。
2、资料采集：一般每个标本应获取1×104。 2×104个有核细胞的荧光和散光系数，白血病 微小残余病变检测应收集5×104个细胞。 3、资料分析；略
缺点；细胞散射光特征丢失较肝素标本快。
（一） FCM单细胞标本的制备
流式细胞仪介绍 ppt课件
Source
Forward Light
Detector
Cell Surface
Area
相对荧光强度（FL） (需探针标记)
是细胞或细胞上的荧光染料被激光激发后发射出
的荧光，不同的荧光染料其发射波长不同。
区分阴阳性：通过荧光强度可将同一个细胞群体
中的有荧光标记的细胞与无荧光标记的细胞区分
开来。
区分阳性强弱：也可以将阳性细胞中的高FL的细
非常节省细胞，对于科研珍贵标本尤为重要！
绝对的细胞计数，无需计数微珠，细胞培养后往往需要细
胞计数仪，可以完全代替细胞计数仪。
自动标记，自动进样，自动清洗，节省时间。
自动补偿，对多色分析自动生成补偿数值
小巧的台式机设计,低噪，低热
非加压系统进样
(25)
34
仪器的竞争分析
BD的各种机型（一）
无加压系统
溶液瓶附着在仪器上
仪器状态能够通过溶液瓶的不同颜色来指示
软件基本特征
12‘’触摸屏（内嵌）
Live support 远程网络服务，德国工程师进
行远程在线检修机器
VGA 接口 (连接第二个显示器或者代替的显示
器)
功能强大、易于操作
——直观的操作界面 (用于仪器控制, 数据获取和数据
•
•
•
•
•
•
•
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•
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•
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•
•
Belgium
Canada
China
France
Germany
Forward Light
Detector
Cell Surface
Area
相对荧光强度（FL） (需探针标记)
是细胞或细胞上的荧光染料被激光激发后发射出
的荧光，不同的荧光染料其发射波长不同。
区分阴阳性：通过荧光强度可将同一个细胞群体
中的有荧光标记的细胞与无荧光标记的细胞区分
开来。
区分阳性强弱：也可以将阳性细胞中的高FL的细
非常节省细胞，对于科研珍贵标本尤为重要！
绝对的细胞计数，无需计数微珠，细胞培养后往往需要细
胞计数仪，可以完全代替细胞计数仪。
自动标记，自动进样，自动清洗，节省时间。
自动补偿，对多色分析自动生成补偿数值
小巧的台式机设计,低噪，低热
非加压系统进样
(25)
34
仪器的竞争分析
BD的各种机型（一）
无加压系统
溶液瓶附着在仪器上
仪器状态能够通过溶液瓶的不同颜色来指示
软件基本特征
12‘’触摸屏（内嵌）
Live support 远程网络服务，德国工程师进
行远程在线检修机器
VGA 接口 (连接第二个显示器或者代替的显示
器)
功能强大、易于操作
——直观的操作界面 (用于仪器控制, 数据获取和数据
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Belgium
Canada
China
France
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流式细胞术原理及应用新课件PPT全
流式细胞术是20世纪70年代发展起来的一种技术，有人将流式细胞仪比喻成高级的荧光显微镜。 HLA-B27: 强直性脊柱炎 细胞功能检测：细胞周期、凋亡
Flow Sorting 直方图适用于：单参数分析
SORTING（细胞分选） CD16+56 NK细胞 可利用FCM进行细胞周期分析，适当选择周期特异性药物或非周期特异性药物。
巨血小板
• 细胞凋亡与坏死的区别 一般只测一个参数、不能分选
5、DNA含量分析法（晚晚期）
2F时LO必W需C停Y用TO免M疫E抑TR制Y剂。虽然凋亡与坏死的最终结果极为相似，但
凋亡检测
每一步都有检测它试剂盒们的过程与表现却有很大差别。
光路调节系统固定，自动化程度高，操作简便，易学易掌握,适合
坏死（necrosis）：坏死是细胞受到强烈理 流式细胞分析在人类基因组计划中发挥了重要作用，流式细胞技术的应用也适用于植物，目前这个技术应用范围包括流式核型分析，
目前，该技术以广泛用于生物及医 学基础研究与临床检测，在分子生物学、 免疫学、遗传学、血液学、肿瘤学等领 域内发挥着重要作用。
流式细胞仪
荧光显微镜
Flow Cytometry
控制 一般只测一个参数、不能分选
电脑
人脑
其细胞及组织的变化与坏死有明显的不同。
可利用FCM进行细胞周期分析，适当选择周期特异性药物或非周期特异性药物。
• 空白对照：ALL 应用领域将不断开拓，成为科研与临床不可或缺的重要工具。
随着白细胞分化抗原意义的确认以及单克隆抗体技术的发展，随着人们创新意识的加强，结合计算机技术和其他技术，流式细胞仪的 应用领域将不断开拓，成为科研与临床不可或缺的重要工具。 坏死（necrosis）：坏死是细胞受到强烈理化或生物因素作用引起细胞无序变化的死亡过程。
流式细胞仪 ppt课件
ppt课件
9
常用荧光染料的特性
荧光染料 激发波长 (nm) 发射波长(nm) 用途
颜色
FITC
488
525
免疫荧光 绿色
PE(RD1) 488
575
免疫荧光 橙色
ECD
488
620
免疫荧光 橙红
PeCy5 488
675
免疫荧光 红
PI
488
620
DNA染色 橙红
PECy7 488
755
免疫荧光 深红
ppt课件
7
流式细胞检测样本的制备： 细胞样本的处理： 组织样本的处理 流式细胞仪检测的信号： 散射光信号：前向角散射光（Forward scatter， FSC) 与细胞大小有关；侧向角散射(Side scatter ，SSC，又 称90°角散射光）与细胞精细结构和颗粒性质有关，对 胞膜、胞质、核膜变化更敏感。 荧光信号：特异性荧光信号是指将荧光素分子耦联到特 异性抗体或分子上，当其与细胞表面或者胞浆中的抗原 结合后，被特定波长激发光激发而产生的信号； 自发荧光：个别的细胞有着他们各自特异性水平的自发 荧光（荧光信号产生于他们自身）。
流式细胞仪 FLOWபைடு நூலகம்CYTOMETER
基本概念和原理
ppt课件
1
2003年推出世界上第一台单激光五色的流式细 胞仪FC500/MCL，2005年升级为FC500/MPL
Cytomics FC500
ppt课件
2
流式细胞术的基本概念
流式细胞术（Flow Cytometry, FCM）是一种可 以快速、准确、客观，能够同时检测快速直线流 动状态中的单个细胞的多项物理及生物学特性， 加以分析定量的技术，并且可以对特定群体加以 分选。其中用到的流式细胞仪（Flow Cytometer ）是集激光技术、电子物理技术、光电测量技术 、电子计算机技术、细胞荧光化学技术、单克隆 抗体技术为一体的一种新型高科技仪器。在国外 又把流式细胞仪称为荧光激活细胞分选器（ Fluorescence-Activated Cell Sorting, FACS），所 以目前大多数流式细胞仪机型都以FACS命名。
流式细胞术PPT课件
电荷式分选
lasers
–超声振动器(15-100kHz)
–液流充电系统
–高压偏转板
–收集装置(流式管、培养板)
断裂点(充电) 高压偏转板
29
四路分选原理
电荷式分选装置
30
分选指标
• 分选时间由三方面决定：进样速度、目标细胞所占比例、 需要收集的细胞数。
需要细胞数
目标细胞所占比例(%)
1
5
50
104
• Hoechst（343, 450）常见为Hoechst33342和Hoechst33258，非嵌入的 方式与DNA链上的A-T碱基对结合。能对活细胞染色，用于活细胞 DNA定量分析，如精子分选；还用于侧群细胞的分选。
• PY（派若宁 560, 573） RNA染料，能进入活细胞。
• AO（吖啶橙 509, 525） DNA、RNA染料，染色后DNA呈黄绿色荧光， RNA呈橙黄色荧光，可进行DNA/RNA双参数分析。
• 多色标记荧光素搭配原则：每个通道只能选择一种荧光素； 各个通道之间的荧光素可以随意搭配。
FACSCalibur常用四色搭配：FITC、PE、PerCP、APC。
33
B 根据抗原表达强弱合理选择 抗体
• 不同的荧光素强度有所不同；
CD5
• 高表达的抗原可用不太“亮” 的染料，更“亮”的荧光素分 配给表达低的抗原：
99%以上。 • 分选收获率是指被分选出的细胞与原来总细胞的百分比。 • 分选纯度和收获率永远是相互矛盾的，纯度提高，收获率
降低，反之亦然。
– 富集模式(enrich mode) – 纯化模式(purify mode) – 单细胞模式(single cell mode)
流式细胞术的基本原理及其应用ppt课件
4
流式细胞仪基本结构 流动室与液流系统
光源与光学系统 信号收集与信号转换系统
计算机与分析系统
分选系统
5
流式细胞仪的液流系统
6
流式细胞仪的光学系统
光电转换器件
流动室
检测点Biblioteka 激光器7流式细胞仪的光信号
1. 散色光信号
前向角散色（Forward Scatter，FSC）
小角散色，与细胞直径成近似直线关系。
荧光染料 激发波长/nm 发射波长/nm
颜色
FITC
488
525
绿色
PE
488
575
橙黄色
PerCP
488
677
深红色
APC
633
660
红色
11
12
四种激光器 355nm 405nm 488nm 633nm
可进行多达10色以 上的多色荧光分析
BD LSR Ⅱ
13
流式细胞术的应用
❖ 细胞表面分子 ❖ 细胞内或细胞核内抗原 ❖ 细胞凋亡 ❖ DNA含量检测与细胞周期的分析 ❖ 细胞增殖 ❖ 细胞毒的检测与分析 ❖ 可溶性蛋白分子 ❖ 报告基因 ❖ 其它
流式细胞术基本原理及应用
漆冬梅
1
❖流式细胞仪（flow cytometer）
是一种集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、 电子计算机以及细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术 为一体的新型高科技仪器。
大型机、科研型
台式机、临床型
2
目前最新型流式仪
3
❖流式细胞术（flow cytometry）
利用流式细胞仪对处于快速直线流动状态中的单列 细胞或生物颗粒进行多参数、快速的定性、定量分 析或分选的技术。
流式细胞仪基本结构 流动室与液流系统
光源与光学系统 信号收集与信号转换系统
计算机与分析系统
分选系统
5
流式细胞仪的液流系统
6
流式细胞仪的光学系统
光电转换器件
流动室
检测点Biblioteka 激光器7流式细胞仪的光信号
1. 散色光信号
前向角散色（Forward Scatter，FSC）
小角散色，与细胞直径成近似直线关系。
荧光染料 激发波长/nm 发射波长/nm
颜色
FITC
488
525
绿色
PE
488
575
橙黄色
PerCP
488
677
深红色
APC
633
660
红色
11
12
四种激光器 355nm 405nm 488nm 633nm
可进行多达10色以 上的多色荧光分析
BD LSR Ⅱ
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流式细胞术的应用
❖ 细胞表面分子 ❖ 细胞内或细胞核内抗原 ❖ 细胞凋亡 ❖ DNA含量检测与细胞周期的分析 ❖ 细胞增殖 ❖ 细胞毒的检测与分析 ❖ 可溶性蛋白分子 ❖ 报告基因 ❖ 其它
流式细胞术基本原理及应用
漆冬梅
1
❖流式细胞仪（flow cytometer）
是一种集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、 电子计算机以及细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术 为一体的新型高科技仪器。
大型机、科研型
台式机、临床型
2
目前最新型流式仪
3
❖流式细胞术（flow cytometry）
利用流式细胞仪对处于快速直线流动状态中的单列 细胞或生物颗粒进行多参数、快速的定性、定量分 析或分选的技术。
流式细胞术的原理及应用ppt课件
➢可把感兴趣细胞分 选到特定培养孔或板 上（4路和24孔板）
➢适用于高速分选和 多色分析
6
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
流式细胞仪检测范围
细胞大小
细胞粒度
细 细胞表面面积
胞 结
核浆比例
构 DNA含量与细胞周期
18
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
散射光
它反应细胞的物理特性,根据前侧向散射光，可以把不同 类型的细胞群加以区分
FSC（小角散射光)它反 应细胞的相对大小和截 面积的大小
SSC (90度角散射光)代 表细胞的颗粒度和精细 结构的变化
1.液流系统： 细胞悬液被吸入检测室后，在鞘液
(sheath)的约束下，通过喷嘴，使其形成单细 胞悬液。
10
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
2.光学系统： 激光是较常用的光源, 稳定性好、单色性好。 散射光和荧光信号被收集、处理转化为数字信号。
FACS Vantage DiVa
科研型（大型机）
特点： ➢多数字化 ➢适用于各类细胞分选 ➢4路分选
5
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
FACSAria
科研型
特点： ➢分辨率高
➢选配多种波长和类 型激光器
成,将产生的光信号引导至检测器
➢适用于高速分选和 多色分析
6
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
流式细胞仪检测范围
细胞大小
细胞粒度
细 细胞表面面积
胞 结
核浆比例
构 DNA含量与细胞周期
18
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
散射光
它反应细胞的物理特性,根据前侧向散射光，可以把不同 类型的细胞群加以区分
FSC（小角散射光)它反 应细胞的相对大小和截 面积的大小
SSC (90度角散射光)代 表细胞的颗粒度和精细 结构的变化
1.液流系统： 细胞悬液被吸入检测室后，在鞘液
(sheath)的约束下，通过喷嘴，使其形成单细 胞悬液。
10
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
2.光学系统： 激光是较常用的光源, 稳定性好、单色性好。 散射光和荧光信号被收集、处理转化为数字信号。
FACS Vantage DiVa
科研型（大型机）
特点： ➢多数字化 ➢适用于各类细胞分选 ➢4路分选
5
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
FACSAria
科研型
特点： ➢分辨率高
➢选配多种波长和类 型激光器
成,将产生的光信号引导至检测器
流式细胞仪分析技术及应用PPT课件
49
（四）石蜡包埋组织单细胞悬液制备 该制备方法的建立扩大了流式细胞术的应
用范围，有利于进行临床回顾性研究和利 用。 常用的方法有二甲苯脱蜡法、组织清洁剂 脱蜡法和甲氧-双氧水处理法。 对石蜡切片的要求较严格。
50
（五）活检标本单细胞悬液制备 活检标本及各种内镜取材标本也克制备成
能对于处在快速直线流动状态 中的细胞或生物颗粒同时进行 多参数、快速定量分析和分选
5
一、流式细胞仪分析的工作原理
荧光显微镜技术
激发光源改为激光
单克隆抗体与 荧光染料技术
计算机技术 处理光信号
提高检测灵敏度 和特异性
提高检测速度和 统计分析精确性
6
（一）流式细胞仪基本结构
液流系统
1
包括流动室（flow chamber）和液流驱动系统 作用：依次传送待测样本中的细胞到激光照射区 理想状态：细胞逐个传送到激光束的中心，而且
侧向散射光检测器
在激光束的垂直方 向，又称90°散射
SSC信号的强弱与 细胞内颗粒结构的 质量成正比，用于 检测细胞内部结构 属性
28
前向散射光示意图
细胞大小
29
结构复杂程度
侧向散射光示意图
30
当荧光抗体或其他染料染色的颗粒通过 激光束时，染料吸收光子跃迁到激发态，返 回基态时，染料释放出能量，大部分以光的 形式释放。
分选的方式有捕获式分选和电荷式分选，目前应 用最多的是电荷式分选。
21
电荷式分选1
当单细胞悬液形成液柱通过 流动室时，液柱被分割成一 连串均匀的液滴。
根据设定的被分选细胞的某 个参数由逻辑电路判断是否 被分选。
22
电荷式分选2
充电电路对选定细胞液滴充 电，使其带正电荷或负电荷， 未被设定分选参数的细胞液 滴则不带电荷。
（四）石蜡包埋组织单细胞悬液制备 该制备方法的建立扩大了流式细胞术的应
用范围，有利于进行临床回顾性研究和利 用。 常用的方法有二甲苯脱蜡法、组织清洁剂 脱蜡法和甲氧-双氧水处理法。 对石蜡切片的要求较严格。
50
（五）活检标本单细胞悬液制备 活检标本及各种内镜取材标本也克制备成
能对于处在快速直线流动状态 中的细胞或生物颗粒同时进行 多参数、快速定量分析和分选
5
一、流式细胞仪分析的工作原理
荧光显微镜技术
激发光源改为激光
单克隆抗体与 荧光染料技术
计算机技术 处理光信号
提高检测灵敏度 和特异性
提高检测速度和 统计分析精确性
6
（一）流式细胞仪基本结构
液流系统
1
包括流动室（flow chamber）和液流驱动系统 作用：依次传送待测样本中的细胞到激光照射区 理想状态：细胞逐个传送到激光束的中心，而且
侧向散射光检测器
在激光束的垂直方 向，又称90°散射
SSC信号的强弱与 细胞内颗粒结构的 质量成正比，用于 检测细胞内部结构 属性
28
前向散射光示意图
细胞大小
29
结构复杂程度
侧向散射光示意图
30
当荧光抗体或其他染料染色的颗粒通过 激光束时，染料吸收光子跃迁到激发态，返 回基态时，染料释放出能量，大部分以光的 形式释放。
分选的方式有捕获式分选和电荷式分选，目前应 用最多的是电荷式分选。
21
电荷式分选1
当单细胞悬液形成液柱通过 流动室时，液柱被分割成一 连串均匀的液滴。
根据设定的被分选细胞的某 个参数由逻辑电路判断是否 被分选。
22
电荷式分选2
充电电路对选定细胞液滴充 电，使其带正电荷或负电荷， 未被设定分选参数的细胞液 滴则不带电荷。
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7
2. 液流系统
8
激光波长:
3.
488nm,
流
635nm
式
激光聚焦
细
胞
仪
工作Biblioteka 原流动室理
9
提要
1 流式细胞仪使用的基本知识 2 流式细胞仪检测的生物学意义 3 流式细胞仪检测在临床诊断的应用
10
1 流式细胞仪使用的基本知识
前向散射光(FSC)与侧向散射光(SSC)的含义 荧光素的选择 检测通道的确定 自发荧光的产生
消除非特异性结合-FcR阻断
对照的设置
多色荧光补偿的调节 设门的意义
样品处理的要求
11
前向 散射 光
(FSC) 与侧 向散 射光
(SSC) 的含 义
FSC和SSC的原理
12
前向散射光
13
侧向散射光
14
血细胞双参数点图
15
荧光素的选择
荧光素的选择： 荧光强度 FITC<PE<APC 依次增加；弱 信号采用PE或 APC，强信号 采用FITC
荧光素结合的Isotype Ig作为阴 性对照，阴性对照的抗体浓度 应该与抗细胞因子抗体的浓度 相同；
细胞内细胞因子检测,可设阳性 对照细胞。
21
激发光源与荧光标记物示意图
22
光谱重叠示意图
23
荧光补偿
流式细胞仪常用的荧光染料多数存在发 射光谱的重叠，流式细胞仪的光学滤片 系统最大限度地减少这些信号。
到广泛的应用。
3
FCM基本结构
1.激光, 光路系统及光电倍增管 (探测器)
2.液流系统 3.计算机处理系统
4
FCM结构图
5
1. 激光, 光路系统及光电倍增管(探测器)原理示意图
6
光学系统 FCM的光学系统是由若干组透镜、滤光片、小孔组成，它 们分别将不同波长的荧光信号送入到不同的电子探测器。
常用荧光染料(488nm,633nm激发)
Fluorescein Isothiocyanate (FITC) 异硫氰酸荧光素
Phycoerythrin (PE) 藻红素
Allophycocyanin (APC) 异藻蓝蛋白
Peridinin-Chlorophyll Protein (PerCP) 多甲藻黄素-叶绿素蛋白
胞的荧光信号 ，单克隆抗体技术 ，1973年，BD公司与美国 斯坦福大学合作，研制开发并生产了世界第一台商用流式 细胞仪FACS I。）
仪器特点：单个细胞通过狭窄， 激光束产生能够反 映细胞大小的信号，激光束激发不同的荧光素所标 记的细胞成分能发射出不同的荧光。
2
流式细胞仪技术在医学与生物学中 的应用
色彩补偿(Color Compensation):利用 电子或数学方法从一个信号减少另外一 个信号成分的技术，典型例子是校对一 个波长区域的荧光信号在垂直轴的第二 荧光的重叠。
24
25
26
光谱重叠的校正的示意图
27
两种发射荧光重叠的部分利用荧光(色彩)补偿调节来消除。 色彩补偿(Color Compensation):利用电子或数学方法从一个信号减少另外一个 信号成分的技术，是校对一个波长区域的荧光信号在垂直轴的第二荧光的重叠。
PE(RD1)
488
PerCP
488
APC
633
PI
488
ECD
488
PeCy5
488
发射波长(nm) 用途
525
免疫荧光
575
免疫荧光
670
免疫荧光
670
免疫荧光
620
DNA染色
620
免疫荧光
675
免疫荧光
颜色
绿色 橙色 红色 红色 橙红 橙红 红色
17
检测通道的确定
通道 FL1 FL2 FL3 FL4 FL2 - Area FL2 - Width
Tandem Dyes PE-Texas Red (ECD) PE-Cy5 (PC5) PE-Cy5.5 (PC5.5) (futures) PE-Cy7 (PC7) (futures)
Propidium iodide（PI ） 碘化丙碇
16
常用荧光染料的特性
荧光染料 激发波长 (nm)
FITC
488
发射波长 530/30 585/42 650 661/16
荧光颜色 绿色 橙色 橙红 红色
18
自发荧光的产生
末染色的细胞受到光照射后所发出的荧光称自 发荧光。用流式细胞计测定细胞的特异性荧光染料 的荧光时，这种自发荧光对所欲测定的特异性荧光 是一种本底信号，自发荧光在多种情况下都会干扰 特异性荧光信号，尤其是对低水平结合的荧光抗体 它能减低染色的和未染色的细胞间的区别，使我们 难以确定细胞中荧光信号的水平。自发荧光的强弱 与细胞的大小、细胞的类型、激发光的波长、发射 光的检测范围等都有关系。产生自发荧光的分子可 能是正常细胞的组成成分如核黄素、细胞色素等。
多 色 荧
光 补 偿 的 调 节
28
设门的意义
1
细胞类型或
亚型的鉴定
2
特殊蛋白质
的分析
3
细胞的分选
29
细胞分选前后示意图
30
样品处理的要求
标本来源: 外周血、骨髓、培养细胞、组织(经尼龙网300目过滤) 制成单细胞悬液 标本浓度： 106/ml-外周血白细胞计数，白血病人血标本需PBS稀释 抗凝剂： EDTA、肝素-若抗凝不佳，有凝块，则不可检测。 溶血剂： 保持细胞形态、红细胞裂解完全。 反应温度： 26～27ºC，室温避光。 细胞处理：
流式细胞术( Flow Cytometry, FCM) 是一种对细胞或亚 细胞结构进行快速测量及分选的技术。它利用高能量的激光照 射高速流动的被荧光色素染色的单细胞（或微粒）,测量其产 生的散射光和发射荧光的强度，对细胞(或微粒) 的物理性状、 细胞的生理和生化反应、细胞免疫、血液病的诊断及治疗、移 植医学、肿瘤细胞的增殖及凋亡、临床病菌的检验等进行定性 或定量检测。在生物学、基础医学和临床诊断及治疗等领域得
流式细胞术
Flow Cytometry（FCM）
1
概述
流式细胞技术的发展
1930s~1950s:开始出现自动细胞分析技术（细胞的
计数，光电仪记录流过一根毛细管的细胞,结合了荧光素的 抗体去标记细胞内的特定蛋白，应用分层鞘流原理，成功 的设计红细胞光学自动数器。）
1960s晚期发展：（荧光检测细胞计 ，细胞分选器检测细
19
消除非特异性结合FcR阻断
对于小鼠细胞需要用于 FcR阻断剂(纯化的抗 FcII/III受体抗体)减少 非特异性荧光染色；
对于人和兔细胞可以应 用纯化同种的Ig或血清 预先阻断Fc受体
20
对照的设置
细胞固定和膜穿透后，应用同一克 隆的无荧光素结合抗体处理，能够 区分细胞因子特异和非特异染色
2. 液流系统
8
激光波长:
3.
488nm,
流
635nm
式
激光聚焦
细
胞
仪
工作Biblioteka 原流动室理
9
提要
1 流式细胞仪使用的基本知识 2 流式细胞仪检测的生物学意义 3 流式细胞仪检测在临床诊断的应用
10
1 流式细胞仪使用的基本知识
前向散射光(FSC)与侧向散射光(SSC)的含义 荧光素的选择 检测通道的确定 自发荧光的产生
消除非特异性结合-FcR阻断
对照的设置
多色荧光补偿的调节 设门的意义
样品处理的要求
11
前向 散射 光
(FSC) 与侧 向散 射光
(SSC) 的含 义
FSC和SSC的原理
12
前向散射光
13
侧向散射光
14
血细胞双参数点图
15
荧光素的选择
荧光素的选择： 荧光强度 FITC<PE<APC 依次增加；弱 信号采用PE或 APC，强信号 采用FITC
荧光素结合的Isotype Ig作为阴 性对照，阴性对照的抗体浓度 应该与抗细胞因子抗体的浓度 相同；
细胞内细胞因子检测,可设阳性 对照细胞。
21
激发光源与荧光标记物示意图
22
光谱重叠示意图
23
荧光补偿
流式细胞仪常用的荧光染料多数存在发 射光谱的重叠，流式细胞仪的光学滤片 系统最大限度地减少这些信号。
到广泛的应用。
3
FCM基本结构
1.激光, 光路系统及光电倍增管 (探测器)
2.液流系统 3.计算机处理系统
4
FCM结构图
5
1. 激光, 光路系统及光电倍增管(探测器)原理示意图
6
光学系统 FCM的光学系统是由若干组透镜、滤光片、小孔组成，它 们分别将不同波长的荧光信号送入到不同的电子探测器。
常用荧光染料(488nm,633nm激发)
Fluorescein Isothiocyanate (FITC) 异硫氰酸荧光素
Phycoerythrin (PE) 藻红素
Allophycocyanin (APC) 异藻蓝蛋白
Peridinin-Chlorophyll Protein (PerCP) 多甲藻黄素-叶绿素蛋白
胞的荧光信号 ，单克隆抗体技术 ，1973年，BD公司与美国 斯坦福大学合作，研制开发并生产了世界第一台商用流式 细胞仪FACS I。）
仪器特点：单个细胞通过狭窄， 激光束产生能够反 映细胞大小的信号，激光束激发不同的荧光素所标 记的细胞成分能发射出不同的荧光。
2
流式细胞仪技术在医学与生物学中 的应用
色彩补偿(Color Compensation):利用 电子或数学方法从一个信号减少另外一 个信号成分的技术，典型例子是校对一 个波长区域的荧光信号在垂直轴的第二 荧光的重叠。
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光谱重叠的校正的示意图
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两种发射荧光重叠的部分利用荧光(色彩)补偿调节来消除。 色彩补偿(Color Compensation):利用电子或数学方法从一个信号减少另外一个 信号成分的技术，是校对一个波长区域的荧光信号在垂直轴的第二荧光的重叠。
PE(RD1)
488
PerCP
488
APC
633
PI
488
ECD
488
PeCy5
488
发射波长(nm) 用途
525
免疫荧光
575
免疫荧光
670
免疫荧光
670
免疫荧光
620
DNA染色
620
免疫荧光
675
免疫荧光
颜色
绿色 橙色 红色 红色 橙红 橙红 红色
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检测通道的确定
通道 FL1 FL2 FL3 FL4 FL2 - Area FL2 - Width
Tandem Dyes PE-Texas Red (ECD) PE-Cy5 (PC5) PE-Cy5.5 (PC5.5) (futures) PE-Cy7 (PC7) (futures)
Propidium iodide（PI ） 碘化丙碇
16
常用荧光染料的特性
荧光染料 激发波长 (nm)
FITC
488
发射波长 530/30 585/42 650 661/16
荧光颜色 绿色 橙色 橙红 红色
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自发荧光的产生
末染色的细胞受到光照射后所发出的荧光称自 发荧光。用流式细胞计测定细胞的特异性荧光染料 的荧光时，这种自发荧光对所欲测定的特异性荧光 是一种本底信号，自发荧光在多种情况下都会干扰 特异性荧光信号，尤其是对低水平结合的荧光抗体 它能减低染色的和未染色的细胞间的区别，使我们 难以确定细胞中荧光信号的水平。自发荧光的强弱 与细胞的大小、细胞的类型、激发光的波长、发射 光的检测范围等都有关系。产生自发荧光的分子可 能是正常细胞的组成成分如核黄素、细胞色素等。
多 色 荧
光 补 偿 的 调 节
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设门的意义
1
细胞类型或
亚型的鉴定
2
特殊蛋白质
的分析
3
细胞的分选
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细胞分选前后示意图
30
样品处理的要求
标本来源: 外周血、骨髓、培养细胞、组织(经尼龙网300目过滤) 制成单细胞悬液 标本浓度： 106/ml-外周血白细胞计数，白血病人血标本需PBS稀释 抗凝剂： EDTA、肝素-若抗凝不佳，有凝块，则不可检测。 溶血剂： 保持细胞形态、红细胞裂解完全。 反应温度： 26～27ºC，室温避光。 细胞处理：
流式细胞术( Flow Cytometry, FCM) 是一种对细胞或亚 细胞结构进行快速测量及分选的技术。它利用高能量的激光照 射高速流动的被荧光色素染色的单细胞（或微粒）,测量其产 生的散射光和发射荧光的强度，对细胞(或微粒) 的物理性状、 细胞的生理和生化反应、细胞免疫、血液病的诊断及治疗、移 植医学、肿瘤细胞的增殖及凋亡、临床病菌的检验等进行定性 或定量检测。在生物学、基础医学和临床诊断及治疗等领域得
流式细胞术
Flow Cytometry（FCM）
1
概述
流式细胞技术的发展
1930s~1950s:开始出现自动细胞分析技术（细胞的
计数，光电仪记录流过一根毛细管的细胞,结合了荧光素的 抗体去标记细胞内的特定蛋白，应用分层鞘流原理，成功 的设计红细胞光学自动数器。）
1960s晚期发展：（荧光检测细胞计 ，细胞分选器检测细
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消除非特异性结合FcR阻断
对于小鼠细胞需要用于 FcR阻断剂(纯化的抗 FcII/III受体抗体)减少 非特异性荧光染色；
对于人和兔细胞可以应 用纯化同种的Ig或血清 预先阻断Fc受体
20
对照的设置
细胞固定和膜穿透后，应用同一克 隆的无荧光素结合抗体处理，能够 区分细胞因子特异和非特异染色