流式细胞术实验技巧及数据分析优秀课件 (2)
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流式细胞仪讲义2ppt课件
3
PMT
1
PMT
2
Bandpass Filters
Laser
完整版课件
5
流式细胞仪的液流系统
Injector Tip
Sheath fluid
Fluorescence signals
Focused laser beam
完整版课件
6
2、控制流式细胞仪可变性的具体步骤：
A、校正激发、发射光路 B、监控检测器的灵敏度(cv) C、监控仪器电子线路的稳定性
流式细胞术实验结果的质控
完整版课件
1
获得流式细胞术实验结果 必须经历以一下步骤：
1、检测样本的获得 2、抗体染色与洗涤 3、流式细胞仪对样本的采集、存取与分析
完整版课件
2
影响流式细胞术实验结果的
主要因数:
一、仪器的可变性。 二、标本的可变性。 三、操作过程的可变性。 四、数据分析的可变性
完整版课件
完整版课件
28
在DNA直方图中鉴别细胞增殖(SPF) 与DNA 异倍体G0/1细胞峰
完整版课件
29
在DNA直方图上，二倍体G0/1细胞出现右肩峰时，先对DNA直方图作二倍体周期 分析，若SPF比率与CD71+细胞检出率接近时，则该细胞峰为增殖细胞，若SPF 比率显著高于CD71+细胞检出率时，完整则版该课右件肩峰可能为DNA异倍体细G0/1峰。 30
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19
荧光标记：FL1:CD3-FITC, FL2:CD(16-56-PE)
完整版课件
20
荧光标记：FL1:CD71.177
完整版课件
21
B、设联动门分析某些参数
完整版课件
22
4、二联体细胞对DNA含量分析的影响
PMT
1
PMT
2
Bandpass Filters
Laser
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5
流式细胞仪的液流系统
Injector Tip
Sheath fluid
Fluorescence signals
Focused laser beam
完整版课件
6
2、控制流式细胞仪可变性的具体步骤：
A、校正激发、发射光路 B、监控检测器的灵敏度(cv) C、监控仪器电子线路的稳定性
流式细胞术实验结果的质控
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1
获得流式细胞术实验结果 必须经历以一下步骤：
1、检测样本的获得 2、抗体染色与洗涤 3、流式细胞仪对样本的采集、存取与分析
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2
影响流式细胞术实验结果的
主要因数:
一、仪器的可变性。 二、标本的可变性。 三、操作过程的可变性。 四、数据分析的可变性
完整版课件
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28
在DNA直方图中鉴别细胞增殖(SPF) 与DNA 异倍体G0/1细胞峰
完整版课件
29
在DNA直方图上，二倍体G0/1细胞出现右肩峰时，先对DNA直方图作二倍体周期 分析，若SPF比率与CD71+细胞检出率接近时，则该细胞峰为增殖细胞，若SPF 比率显著高于CD71+细胞检出率时，完整则版该课右件肩峰可能为DNA异倍体细G0/1峰。 30
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19
荧光标记：FL1:CD3-FITC, FL2:CD(16-56-PE)
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20
荧光标记：FL1:CD71.177
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B、设联动门分析某些参数
完整版课件
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4、二联体细胞对DNA含量分析的影响
流式细胞术实验技巧及数据分析
流式细胞术具有高速度、高通量和高灵敏度的特点，广泛应用于生物学、医学和 生物工程领域。
流式细胞术应用领域
免疫学研究
用于检测免疫细胞表面标志物、 细胞亚群分类和功能分析等。
生殖医学研究
用于精子分析和胚胎发育监测等 。
血液学研究
用于检测白血病、淋巴瘤等血液 肿瘤细胞的表面抗原和基因表达 。
肿瘤学研究
用于检测肿瘤细胞的生长、凋亡 和转移等生物学特性。
流式细胞术实验技巧 及数据分析
日期：
• 流式细胞术简介 • 流式细胞术实验技巧 • 流式细胞术数据分析 • 流式细胞术实验问题与解决 • 流式细胞术实验案例分享
目录
Part
01
流式细胞术简介
流式细胞术定义
流式细胞术是一种在液流中快速检测和分离单个细胞的生物技术。通过将细胞悬 浮在液流中，并使用激光束照射细胞，可以测量细胞的物理和化学特性，如细胞 大小、颗粒质量和荧光标记等。
物的群体结构、进化关系和生态分布等方面。
THANKS
感谢您的观看
仪器参数，如光电倍增管
电压、滤波器等。
数据采集
3 确保数据采集的完整性和
准确性，避免丢失或重复 采集数据。
Part
03
流式细胞术数据分析
流式细胞术数据分析
• 请输入您的内容
Part
04
流式细胞术实验问题与解决
荧光补偿设置问题
总结词
荧光补偿设置是流式细胞术实验中的 重要环节，用于消除不同荧光染料间 的光谱重叠。
细胞群体识别问题
总结词
细胞群体识别是流式细胞术实验的重要环节，直接影响实验 结果的分析和解读。
详细描述
在流式细胞术实验中，需要准确识别和区分不同的细胞群体 。通过优化抗体标记组合、采用多参数分析等方法，可以提 高细胞群体识别的准确性和可靠性，为后续的数据分析和解 读提供有力支持。
流式细胞术应用领域
免疫学研究
用于检测免疫细胞表面标志物、 细胞亚群分类和功能分析等。
生殖医学研究
用于精子分析和胚胎发育监测等 。
血液学研究
用于检测白血病、淋巴瘤等血液 肿瘤细胞的表面抗原和基因表达 。
肿瘤学研究
用于检测肿瘤细胞的生长、凋亡 和转移等生物学特性。
流式细胞术实验技巧 及数据分析
日期：
• 流式细胞术简介 • 流式细胞术实验技巧 • 流式细胞术数据分析 • 流式细胞术实验问题与解决 • 流式细胞术实验案例分享
目录
Part
01
流式细胞术简介
流式细胞术定义
流式细胞术是一种在液流中快速检测和分离单个细胞的生物技术。通过将细胞悬 浮在液流中，并使用激光束照射细胞，可以测量细胞的物理和化学特性，如细胞 大小、颗粒质量和荧光标记等。
物的群体结构、进化关系和生态分布等方面。
THANKS
感谢您的观看
仪器参数，如光电倍增管
电压、滤波器等。
数据采集
3 确保数据采集的完整性和
准确性，避免丢失或重复 采集数据。
Part
03
流式细胞术数据分析
流式细胞术数据分析
• 请输入您的内容
Part
04
流式细胞术实验问题与解决
荧光补偿设置问题
总结词
荧光补偿设置是流式细胞术实验中的 重要环节，用于消除不同荧光染料间 的光谱重叠。
细胞群体识别问题
总结词
细胞群体识别是流式细胞术实验的重要环节，直接影响实验 结果的分析和解读。
详细描述
在流式细胞术实验中，需要准确识别和区分不同的细胞群体 。通过优化抗体标记组合、采用多参数分析等方法，可以提 高细胞群体识别的准确性和可靠性，为后续的数据分析和解 读提供有力支持。
流式细胞术课件
b.荧光抗体标记：使用同厂家、同批次抗体，足量、足程标记， 抗体过少或过量均会出现问题.
11
FCM使用注意事项
c.减少非特异染色：充分洗掉未结合抗体，使用间 标抗体注意非特异背景干扰（如Fc受体）.
d.每批、每步实验条件要一致：如PBS、PH值、温度 等 .
e.未固定样本在2h内，固定样本24小时内测定完毕： 避免荧光强度衰减
完成仪器设置、数据获取、统（实习1）
1.开机
2.运行FACSComp：监测仪器工作状态并记录数据
3.建立获取模板
4.调出FACSComp生成的仪器条件 5.条件优化：用阴性和单阳性样本确定电压、补偿和域值，确 定获取的目的细胞数＞10000 6.确定存储数据的地址
7.记录数据
8.分析数据：建立分析模板-调出已存储的原始数据-调整 Gate(门)或 Region(区域)-设置Marker(标尺)-显示象限统计框 （Quadrant Stats） -打印分析数据
对计数 绝对值
2）ProCOUNT：造血干/祖细胞自动化分析，报告CD34+细胞 3）HLA-B27分析软件：血液T淋巴细胞HLA-B27定量分析 4）ReticCOUNT：网织红细胞自动化分析
6
BD仪器软件
5）ModFit软件：DNA周期、倍体和凋亡的自动或手动分析 6）QuantiCALC：荧光定量分析，报告每个细胞抗体结合量 （ABC），要检测白细胞表面分化抗原和细胞活化指标 7）PAINT-A-GATE：多维参数资料分析，同时分辨显示多个 细胞群体 8）ATTRACTOR软件：多参数资料的自动快速批量分析
22
23
•DNA分析时，FSC、SSC和FL2都应使用线性模式采集信号。
•调节FL2的电压，使FL2-A的G1期细胞的峰位于200道数 的位置上。
流式细胞术实验技巧及数据分析ppt课件
FITC+T red
488
568
FITC+PeCy5 488
FITC+ ECD
488
F+P +PeCy5
488
F+ ECD +PeCy5 488
F+P +PeCy5 +APC 488
633
525 、575
绿色、橙色
525
绿色
615
红色
525、 675
绿色、 红色
525、 625
绿色、橙红色
525、575、675
17
流式细胞术操作流程：
培养细胞 新鲜组织 石蜡包埋
单细胞悬液 制备
荧光抗体标记
上机检测
表型测定 细胞分选
统 计 学 分 析
FISH PCR
继 续 培 养
18
单 分 散 细 胞
19
FSC
FSC信号的强弱与细胞的大小和活力相关
20
SSC
SSC信号的强弱与细胞内颗粒多少相关
21
细胞散色光信号
22
排除双联体细胞
27
细胞阻滞在G2M期
28
双 克 隆 细 胞 周 期 分 析
29
BrdUrd和DNA双标记染色
溴脱氧尿嘧啶核苷( Bromodeoxyuridine， BrdUrd )是胸苷的一种类似物。它可以替代
胸腺嘧啶掺入到细胞新合成的DNA分子中，成为S 期细胞的一种标记物。流式细胞术采用抗BrdUrd 单克隆抗体免疫荧光和PI双参数检测细胞，不仅 可检测一个细胞群体的动力学参数和DNA含量，同
层流是液体稳定流动的必要条件,管道中层流 的形成要满足雷诺数
流式细胞术 ppt课件
制备(如染色)无关。
✓前向角散射(FS)反映被测细胞的大小，它由 正对着流动室的光电二极管装置，接收并 转变为电信号。
✓侧向角散射(SS)反映被测细胞的细胞膜、细 胞质、核膜的折射率和细胞内颗粒的性状， 它由一个光电倍增管(PMT) 接收并转变为 电信号，这些电信号存储在流式细胞仪的 计算机硬盘或软盘内。
➢荧光信号也有两种：
✓一种是细胞自发荧光，它一般很微弱。
✓一种是细胞样本经标有特异荧光素的单克 隆抗体染色后，经激光激发发出的荧光， 它是我们要测定的荧光，荧光信号较强。
✓这两种荧光信号的同时存在是我们测定时 需要设定阴性对照的理由，以便从测出的 荧光信号中减去细胞自发荧光和抗体非特 异结合产生的荧光。
(1)单参数数据显示和分析
➢ 细胞的每一个单参数测 量数据用直方图来显示
➢ 横坐标表示散射光或荧 光信号相对强度值，其 单位是道数，可以是线 性的，也可以是对数的
➢ 纵坐标表示细胞数。
(2)双参数数据显示和分析：
➢细胞的双参数测量数据和细胞数量的关系 用一维直方图、二维点阵图、假三维地形 图、等高线图和密度图显示和分析。
✓流动室孔径有60μm、100μm、150μm 、 250μm等多种，供检测者选择。小型仪器一 般固定装置了一定孔径的流动室。
➢流动室里的鞘液流一般是稳定流动，控制鞘 液流的装置是在流体力学理论的指导下由一 系列压力系统、压力感受器组成。
➢调整好鞘液压力和标本管压力, 鞘液流包绕 样品流并使样品流保持在液流的轴线方向， 能够保证每个细胞通过激光照射区的时间相 等，从而使激光激发的荧光信息准确无误。Fra bibliotek等高线图
分别是测定细胞的两种荧光双参数数据，横坐标 和纵坐标分别代表一种荧光参数，同理只要设定 “十字门”就可得到两种荧光的各种测定值，密 度图和等高线图较点阵图更直观。
✓前向角散射(FS)反映被测细胞的大小，它由 正对着流动室的光电二极管装置，接收并 转变为电信号。
✓侧向角散射(SS)反映被测细胞的细胞膜、细 胞质、核膜的折射率和细胞内颗粒的性状， 它由一个光电倍增管(PMT) 接收并转变为 电信号，这些电信号存储在流式细胞仪的 计算机硬盘或软盘内。
➢荧光信号也有两种：
✓一种是细胞自发荧光，它一般很微弱。
✓一种是细胞样本经标有特异荧光素的单克 隆抗体染色后，经激光激发发出的荧光， 它是我们要测定的荧光，荧光信号较强。
✓这两种荧光信号的同时存在是我们测定时 需要设定阴性对照的理由，以便从测出的 荧光信号中减去细胞自发荧光和抗体非特 异结合产生的荧光。
(1)单参数数据显示和分析
➢ 细胞的每一个单参数测 量数据用直方图来显示
➢ 横坐标表示散射光或荧 光信号相对强度值，其 单位是道数，可以是线 性的，也可以是对数的
➢ 纵坐标表示细胞数。
(2)双参数数据显示和分析：
➢细胞的双参数测量数据和细胞数量的关系 用一维直方图、二维点阵图、假三维地形 图、等高线图和密度图显示和分析。
✓流动室孔径有60μm、100μm、150μm 、 250μm等多种，供检测者选择。小型仪器一 般固定装置了一定孔径的流动室。
➢流动室里的鞘液流一般是稳定流动，控制鞘 液流的装置是在流体力学理论的指导下由一 系列压力系统、压力感受器组成。
➢调整好鞘液压力和标本管压力, 鞘液流包绕 样品流并使样品流保持在液流的轴线方向， 能够保证每个细胞通过激光照射区的时间相 等，从而使激光激发的荧光信息准确无误。Fra bibliotek等高线图
分别是测定细胞的两种荧光双参数数据，横坐标 和纵坐标分别代表一种荧光参数，同理只要设定 “十字门”就可得到两种荧光的各种测定值，密 度图和等高线图较点阵图更直观。
实验九流式细胞术分析细胞凋亡和细胞周期时相资料讲解ppt课件
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
二、实验原理（continued）
膜联蛋白检测法
基于形态学观察的染色法 基于DNA 片断化的检测法
细胞凋亡检测方法
Caspase酶分析法
流式细胞仪定量分析法
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
四、实验步骤
• 收集对数生长期细胞接种于6孔培养板中，每孔1.9mL（含4×105细胞）。 • 培养过夜后，加入不同浓度的药液100μL，对照组加入同体积的高糖DMEM
液。 • 作用不同的时间后，离心收集细胞，PBS洗涤2次，体积分数为0.70的乙醇-
20℃固定24h以上。 • 离心洗去乙醇，细胞重悬于PBS中，1,500r/min，离心5min去PBS后加PI染
二、实验原理（continued）
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
二、实验原理（continued）
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
仪器：流式细胞仪，细胞培养设备，离心机，水浴，冰箱 材料：Hep-2细胞，离心管，封口膜，微量移液器，Tips 试剂： 70％乙醇（保存于4℃），RNase-A （10mg/ml,-
20℃保存），PI （650µg/ml，避光保存于-20℃）， PBS(pH 7.4，保存于4℃)
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
流式细胞术PPT课件
电荷式分选
lasers
–超声振动器(15-100kHz)
–液流充电系统
–高压偏转板
–收集装置(流式管、培养板)
断裂点(充电) 高压偏转板
29
四路分选原理
电荷式分选装置
30
分选指标
• 分选时间由三方面决定：进样速度、目标细胞所占比例、 需要收集的细胞数。
需要细胞数
目标细胞所占比例(%)
1
5
50
104
• Hoechst（343, 450）常见为Hoechst33342和Hoechst33258，非嵌入的 方式与DNA链上的A-T碱基对结合。能对活细胞染色，用于活细胞 DNA定量分析，如精子分选；还用于侧群细胞的分选。
• PY（派若宁 560, 573） RNA染料，能进入活细胞。
• AO（吖啶橙 509, 525） DNA、RNA染料，染色后DNA呈黄绿色荧光， RNA呈橙黄色荧光，可进行DNA/RNA双参数分析。
• 多色标记荧光素搭配原则：每个通道只能选择一种荧光素； 各个通道之间的荧光素可以随意搭配。
FACSCalibur常用四色搭配：FITC、PE、PerCP、APC。
33
B 根据抗原表达强弱合理选择 抗体
• 不同的荧光素强度有所不同；
CD5
• 高表达的抗原可用不太“亮” 的染料，更“亮”的荧光素分 配给表达低的抗原：
99%以上。 • 分选收获率是指被分选出的细胞与原来总细胞的百分比。 • 分选纯度和收获率永远是相互矛盾的，纯度提高，收获率
降低，反之亦然。
– 富集模式(enrich mode) – 纯化模式(purify mode) – 单细胞模式(single cell mode)
流式细胞术精品PPT课件
4
四、 流式细胞术的应用
1 细胞DNA含量检测：
细胞固定后用PI染色，因为PI特 异性结合于细胞DNA，荧光强度与PI 的结合量呈良好的线性关系，根据这 个原理，并通过专用的DNA分析软件， 可测出细胞的DNA含量。用于细胞周 期、细胞倍体以及凋亡的检测。
5
• 肿瘤诊断：
•
DNA异倍体的出现是癌变的一个重
• 一、 流式细胞术的概念 流式细胞术（FCM）就是对在的鞘
液包括下的细胞、粒子进行分析和分选 的技术，这种细胞或粒子是经过特异荧 光标记的。其特点是测量速度快，每秒 钟能测数千个乃至上万个细胞，且可进 行多参数测量，另一特点是在分析的同 时可把具有指定特征的细胞分离出来， 这就是分选技术。
1
二、流式细胞仪的工作原理
产生及发展，现在CD系统已有247种之多。
细胞用带有荧光的单克隆抗体标记后，用
流式细胞仪可对其进行检测分析，可分析
出荧光细胞的含量，也可分析出这种阳性
细胞的CD分子的相对含量。标记的方法一
般用直标法，也可用间标法。荧光探针多
为FITC、PE、PE-CY5、PerCP、CY5、
APC等。
9
淋巴细胞分类：
•
红细胞表面CD59缺失
18
5 细胞内蛋白的分析：
•
细胞破膜后将细胞内某一蛋白成分进行荧
光标记，用流式细胞仪进行测量分析，同表型
分析一样，可以测量出这种阳性细胞的数量和
这种蛋白的相对含量。并且，结合细胞表型分
析，进行多标记和多参数分析，可以检测出含
这种蛋白的细胞是属于哪一种表型的细胞。多
用间标法，荧光探针多为FITC。也可以与周期
27
•
流式细胞仪对一个样品提供的结果是否可
四、 流式细胞术的应用
1 细胞DNA含量检测：
细胞固定后用PI染色，因为PI特 异性结合于细胞DNA，荧光强度与PI 的结合量呈良好的线性关系，根据这 个原理，并通过专用的DNA分析软件， 可测出细胞的DNA含量。用于细胞周 期、细胞倍体以及凋亡的检测。
5
• 肿瘤诊断：
•
DNA异倍体的出现是癌变的一个重
• 一、 流式细胞术的概念 流式细胞术（FCM）就是对在的鞘
液包括下的细胞、粒子进行分析和分选 的技术，这种细胞或粒子是经过特异荧 光标记的。其特点是测量速度快，每秒 钟能测数千个乃至上万个细胞，且可进 行多参数测量，另一特点是在分析的同 时可把具有指定特征的细胞分离出来， 这就是分选技术。
1
二、流式细胞仪的工作原理
产生及发展，现在CD系统已有247种之多。
细胞用带有荧光的单克隆抗体标记后，用
流式细胞仪可对其进行检测分析，可分析
出荧光细胞的含量，也可分析出这种阳性
细胞的CD分子的相对含量。标记的方法一
般用直标法，也可用间标法。荧光探针多
为FITC、PE、PE-CY5、PerCP、CY5、
APC等。
9
淋巴细胞分类：
•
红细胞表面CD59缺失
18
5 细胞内蛋白的分析：
•
细胞破膜后将细胞内某一蛋白成分进行荧
光标记，用流式细胞仪进行测量分析，同表型
分析一样，可以测量出这种阳性细胞的数量和
这种蛋白的相对含量。并且，结合细胞表型分
析，进行多标记和多参数分析，可以检测出含
这种蛋白的细胞是属于哪一种表型的细胞。多
用间标法，荧光探针多为FITC。也可以与周期
27
•
流式细胞仪对一个样品提供的结果是否可
流式细胞仪结果分析课件PPT
何形成单个细胞流）
免疫胶乳颗粒的应用即液相芯片技术是把微小的乳胶微球分别染成上百种不同的荧光色，把针对不同检测物的乳胶微球混地结合，经激光照射后不同待测特产生不同颜色，并可进行定量分析。
易与标记单抗结合而不影响抗体的特异性
光束成形器：两十字交叉放置的透镜
前向散射光（forward scatter, FS）：激光束照射细胞时，光以相对轴较小角度(0. 乙醇或甲醇保存法（2周）
区阈（region, R）与门(gate, G ) 是两个相关的概念，区阈可与门对应，但是也可以包含于门。 用计算机系统对流动的单细胞悬液中单个细胞的多个参数信号进行数据处理分析，保证了检测速度与统计分析精确性。 D3 CD4- /CD3-
• 多参数分析 免疫胶乳颗粒的应用即液相芯片技术是把微小的乳胶微球分别染成上百种不同的荧光色，把针对不同检测物的乳胶微球混合后再加入
二维等高图 光电倍增管：FS, SS（散射光）， FL1, FL2, FL3, FL4（荧光）
流式细胞仪常检测的细胞特性 （二）免疫荧光染色的质控
假三维等高图 假三维等高图
由一维参数(散射光或荧光)与颗粒计数(COUNT)构成，反映同样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。 三、免疫胶乳颗粒技术的应用
• 三参数直方图 同型对照：即免疫荧光标记中的阴性对照，选用相同源性的未标记单抗作为对照调整和设置电压，以保证特异性。
同型对照为免疫荧光标记中的阴性对照，可使荧光标记单抗的信号保持其特异性。 流式细胞仪的基本结构：
• 双参数直方图:点图 光束成形器：两十字交叉放置的透镜
流式细胞仪分析中前向散射光、侧向散射光和荧光的检测意义。 用计算机系统对流动的单细胞悬液中单个细胞的多个参数信号进行数据处理分析，保证了检测速度与统计分析精确性。
流式细胞术的原理及应用ppt课件
➢可把感兴趣细胞分 选到特定培养孔或板 上（4路和24孔板）
➢适用于高速分选和 多色分析
6
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
流式细胞仪检测范围
细胞大小
细胞粒度
细 细胞表面面积
胞 结
核浆比例
构 DNA含量与细胞周期
18
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
散射光
它反应细胞的物理特性,根据前侧向散射光，可以把不同 类型的细胞群加以区分
FSC（小角散射光)它反 应细胞的相对大小和截 面积的大小
SSC (90度角散射光)代 表细胞的颗粒度和精细 结构的变化
1.液流系统： 细胞悬液被吸入检测室后，在鞘液
(sheath)的约束下，通过喷嘴，使其形成单细 胞悬液。
10
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
2.光学系统： 激光是较常用的光源, 稳定性好、单色性好。 散射光和荧光信号被收集、处理转化为数字信号。
FACS Vantage DiVa
科研型（大型机）
特点： ➢多数字化 ➢适用于各类细胞分选 ➢4路分选
5
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
FACSAria
科研型
特点： ➢分辨率高
➢选配多种波长和类 型激光器
成,将产生的光信号引导至检测器
➢适用于高速分选和 多色分析
6
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
流式细胞仪检测范围
细胞大小
细胞粒度
细 细胞表面面积
胞 结
核浆比例
构 DNA含量与细胞周期
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在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
散射光
它反应细胞的物理特性,根据前侧向散射光，可以把不同 类型的细胞群加以区分
FSC（小角散射光)它反 应细胞的相对大小和截 面积的大小
SSC (90度角散射光)代 表细胞的颗粒度和精细 结构的变化
1.液流系统： 细胞悬液被吸入检测室后，在鞘液
(sheath)的约束下，通过喷嘴，使其形成单细 胞悬液。
10
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
2.光学系统： 激光是较常用的光源, 稳定性好、单色性好。 散射光和荧光信号被收集、处理转化为数字信号。
FACS Vantage DiVa
科研型（大型机）
特点： ➢多数字化 ➢适用于各类细胞分选 ➢4路分选
5
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
FACSAria
科研型
特点： ➢分辨率高
➢选配多种波长和类 型激光器
成,将产生的光信号引导至检测器
流式细胞术ppt课件
可区分高FL细胞与低FL细胞。 一般的流式细胞仪装有一个激光光源（488nm），可
测出三个FL，即FL1、FL2、FL3，大型的流式细胞仪 装有三个激光光源（488nm、633nm和407nm），可测 出13个FL。
2、荧光信号
双色直接染色
二、荧光染料的选择
选择荧光染料要考虑: 1、流式细胞仪配置的激光可否激发该荧光染料； 2、流式细胞仪可否检测该荧光染料的发射波长； 3、使用多种荧光染料时，要考虑荧光染料之间的干扰。
二、荧光染料的选择
颜色补偿
➢荧光染料的发射波长范围一般宽于检测器检测到的波 长范围；检测范围之外的波长可能会进入相邻的检测器 被检测，从而造成荧光信号之间的干扰。流式细胞仪可 以通过“颜色补偿”校正这一干扰。 ➢ 单标管用于调补偿。
Fluorescein (FITC)
300 nm
400 nm
Excitation
500 nm
Wavelength
Emisson
600 nm
700 nm
400 nm
500 nm
600 nm
700 nm
Protein
Phycoerytherin (PE)
300 nm 400 nm
Excitation Emisson
500 nm
600 nm
700 nm
Protein
FITC和PE荧光光谱
直接染色
间接染色
样品制备过程中常见的问题及解决对策
常见问题 细胞密度低 非特异荧光
强
碎片多 细胞聚集
荧光弱
原因 细胞损失 抗体不纯、死细胞多
细胞死亡、机械损伤 消化不完全
抗体少、反应时间短
解决对策 增加离心时间、弃上清 选择纯度高的抗体、用同型 对照抗体或双标记排除非特
测出三个FL，即FL1、FL2、FL3，大型的流式细胞仪 装有三个激光光源（488nm、633nm和407nm），可测 出13个FL。
2、荧光信号
双色直接染色
二、荧光染料的选择
选择荧光染料要考虑: 1、流式细胞仪配置的激光可否激发该荧光染料； 2、流式细胞仪可否检测该荧光染料的发射波长； 3、使用多种荧光染料时，要考虑荧光染料之间的干扰。
二、荧光染料的选择
颜色补偿
➢荧光染料的发射波长范围一般宽于检测器检测到的波 长范围；检测范围之外的波长可能会进入相邻的检测器 被检测，从而造成荧光信号之间的干扰。流式细胞仪可 以通过“颜色补偿”校正这一干扰。 ➢ 单标管用于调补偿。
Fluorescein (FITC)
300 nm
400 nm
Excitation
500 nm
Wavelength
Emisson
600 nm
700 nm
400 nm
500 nm
600 nm
700 nm
Protein
Phycoerytherin (PE)
300 nm 400 nm
Excitation Emisson
500 nm
600 nm
700 nm
Protein
FITC和PE荧光光谱
直接染色
间接染色
样品制备过程中常见的问题及解决对策
常见问题 细胞密度低 非特异荧光
强
碎片多 细胞聚集
荧光弱
原因 细胞损失 抗体不纯、死细胞多
细胞死亡、机械损伤 消化不完全
抗体少、反应时间短
解决对策 增加离心时间、弃上清 选择纯度高的抗体、用同型 对照抗体或双标记排除非特
流式细胞仪分析技术及应用PPT课件
49
（四）石蜡包埋组织单细胞悬液制备 该制备方法的建立扩大了流式细胞术的应
用范围，有利于进行临床回顾性研究和利 用。 常用的方法有二甲苯脱蜡法、组织清洁剂 脱蜡法和甲氧-双氧水处理法。 对石蜡切片的要求较严格。
50
（五）活检标本单细胞悬液制备 活检标本及各种内镜取材标本也克制备成
能对于处在快速直线流动状态 中的细胞或生物颗粒同时进行 多参数、快速定量分析和分选
5
一、流式细胞仪分析的工作原理
荧光显微镜技术
激发光源改为激光
单克隆抗体与 荧光染料技术
计算机技术 处理光信号
提高检测灵敏度 和特异性
提高检测速度和 统计分析精确性
6
（一）流式细胞仪基本结构
液流系统
1
包括流动室（flow chamber）和液流驱动系统 作用：依次传送待测样本中的细胞到激光照射区 理想状态：细胞逐个传送到激光束的中心，而且
侧向散射光检测器
在激光束的垂直方 向，又称90°散射
SSC信号的强弱与 细胞内颗粒结构的 质量成正比，用于 检测细胞内部结构 属性
28
前向散射光示意图
细胞大小
29
结构复杂程度
侧向散射光示意图
30
当荧光抗体或其他染料染色的颗粒通过 激光束时，染料吸收光子跃迁到激发态，返 回基态时，染料释放出能量，大部分以光的 形式释放。
分选的方式有捕获式分选和电荷式分选，目前应 用最多的是电荷式分选。
21
电荷式分选1
当单细胞悬液形成液柱通过 流动室时，液柱被分割成一 连串均匀的液滴。
根据设定的被分选细胞的某 个参数由逻辑电路判断是否 被分选。
22
电荷式分选2
充电电路对选定细胞液滴充 电，使其带正电荷或负电荷， 未被设定分选参数的细胞液 滴则不带电荷。
（四）石蜡包埋组织单细胞悬液制备 该制备方法的建立扩大了流式细胞术的应
用范围，有利于进行临床回顾性研究和利 用。 常用的方法有二甲苯脱蜡法、组织清洁剂 脱蜡法和甲氧-双氧水处理法。 对石蜡切片的要求较严格。
50
（五）活检标本单细胞悬液制备 活检标本及各种内镜取材标本也克制备成
能对于处在快速直线流动状态 中的细胞或生物颗粒同时进行 多参数、快速定量分析和分选
5
一、流式细胞仪分析的工作原理
荧光显微镜技术
激发光源改为激光
单克隆抗体与 荧光染料技术
计算机技术 处理光信号
提高检测灵敏度 和特异性
提高检测速度和 统计分析精确性
6
（一）流式细胞仪基本结构
液流系统
1
包括流动室（flow chamber）和液流驱动系统 作用：依次传送待测样本中的细胞到激光照射区 理想状态：细胞逐个传送到激光束的中心，而且
侧向散射光检测器
在激光束的垂直方 向，又称90°散射
SSC信号的强弱与 细胞内颗粒结构的 质量成正比，用于 检测细胞内部结构 属性
28
前向散射光示意图
细胞大小
29
结构复杂程度
侧向散射光示意图
30
当荧光抗体或其他染料染色的颗粒通过 激光束时，染料吸收光子跃迁到激发态，返 回基态时，染料释放出能量，大部分以光的 形式释放。
分选的方式有捕获式分选和电荷式分选，目前应 用最多的是电荷式分选。
21
电荷式分选1
当单细胞悬液形成液柱通过 流动室时，液柱被分割成一 连串均匀的液滴。
根据设定的被分选细胞的某 个参数由逻辑电路判断是否 被分选。
22
电荷式分选2
充电电路对选定细胞液滴充 电，使其带正电荷或负电荷， 未被设定分选参数的细胞液 滴则不带电荷。
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液流驱动系统（示意图）
流速与压力的关系服从Bernoulli方程，即 P=(1/2)V2 (忽略高度的变化)。改变气压,就可获得不同的流速。
低速
高速
不同样本速率形成的样本流
激发光源与光束成形系统
光
束
聚焦距离
成
形 激光束
与
细
聚焦透镜
胞
受
照
方
.
这种椭圆形
20um 光斑的检测
区保证每个
64um
细胞分别受
纯化单核细胞
调节性T细胞检测
G3=R1*R3 G4=R1*R4
凋亡细胞测定
凋亡细胞测定
细胞凋亡检测
阴性的设置
血 小 板 检 测
血 小 板 检 测
排除双联体细胞
细胞阻滞在G2M期
双 克 隆 细 胞 周 期 分 析
BrdUrd和DNA双标记染色
溴脱氧尿嘧啶核苷( Bromodeoxyuridine， BrdUrd )是胸苷的一种类似物。它可以替代
胸腺嘧啶掺入到细胞新合成的DNA分子中，成为S 期细胞的一种标记物。流式细胞术采用抗BrdUrd 单克隆抗体免疫荧光和PI双参数检测细胞，不仅 可检测一个细胞群体的动力学参数和DNA含量，同
细胞散色光信号
细胞荧光测量
细胞的自发荧光 未经染色的样品细胞
在激发光的照射下可测到有微弱的荧 光信号.
细胞的特异性荧光 经过各种特异染色的
细胞在激发光的照射下可测到较强的荧光 信号.
自发荧光信号与特异染色的荧光信号分析图 自 发 荧 光 信 号
特 异 染 色 的 荧 光 信 号
DNA分析比较
时可以了解不同细胞的DNA合成能力高低。
BrdUrd与PI检测
光 检 测
细胞因子测定
*检测T细胞(CD69)活化
G6=R1*R5
*CD4抗原分子结构引起CD4荧光强度下调
细胞因子分析图
*过敏性鼻息肉与鼻息肉细胞因子比较
流式细胞术实验技 巧及数据分析
一 流式细胞仪的基本原理
*稳定流动 *激发光斑 *荧光补偿 *荧光素选择
二 数据分析及开窗
FCM原理示意图
层流技术
层流是液体稳定流动的必要条件,管道中层流 的形成要满足雷诺数
dρV Re = < 2300，
η 式中ρ、η分别为液体的密度和粘滞系数，d和 V分别为管道的直径和液体的平均流速。FCM 利用层流技术,使细胞流动稳定,并具有自聚焦 作用,为细胞分析分选提供技术保证.
到光照且受
检时受到一
强度
式
致的光照
FCM的单细
32um 0 32um
胞照明技术
荧 光 光 谱 重
FITC和PE荧光光谱重叠
荧
Uncompensated vs Compensated
光
补
偿
FL2
FL1
利用电子技术或计算机软件等方法将串入相邻
荧光通道的信号加以扣除的方法称“荧光补偿”
荧光补偿
Mean值判断补偿
双或多参数荧光抗体的组合标记
荧光染料
激发波长（nm) 发射波长（nm)
颜色
FITC+PE
488
FITC+T red
488
568
FITC+PeCy5 488
FITC+ ECD
488
F+P +PeCy5
488
F+ ECD +PeCy5 488
F+P +PeCy5 +APC 488
633
525 、575
绿色、橙色
525
绿色
615
红色
525、 675
绿色、 红色
525、 625
绿色、橙红色
525、575、675
绿、橙、红色
525、575、675 绿、橙红色、红色
525 、 575 绿色、橙色
670
红色
能量传递染料：
用化学法将两种不同激发波长的染料结合在一 起，在488nm波长激发光激发后产生的发射波长 激发另一荧光染料产生的荧光信号。
Laser
488nm
ECD 620
PE CY5 670
CY7 755
流式细胞术操作流程：
培养细胞 新鲜组织 石蜡包埋
单细胞悬液 制备
荧光抗体标记
上机检测
表型测定 细胞分选
统 计 学 分 析
FISH PCR
继 续 培 养
单 分 散 细 胞
FSC
FSC信号的强弱与细胞的大小和活力相关
SSC
SSC信号的强弱与细胞内颗粒多少相关