流式细胞检测 ppt课件
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
流式细胞检测
流式细胞技术
FLOW CYTOMETRY
2015-07-07
What does it mean?
CYTOMETRY
Cell Measure(ment)
MEASUREMENT OF A CELL
FLOW CYTOMETRY ：在液流系统中，快速测定单个细 胞或微粒的物理特性和生化特性的方法。 Flow Cytometer (FCM) – 流式细胞仪 Flow Sorter – 流式细胞分选仪
微毛细管流动池
20mm 50-100mm
Flow Rate = 0.1 - 1 ul / second
0.1mm
Probe Volume = 200 pl
Volume = 200nl
Volume = 0.03 Volume = 0.02 Volume = 0.01
9
光学系统
FCM的光学系统是由若干组透镜、滤光片、小孔组成。
~520nm emission
FITC-labeled antibody binds surface antigen
荧光信号
➢ 线性放大——DNA、RNA、总蛋白质含量等的检测。 ➢ 对数放大——抗原检测等。 ➢ 荧光信号的面积(FL2－A)——准确反映DNA的含量。 ➢ 荧光信号的宽度(FL2－W)——常用来区分双联体细胞。
Scatter – How it works
Laser Light
Laser Light
Laser Light
SSC 粒细胞 FSC
SSC 单核细胞 FSC
SSC 淋巴细胞 FSC
Side Scatter
0 200 400 600 800 1000
Forward Scatter
荧光信号
488nm excitation
6
工作流程
❖样本制备 ❖荧光染色 ❖上样检测 ❖数据分析
Y
+
Cell Suspension
7
Fluorescently Labelled Antibody
Histogram
Blue Laser (488 nm)
Fluorescence Detector
Fluorescence
Single Cell Suspension
3
流式细胞仪
BD FACSVantage
BD Calibur
Guava 5HT 微毛细管细胞分析仪
BECKMAN CytoFLEX
4
Miltenyi MACSQuant
流式细胞仪的组成
Fluidics
Waste
Optics
Electronics
Software
5
进样准备
样品规格： 96孔板 或 1.5 mL 小管
12
软件系统
13
InCyte 开放模块- Flexibility
整合多组 数据
分析方式 灵活
14
R1
拖曳式设门，操
Biblioteka Baidu
作简单易学
R2
多种Plot 以供选择
Work Station
Min/Max threshold
Heat-Map数据 分析直观化
测量参数
光散射强度 荧光强度 样本体积 细胞数目
前向散射角和侧向散射角
Longpass
460 500 540
Shortpass
460 500 540
Bandpass
460 500 540
LP 500
SP 500
BP 500/50
LP 500 = >500 nm SP 500 = <500 nm BP 500/50 = 475 nm – 525 nm
10
easyCyte 5HT system
PM2 (Red) PM3 (Green)
PE-Cy5 7-AAD
FITC
LDS751
GFP CFSE
直方图和点阵图
直方图(Histogram Plot) ——单参数分析. ▪X-Axis: 荧光信号强度. ▪Y-Axis: 细胞数目.
点阵图(Dot Plot) ——双参数分析. ▪X and Y axis：两种荧光信号强度. ▪每个点代表一个细胞.
Log & Lin:荧光强度的坐标可以是线性的，也可以是对数的.
侧向散射角
虽然也与细胞的形状与大小有关， 但是它对细胞膜、胞质、核膜的， 折射率更敏感。
前向散射角
Incident laser light
“大小”
成正比例关系: • 截面积大小 • 折射率 • 细胞形状
FSC: Forward angle light scatter – 区分细胞与细胞碎片
SSC: Side-angle (90) light scatter – 在细胞大小相同的情况下，区分不同的细胞种类。
21
常见荧光素： A. FITC(异硫氰酸荧光素）：绿色 530nm B. PE（藻红蛋白）：橙黄色 575nm C. PerCP(多甲藻黄素叶绿素蛋白）：深红色 675nm D. PI(碘化丙啶）：橙红色 620nm E. APC(别藻兰蛋白）：红色 660nm
抗体的选择： ➢ 首选直接标记抗体 荧光分子强度：APC >PE >PerCP >FITC
PE较强，适用于弱表达抗原 FITC最便宜，适用于强表达抗原
22
常见荧光物质的应用
Fluorophores Conjugated to an Ab
Dead Cell Dyes (DNA staining)
PM1 (Orange) Add nm PE
PI
Live Cell Dye (DNA Staining) Fluorescent Proteins Cell Tracking Dyes
激发光: 75 mW Blue Laser (488 nm)
检测荧光通道： Forward Scatter – FSC Side Scatter – SSC Green – 525/30 nm Yellow – 583/26 nm Red1 – 680/30 nm
11
电子器件
检测器 、光电二极管、光电培增管 功能: 1) 量化电压脉冲 2) 将模型信号转换 成数字信号 3) 荧光补偿 4) 数据传给电脑以 便分析
液流系统
功能：传送待测样本中的细胞到激光照射区。 样本：0.2-150微米的粒子，最快可在1秒种内计测数万个细胞。
No Sheath Fluid Waste： <10ml /hr run 2千—1万 cells/Test
Sheath Fluid: ~10 mL/Test Waste：1L / hr run 10万—100万cells/Test
流式细胞技术
FLOW CYTOMETRY
2015-07-07
What does it mean?
CYTOMETRY
Cell Measure(ment)
MEASUREMENT OF A CELL
FLOW CYTOMETRY ：在液流系统中，快速测定单个细 胞或微粒的物理特性和生化特性的方法。 Flow Cytometer (FCM) – 流式细胞仪 Flow Sorter – 流式细胞分选仪
微毛细管流动池
20mm 50-100mm
Flow Rate = 0.1 - 1 ul / second
0.1mm
Probe Volume = 200 pl
Volume = 200nl
Volume = 0.03 Volume = 0.02 Volume = 0.01
9
光学系统
FCM的光学系统是由若干组透镜、滤光片、小孔组成。
~520nm emission
FITC-labeled antibody binds surface antigen
荧光信号
➢ 线性放大——DNA、RNA、总蛋白质含量等的检测。 ➢ 对数放大——抗原检测等。 ➢ 荧光信号的面积(FL2－A)——准确反映DNA的含量。 ➢ 荧光信号的宽度(FL2－W)——常用来区分双联体细胞。
Scatter – How it works
Laser Light
Laser Light
Laser Light
SSC 粒细胞 FSC
SSC 单核细胞 FSC
SSC 淋巴细胞 FSC
Side Scatter
0 200 400 600 800 1000
Forward Scatter
荧光信号
488nm excitation
6
工作流程
❖样本制备 ❖荧光染色 ❖上样检测 ❖数据分析
Y
+
Cell Suspension
7
Fluorescently Labelled Antibody
Histogram
Blue Laser (488 nm)
Fluorescence Detector
Fluorescence
Single Cell Suspension
3
流式细胞仪
BD FACSVantage
BD Calibur
Guava 5HT 微毛细管细胞分析仪
BECKMAN CytoFLEX
4
Miltenyi MACSQuant
流式细胞仪的组成
Fluidics
Waste
Optics
Electronics
Software
5
进样准备
样品规格： 96孔板 或 1.5 mL 小管
12
软件系统
13
InCyte 开放模块- Flexibility
整合多组 数据
分析方式 灵活
14
R1
拖曳式设门，操
Biblioteka Baidu
作简单易学
R2
多种Plot 以供选择
Work Station
Min/Max threshold
Heat-Map数据 分析直观化
测量参数
光散射强度 荧光强度 样本体积 细胞数目
前向散射角和侧向散射角
Longpass
460 500 540
Shortpass
460 500 540
Bandpass
460 500 540
LP 500
SP 500
BP 500/50
LP 500 = >500 nm SP 500 = <500 nm BP 500/50 = 475 nm – 525 nm
10
easyCyte 5HT system
PM2 (Red) PM3 (Green)
PE-Cy5 7-AAD
FITC
LDS751
GFP CFSE
直方图和点阵图
直方图(Histogram Plot) ——单参数分析. ▪X-Axis: 荧光信号强度. ▪Y-Axis: 细胞数目.
点阵图(Dot Plot) ——双参数分析. ▪X and Y axis：两种荧光信号强度. ▪每个点代表一个细胞.
Log & Lin:荧光强度的坐标可以是线性的，也可以是对数的.
侧向散射角
虽然也与细胞的形状与大小有关， 但是它对细胞膜、胞质、核膜的， 折射率更敏感。
前向散射角
Incident laser light
“大小”
成正比例关系: • 截面积大小 • 折射率 • 细胞形状
FSC: Forward angle light scatter – 区分细胞与细胞碎片
SSC: Side-angle (90) light scatter – 在细胞大小相同的情况下，区分不同的细胞种类。
21
常见荧光素： A. FITC(异硫氰酸荧光素）：绿色 530nm B. PE（藻红蛋白）：橙黄色 575nm C. PerCP(多甲藻黄素叶绿素蛋白）：深红色 675nm D. PI(碘化丙啶）：橙红色 620nm E. APC(别藻兰蛋白）：红色 660nm
抗体的选择： ➢ 首选直接标记抗体 荧光分子强度：APC >PE >PerCP >FITC
PE较强，适用于弱表达抗原 FITC最便宜，适用于强表达抗原
22
常见荧光物质的应用
Fluorophores Conjugated to an Ab
Dead Cell Dyes (DNA staining)
PM1 (Orange) Add nm PE
PI
Live Cell Dye (DNA Staining) Fluorescent Proteins Cell Tracking Dyes
激发光: 75 mW Blue Laser (488 nm)
检测荧光通道： Forward Scatter – FSC Side Scatter – SSC Green – 525/30 nm Yellow – 583/26 nm Red1 – 680/30 nm
11
电子器件
检测器 、光电二极管、光电培增管 功能: 1) 量化电压脉冲 2) 将模型信号转换 成数字信号 3) 荧光补偿 4) 数据传给电脑以 便分析
液流系统
功能：传送待测样本中的细胞到激光照射区。 样本：0.2-150微米的粒子，最快可在1秒种内计测数万个细胞。
No Sheath Fluid Waste： <10ml /hr run 2千—1万 cells/Test
Sheath Fluid: ~10 mL/Test Waste：1L / hr run 10万—100万cells/Test