流式细胞术实验技巧及数据分析(ppt)
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临床医学技术培训PPT流式细胞术技术(1)
收集数据，进行定量和定性分 析。
流式细胞术的检测原理
细胞染色
使用荧光染料标记细胞 表面的抗原或内部的分
子。
细胞悬浮
将细胞悬浮在液流中， 通过喷嘴引入检测区域
。
激光照射
激光束照射细胞，激发 荧光染料发出荧光。
信号检测
检测器收集荧光和散射 光信号，转化为电信号
。
荧光染料的种类与选择
荧光染料种类
有异硫氰酸荧光素(FITC)、藻红蛋白 (PE)、罗丹明(Rhodamine)等。
疫苗研发
用于监测疫苗接种后免疫 细胞的反应和变化，评估 疫苗的有效性和安全性。
流式细胞术的发展历程
19世纪末期
流式细胞术的初步设想诞生。
20世纪60年代
第一代流式细胞仪问世，可以进行简单的 细胞计数和大小测量。
20世纪80年代
21世纪初
第二代流式细胞仪出现，引入荧光染色和 多参数检测技术，提高了检测的灵敏度和 特异性。
特点
具有高速度、高精度和高通量等 优点，能够同时检测多个细胞参 数，广泛应用于临床医学、生物 学和生物医学研究中。
流式细胞术的应用领域
01
02
03
临床诊断
用于检测血液系统疾病、 免疫系统疾病和肿瘤等， 如白血病、淋巴瘤和实体 瘤的分类和分型。
生物研究
用于研究细胞生长、分化 、凋亡和免疫应答等生物 学过程，以及药物筛选和 基因表达分析等。
荧光染料选择
根据抗原特异性和实验需求选择合适 的荧光染料，确保特异性标记和最佳 信号强度。
03
流式细胞术实验技术
样本的制备与保存
01
02
03
04
血液样本
采集静脉血液，使用抗凝剂， 避免溶血和细菌污染。
流式细胞术的检测原理
细胞染色
使用荧光染料标记细胞 表面的抗原或内部的分
子。
细胞悬浮
将细胞悬浮在液流中， 通过喷嘴引入检测区域
。
激光照射
激光束照射细胞，激发 荧光染料发出荧光。
信号检测
检测器收集荧光和散射 光信号，转化为电信号
。
荧光染料的种类与选择
荧光染料种类
有异硫氰酸荧光素(FITC)、藻红蛋白 (PE)、罗丹明(Rhodamine)等。
疫苗研发
用于监测疫苗接种后免疫 细胞的反应和变化，评估 疫苗的有效性和安全性。
流式细胞术的发展历程
19世纪末期
流式细胞术的初步设想诞生。
20世纪60年代
第一代流式细胞仪问世，可以进行简单的 细胞计数和大小测量。
20世纪80年代
21世纪初
第二代流式细胞仪出现，引入荧光染色和 多参数检测技术，提高了检测的灵敏度和 特异性。
特点
具有高速度、高精度和高通量等 优点，能够同时检测多个细胞参 数，广泛应用于临床医学、生物 学和生物医学研究中。
流式细胞术的应用领域
01
02
03
临床诊断
用于检测血液系统疾病、 免疫系统疾病和肿瘤等， 如白血病、淋巴瘤和实体 瘤的分类和分型。
生物研究
用于研究细胞生长、分化 、凋亡和免疫应答等生物 学过程，以及药物筛选和 基因表达分析等。
荧光染料选择
根据抗原特异性和实验需求选择合适 的荧光染料，确保特异性标记和最佳 信号强度。
03
流式细胞术实验技术
样本的制备与保存
01
02
03
04
血液样本
采集静脉血液，使用抗凝剂， 避免溶血和细菌污染。
流式细胞术实验技巧及数据分析
流式细胞术具有高速度、高通量和高灵敏度的特点，广泛应用于生物学、医学和 生物工程领域。
流式细胞术应用领域
免疫学研究
用于检测免疫细胞表面标志物、 细胞亚群分类和功能分析等。
生殖医学研究
用于精子分析和胚胎发育监测等 。
血液学研究
用于检测白血病、淋巴瘤等血液 肿瘤细胞的表面抗原和基因表达 。
肿瘤学研究
用于检测肿瘤细胞的生长、凋亡 和转移等生物学特性。
流式细胞术实验技巧 及数据分析
日期：
• 流式细胞术简介 • 流式细胞术实验技巧 • 流式细胞术数据分析 • 流式细胞术实验问题与解决 • 流式细胞术实验案例分享
目录
Part
01
流式细胞术简介
流式细胞术定义
流式细胞术是一种在液流中快速检测和分离单个细胞的生物技术。通过将细胞悬 浮在液流中，并使用激光束照射细胞，可以测量细胞的物理和化学特性，如细胞 大小、颗粒质量和荧光标记等。
物的群体结构、进化关系和生态分布等方面。
THANKS
感谢您的观看
仪器参数，如光电倍增管
电压、滤波器等。
数据采集
3 确保数据采集的完整性和
准确性，避免丢失或重复 采集数据。
Part
03
流式细胞术数据分析
流式细胞术数据分析
• 请输入您的内容
Part
04
流式细胞术实验问题与解决
荧光补偿设置问题
总结词
荧光补偿设置是流式细胞术实验中的 重要环节，用于消除不同荧光染料间 的光谱重叠。
细胞群体识别问题
总结词
细胞群体识别是流式细胞术实验的重要环节，直接影响实验 结果的分析和解读。
详细描述
在流式细胞术实验中，需要准确识别和区分不同的细胞群体 。通过优化抗体标记组合、采用多参数分析等方法，可以提 高细胞群体识别的准确性和可靠性，为后续的数据分析和解 读提供有力支持。
流式细胞术应用领域
免疫学研究
用于检测免疫细胞表面标志物、 细胞亚群分类和功能分析等。
生殖医学研究
用于精子分析和胚胎发育监测等 。
血液学研究
用于检测白血病、淋巴瘤等血液 肿瘤细胞的表面抗原和基因表达 。
肿瘤学研究
用于检测肿瘤细胞的生长、凋亡 和转移等生物学特性。
流式细胞术实验技巧 及数据分析
日期：
• 流式细胞术简介 • 流式细胞术实验技巧 • 流式细胞术数据分析 • 流式细胞术实验问题与解决 • 流式细胞术实验案例分享
目录
Part
01
流式细胞术简介
流式细胞术定义
流式细胞术是一种在液流中快速检测和分离单个细胞的生物技术。通过将细胞悬 浮在液流中，并使用激光束照射细胞，可以测量细胞的物理和化学特性，如细胞 大小、颗粒质量和荧光标记等。
物的群体结构、进化关系和生态分布等方面。
THANKS
感谢您的观看
仪器参数，如光电倍增管
电压、滤波器等。
数据采集
3 确保数据采集的完整性和
准确性，避免丢失或重复 采集数据。
Part
03
流式细胞术数据分析
流式细胞术数据分析
• 请输入您的内容
Part
04
流式细胞术实验问题与解决
荧光补偿设置问题
总结词
荧光补偿设置是流式细胞术实验中的 重要环节，用于消除不同荧光染料间 的光谱重叠。
细胞群体识别问题
总结词
细胞群体识别是流式细胞术实验的重要环节，直接影响实验 结果的分析和解读。
详细描述
在流式细胞术实验中，需要准确识别和区分不同的细胞群体 。通过优化抗体标记组合、采用多参数分析等方法，可以提 高细胞群体识别的准确性和可靠性，为后续的数据分析和解 读提供有力支持。
流式细胞术及其应用PPT
Identify Th1 Cells human IL-2
producing cells
PerCP/Cy5.5 Anti-human IL-2 PE Anti-human CD3
PMA + ionomycin-stimulated (6 hours) human peripheral blood lymphocytes intracellular stained with MQ1-17H12 PerCP/Cy5.5 and CD3 (UCHT1) PE
Anti-human IL-17 Alexa Fuor® 647/CD3 FITC/CD4 PE cocktail
CD3 FITC
PMA/ionomycin-stimulated (6hr) human peripheral blood lymphocytes stained with Human Th17 flow(TM) (one-step) kit. Dot plot analysis is derived from gated in CD3+ cell population.
SSC
Forward Light Detector Cell Surface Area
FSC
前向角散射光（FSC, Forward Scatter） 细胞相对大小及其表面积 侧向角散射光（SSC, Side Scatter） 细胞粒度及细胞内相对复杂性
外周全血细胞散射光双参数点图 （红细胞溶解后）
研究对象为生物颗粒，如各种细胞、微生物及人 工合成微球等 研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征，并 加以定量
光学系统
散射光信号
Right Angle Light Detector Cellensor
流式细胞术实验技巧及数据分析
流式细胞术实验技巧及数据分析一、实验技巧1.细胞样本的准备在进行流式细胞术之前，首先需要准备好细胞样本。
对于悬浮细胞，可以通过离心分离获得单细胞悬浮液；对于贴壁细胞，需要利用胰酶等方法将细胞从培养皿上剥离。
样本的细胞浓度需要适当调整，以保证在实验过程中细胞数目在仪器检测范围内。
2.细胞标记与染色3.样本的处理与染色控制为了减少噪音和误差，需要进行相应的样本处理和染色控制。
常用的处理包括细胞固定、膜破裂和核酸溶解等。
另外，对照组的设置也非常重要，包括负对照、单标对照和血细胞淋巴细胞控制等，以校正仪器和标记的相关性。
4.流式细胞仪的设置与操作流式细胞仪是进行流式细胞术的关键仪器，需要正确设置和操作。
首先，要校准仪器的激发光源、滤光片和检测器等参数，以确保获得准确的荧光信号。
其次，要根据标记物的激发光和发射光波长选择合适的检测通道。
最后，通过检测标记物阳性细胞的信号强度和分布，调整仪器的敏感度和流速，以获得符合实验要求的数据。
二、数据分析1.数据获取与记录在流式细胞术实验结束后，需要用相应的软件（如FlowJo、CellQuest等）获取和记录仪器所产生的原始数据。
这些数据包括细胞整体的荧光信号和散点图等。
2.质量控制与后处理对于数据质量的控制，首先需要排除掉背景信号。
通过设置负对照，根据荧光信号的阈值来确定阳性细胞的比例。
另外，还需要剔除激活的、死亡的和颗粒干扰的细胞等。
3.数据可视化通过制作直方图、散点图和轮廓图等，可以直观地展示细胞的其中一种特定特征（如表达一些蛋白质、细胞周期等）在整个细胞群体中的分布情况。
从图形中可以得出相应的统计结果，并可以进一步比较不同样本之间的差异。
4.数据统计与分析对于一些研究问题，需要计算不同细胞亚群的百分比、中位数、平均值和标准差等。
此外，还可以利用双参数散点图，通过计算相关系数（如Pearson相关系数）来分析两个特征之间的相关性。
总结：流式细胞术作为一种快速、高通量和灵敏的细胞分析技术，对于研究细胞标记物的表达和功能等提供了有力的手段。
《流式细胞技术》PPT课件
完整版ppt
34
CBA(Cytometric Bead Array)
完整版ppt
35
Traditional Analysis -- Percent positive
Po s i t i v e Ce l l
Ne g a ti v e Ce l l
CDX PE
TraditionalAnalysis— PercentPositives
43
3）DNA倍体：主要比较G0/G1期细胞DNA含量 的变化。用DNA指数（DI）表示。
DNA指数=测量样本G0/G1期DNA含量/正常人 淋巴细胞G0/G1期DNA含量
以正常人淋巴细胞作为对照。
正常细胞DNA指数为1.00，DNA指数＞1，为超 2倍体，＜1为亚2倍体，两者可统称为非整倍 体。非整倍体细胞中肿瘤的特异性标志，实体 肿瘤中出现频率较高。
完整版ppt
42
2）利用DNA的荧光染料，如PI （Propidium iodide碘化丙啶），与细胞 内的DNA结合，可反映细胞内DNA含量。 采用DNA直方图显示。具有2C DNA含量 细胞为G0/G1期细胞，4C DNA含量细胞 为G2/M期细胞，DNA含量介于两者之间 的细胞为S期细胞。
完整版ppt
完整版ppt
作者：笛风
1
基本概念
1、流式细胞仪(Flow Cytometer):是集光电子物 理，光电测量，计算机，细胞荧光化学，单抗 技术为一体的高科技细胞分析仪。
2、流式细胞术(Flow Cytometry):利用流式细胞 仪对处于快速流动的细胞或生物颗粒进行多参 数、快速（每秒可达1000-10000个）的定量分 析和分选（纯度可达99%以上）的技术。
140
流式细胞术PPT课件
电荷式分选
lasers
–超声振动器(15-100kHz)
–液流充电系统
–高压偏转板
–收集装置(流式管、培养板)
断裂点(充电) 高压偏转板
29
四路分选原理
电荷式分选装置
30
分选指标
• 分选时间由三方面决定：进样速度、目标细胞所占比例、 需要收集的细胞数。
需要细胞数
目标细胞所占比例(%)
1
5
50
104
• Hoechst（343, 450）常见为Hoechst33342和Hoechst33258，非嵌入的 方式与DNA链上的A-T碱基对结合。能对活细胞染色，用于活细胞 DNA定量分析，如精子分选；还用于侧群细胞的分选。
• PY（派若宁 560, 573） RNA染料，能进入活细胞。
• AO（吖啶橙 509, 525） DNA、RNA染料，染色后DNA呈黄绿色荧光， RNA呈橙黄色荧光，可进行DNA/RNA双参数分析。
• 多色标记荧光素搭配原则：每个通道只能选择一种荧光素； 各个通道之间的荧光素可以随意搭配。
FACSCalibur常用四色搭配：FITC、PE、PerCP、APC。
33
B 根据抗原表达强弱合理选择 抗体
• 不同的荧光素强度有所不同；
CD5
• 高表达的抗原可用不太“亮” 的染料，更“亮”的荧光素分 配给表达低的抗原：
99%以上。 • 分选收获率是指被分选出的细胞与原来总细胞的百分比。 • 分选纯度和收获率永远是相互矛盾的，纯度提高，收获率
降低，反之亦然。
– 富集模式(enrich mode) – 纯化模式(purify mode) – 单细胞模式(single cell mode)
流式细胞术ppt课件
可区分高FL细胞与低FL细胞。 一般的流式细胞仪装有一个激光光源（488nm），可
测出三个FL，即FL1、FL2、FL3，大型的流式细胞仪 装有三个激光光源（488nm、633nm和407nm），可测 出13个FL。
2、荧光信号
双色直接染色
二、荧光染料的选择
选择荧光染料要考虑: 1、流式细胞仪配置的激光可否激发该荧光染料； 2、流式细胞仪可否检测该荧光染料的发射波长； 3、使用多种荧光染料时，要考虑荧光染料之间的干扰。
二、荧光染料的选择
颜色补偿
➢荧光染料的发射波长范围一般宽于检测器检测到的波 长范围；检测范围之外的波长可能会进入相邻的检测器 被检测，从而造成荧光信号之间的干扰。流式细胞仪可 以通过“颜色补偿”校正这一干扰。 ➢ 单标管用于调补偿。
Fluorescein (FITC)
300 nm
400 nm
Excitation
500 nm
Wavelength
Emisson
600 nm
700 nm
400 nm
500 nm
600 nm
700 nm
Protein
Phycoerytherin (PE)
300 nm 400 nm
Excitation Emisson
500 nm
600 nm
700 nm
Protein
FITC和PE荧光光谱
直接染色
间接染色
样品制备过程中常见的问题及解决对策
常见问题 细胞密度低 非特异荧光
强
碎片多 细胞聚集
荧光弱
原因 细胞损失 抗体不纯、死细胞多
细胞死亡、机械损伤 消化不完全
抗体少、反应时间短
解决对策 增加离心时间、弃上清 选择纯度高的抗体、用同型 对照抗体或双标记排除非特
测出三个FL，即FL1、FL2、FL3，大型的流式细胞仪 装有三个激光光源（488nm、633nm和407nm），可测 出13个FL。
2、荧光信号
双色直接染色
二、荧光染料的选择
选择荧光染料要考虑: 1、流式细胞仪配置的激光可否激发该荧光染料； 2、流式细胞仪可否检测该荧光染料的发射波长； 3、使用多种荧光染料时，要考虑荧光染料之间的干扰。
二、荧光染料的选择
颜色补偿
➢荧光染料的发射波长范围一般宽于检测器检测到的波 长范围；检测范围之外的波长可能会进入相邻的检测器 被检测，从而造成荧光信号之间的干扰。流式细胞仪可 以通过“颜色补偿”校正这一干扰。 ➢ 单标管用于调补偿。
Fluorescein (FITC)
300 nm
400 nm
Excitation
500 nm
Wavelength
Emisson
600 nm
700 nm
400 nm
500 nm
600 nm
700 nm
Protein
Phycoerytherin (PE)
300 nm 400 nm
Excitation Emisson
500 nm
600 nm
700 nm
Protein
FITC和PE荧光光谱
直接染色
间接染色
样品制备过程中常见的问题及解决对策
常见问题 细胞密度低 非特异荧光
强
碎片多 细胞聚集
荧光弱
原因 细胞损失 抗体不纯、死细胞多
细胞死亡、机械损伤 消化不完全
抗体少、反应时间短
解决对策 增加离心时间、弃上清 选择纯度高的抗体、用同型 对照抗体或双标记排除非特
流式细胞仪的操作和数据分析技术PPT文档共67页
❖ 知识就是财富 ❖ 丰富你的人生
71、既然我已经踏上这条道路，那么，任何东西都不应妨碍我沿着这条路走下去。——康德 72、家庭成。——西塞罗 73、坚持意志伟大的事业需要始终不渝的精神。——伏尔泰 74、路漫漫其修道远，吾将上下而求索。——屈原 75、内外相应，言行相称。——韩非
流式细胞仪的操作和数据分析技术
41、俯仰终宇宙，不乐复何如。 42、夏日长抱饥，寒夜无被眠。 43、不戚戚于贫贱，不汲汲于富贵。 44、欲言无予和，挥杯劝孤影。 45、盛年不重来，一日难再晨。及时 当勉励 ，岁月 不待人 。
谢谢你的阅读
71、既然我已经踏上这条道路，那么，任何东西都不应妨碍我沿着这条路走下去。——康德 72、家庭成。——西塞罗 73、坚持意志伟大的事业需要始终不渝的精神。——伏尔泰 74、路漫漫其修道远，吾将上下而求索。——屈原 75、内外相应，言行相称。——韩非
流式细胞仪的操作和数据分析技术
41、俯仰终宇宙，不乐复何如。 42、夏日长抱饥，寒夜无被眠。 43、不戚戚于贫贱，不汲汲于富贵。 44、欲言无予和，挥杯劝孤影。 45、盛年不重来，一日难再晨。及时 当勉励 ，岁月 不待人 。
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流式细胞仪分析技术及应用PPT课件
49
（四）石蜡包埋组织单细胞悬液制备 该制备方法的建立扩大了流式细胞术的应
用范围，有利于进行临床回顾性研究和利 用。 常用的方法有二甲苯脱蜡法、组织清洁剂 脱蜡法和甲氧-双氧水处理法。 对石蜡切片的要求较严格。
50
（五）活检标本单细胞悬液制备 活检标本及各种内镜取材标本也克制备成
能对于处在快速直线流动状态 中的细胞或生物颗粒同时进行 多参数、快速定量分析和分选
5
一、流式细胞仪分析的工作原理
荧光显微镜技术
激发光源改为激光
单克隆抗体与 荧光染料技术
计算机技术 处理光信号
提高检测灵敏度 和特异性
提高检测速度和 统计分析精确性
6
（一）流式细胞仪基本结构
液流系统
1
包括流动室（flow chamber）和液流驱动系统 作用：依次传送待测样本中的细胞到激光照射区 理想状态：细胞逐个传送到激光束的中心，而且
侧向散射光检测器
在激光束的垂直方 向，又称90°散射
SSC信号的强弱与 细胞内颗粒结构的 质量成正比，用于 检测细胞内部结构 属性
28
前向散射光示意图
细胞大小
29
结构复杂程度
侧向散射光示意图
30
当荧光抗体或其他染料染色的颗粒通过 激光束时，染料吸收光子跃迁到激发态，返 回基态时，染料释放出能量，大部分以光的 形式释放。
分选的方式有捕获式分选和电荷式分选，目前应 用最多的是电荷式分选。
21
电荷式分选1
当单细胞悬液形成液柱通过 流动室时，液柱被分割成一 连串均匀的液滴。
根据设定的被分选细胞的某 个参数由逻辑电路判断是否 被分选。
22
电荷式分选2
充电电路对选定细胞液滴充 电，使其带正电荷或负电荷， 未被设定分选参数的细胞液 滴则不带电荷。
（四）石蜡包埋组织单细胞悬液制备 该制备方法的建立扩大了流式细胞术的应
用范围，有利于进行临床回顾性研究和利 用。 常用的方法有二甲苯脱蜡法、组织清洁剂 脱蜡法和甲氧-双氧水处理法。 对石蜡切片的要求较严格。
50
（五）活检标本单细胞悬液制备 活检标本及各种内镜取材标本也克制备成
能对于处在快速直线流动状态 中的细胞或生物颗粒同时进行 多参数、快速定量分析和分选
5
一、流式细胞仪分析的工作原理
荧光显微镜技术
激发光源改为激光
单克隆抗体与 荧光染料技术
计算机技术 处理光信号
提高检测灵敏度 和特异性
提高检测速度和 统计分析精确性
6
（一）流式细胞仪基本结构
液流系统
1
包括流动室（flow chamber）和液流驱动系统 作用：依次传送待测样本中的细胞到激光照射区 理想状态：细胞逐个传送到激光束的中心，而且
侧向散射光检测器
在激光束的垂直方 向，又称90°散射
SSC信号的强弱与 细胞内颗粒结构的 质量成正比，用于 检测细胞内部结构 属性
28
前向散射光示意图
细胞大小
29
结构复杂程度
侧向散射光示意图
30
当荧光抗体或其他染料染色的颗粒通过 激光束时，染料吸收光子跃迁到激发态，返 回基态时，染料释放出能量，大部分以光的 形式释放。
分选的方式有捕获式分选和电荷式分选，目前应 用最多的是电荷式分选。
21
电荷式分选1
当单细胞悬液形成液柱通过 流动室时，液柱被分割成一 连串均匀的液滴。
根据设定的被分选细胞的某 个参数由逻辑电路判断是否 被分选。
22
电荷式分选2
充电电路对选定细胞液滴充 电，使其带正电荷或负电荷， 未被设定分选参数的细胞液 滴则不带电荷。
流式细胞术精品PPT课件
4
四、 流式细胞术的应用
1 细胞DNA含量检测：
细胞固定后用PI染色，因为PI特 异性结合于细胞DNA，荧光强度与PI 的结合量呈良好的线性关系，根据这 个原理，并通过专用的DNA分析软件， 可测出细胞的DNA含量。用于细胞周 期、细胞倍体以及凋亡的检测。
5
• 肿瘤诊断：
•
DNA异倍体的出现是癌变的一个重
• 一、 流式细胞术的概念 流式细胞术（FCM）就是对在的鞘
液包括下的细胞、粒子进行分析和分选 的技术，这种细胞或粒子是经过特异荧 光标记的。其特点是测量速度快，每秒 钟能测数千个乃至上万个细胞，且可进 行多参数测量，另一特点是在分析的同 时可把具有指定特征的细胞分离出来， 这就是分选技术。
1
二、流式细胞仪的工作原理
产生及发展，现在CD系统已有247种之多。
细胞用带有荧光的单克隆抗体标记后，用
流式细胞仪可对其进行检测分析，可分析
出荧光细胞的含量，也可分析出这种阳性
细胞的CD分子的相对含量。标记的方法一
般用直标法，也可用间标法。荧光探针多
为FITC、PE、PE-CY5、PerCP、CY5、
APC等。
9
淋巴细胞分类：
•
红细胞表面CD59缺失
18
5 细胞内蛋白的分析：
•
细胞破膜后将细胞内某一蛋白成分进行荧
光标记，用流式细胞仪进行测量分析，同表型
分析一样，可以测量出这种阳性细胞的数量和
这种蛋白的相对含量。并且，结合细胞表型分
析，进行多标记和多参数分析，可以检测出含
这种蛋白的细胞是属于哪一种表型的细胞。多
用间标法，荧光探针多为FITC。也可以与周期
27
•
流式细胞仪对一个样品提供的结果是否可
四、 流式细胞术的应用
1 细胞DNA含量检测：
细胞固定后用PI染色，因为PI特 异性结合于细胞DNA，荧光强度与PI 的结合量呈良好的线性关系，根据这 个原理，并通过专用的DNA分析软件， 可测出细胞的DNA含量。用于细胞周 期、细胞倍体以及凋亡的检测。
5
• 肿瘤诊断：
•
DNA异倍体的出现是癌变的一个重
• 一、 流式细胞术的概念 流式细胞术（FCM）就是对在的鞘
液包括下的细胞、粒子进行分析和分选 的技术，这种细胞或粒子是经过特异荧 光标记的。其特点是测量速度快，每秒 钟能测数千个乃至上万个细胞，且可进 行多参数测量，另一特点是在分析的同 时可把具有指定特征的细胞分离出来， 这就是分选技术。
1
二、流式细胞仪的工作原理
产生及发展，现在CD系统已有247种之多。
细胞用带有荧光的单克隆抗体标记后，用
流式细胞仪可对其进行检测分析，可分析
出荧光细胞的含量，也可分析出这种阳性
细胞的CD分子的相对含量。标记的方法一
般用直标法，也可用间标法。荧光探针多
为FITC、PE、PE-CY5、PerCP、CY5、
APC等。
9
淋巴细胞分类：
•
红细胞表面CD59缺失
18
5 细胞内蛋白的分析：
•
细胞破膜后将细胞内某一蛋白成分进行荧
光标记，用流式细胞仪进行测量分析，同表型
分析一样，可以测量出这种阳性细胞的数量和
这种蛋白的相对含量。并且，结合细胞表型分
析，进行多标记和多参数分析，可以检测出含
这种蛋白的细胞是属于哪一种表型的细胞。多
用间标法，荧光探针多为FITC。也可以与周期
27
•
流式细胞仪对一个样品提供的结果是否可
流式细胞术基本原理(完整)PPT参考幻灯片
流式细胞术的基本原理
1
流式细胞术（flow cytometer，FCM）：
利用流式细胞仪对处于快速直线流动状态 中的单列细胞或生物颗粒进行逐个、多参 数、快速的定性、定量分析或分选的技术。
2
流式细胞仪：是集现代物理电子技术、激光
技术、光电测量技术、计算机技术以及细 胞荧光化学技术、单克隆抗体技术于一体 的先进科学技术设备
34Leabharlann 流式细胞仪分为四部分：1）流动室与液流系统 2）光源与光学系统 3）信号收集、转换与分析系统 4）细胞分选系统
5
1）流动室与液流系统
6
2）光源与光学系统
激光（单色性、单向性） 前向散射（FSC）
侧向散射（SSC）
7
激发波长 发射波长
8
3）信号收集、转换与分析系统
• 激发波长经过滤光片分离不同波长的光信 号分别到达不同的光电倍增管(PMT)，PMT 将光信号转换成电信号，电信号输入到放 大器放大。
11
流式细胞术的对照设置
阴性对照：调节荧光探测器合适的放大倍 数，将仪器归零，确定样本的基础荧光域 值
阳性对照：检测抗体是否有问题或确定实 验方法的稳定性、准确性
空白对照：不标记，自发荧光 PS：补偿对照：多色分析样本时为荧光光谱
重叠进行的的补偿调节
12
4）细胞分选系统
• 根据某参数决定细胞液滴是否被分选，然 后由充电电路对其充电，带电液滴通过静 电场发生偏转而分离
488 nm laser
- Charged Plates
Single cells sorted into test tubes
FALS Sensor Fluorescence detector
+
1
流式细胞术（flow cytometer，FCM）：
利用流式细胞仪对处于快速直线流动状态 中的单列细胞或生物颗粒进行逐个、多参 数、快速的定性、定量分析或分选的技术。
2
流式细胞仪：是集现代物理电子技术、激光
技术、光电测量技术、计算机技术以及细 胞荧光化学技术、单克隆抗体技术于一体 的先进科学技术设备
34Leabharlann 流式细胞仪分为四部分：1）流动室与液流系统 2）光源与光学系统 3）信号收集、转换与分析系统 4）细胞分选系统
5
1）流动室与液流系统
6
2）光源与光学系统
激光（单色性、单向性） 前向散射（FSC）
侧向散射（SSC）
7
激发波长 发射波长
8
3）信号收集、转换与分析系统
• 激发波长经过滤光片分离不同波长的光信 号分别到达不同的光电倍增管(PMT)，PMT 将光信号转换成电信号，电信号输入到放 大器放大。
11
流式细胞术的对照设置
阴性对照：调节荧光探测器合适的放大倍 数，将仪器归零，确定样本的基础荧光域 值
阳性对照：检测抗体是否有问题或确定实 验方法的稳定性、准确性
空白对照：不标记，自发荧光 PS：补偿对照：多色分析样本时为荧光光谱
重叠进行的的补偿调节
12
4）细胞分选系统
• 根据某参数决定细胞液滴是否被分选，然 后由充电电路对其充电，带电液滴通过静 电场发生偏转而分离
488 nm laser
- Charged Plates
Single cells sorted into test tubes
FALS Sensor Fluorescence detector
+
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488
F+P +PeCy5
488
F+ ECD +PeCy5 488
F+P +PeCy5 +APC 488
633
525 、575
绿色、橙色
525
绿色
615
红色
525、 675
绿色、 红色
525、 625
绿色、橙红色
525、575、675
绿、橙、红色
525、575、675 绿、橙红色、红色
525 、 575 绿色、橙色
670
红色
能量传递染料：
用化学法将两种长激发光激发后产生的发射波长 激发另一荧光染料产生的荧光信号。
Laser
488nm
ECD 620
PE CY5 670
CY7 755
流式细胞术操作流程：
培养细胞 新鲜组织 石蜡包埋
单细胞悬液 制备
荧光抗体标记
上机检测
表型测定 细胞分选
统 计 学 分 析
FISH PCR
继 续 培 养
单 分 散 细 胞
FSC
FSC信号的强弱与细胞的大小和活力相关
SSC
SSC信号的强弱与细胞内颗粒多少相关
细胞散色光信号
细胞荧光测量
细胞的自发荧光 未经染色的样品细胞
在激发光的照射下可测到有微弱的荧 光信号.
细胞的特异性荧光 经过各种特异染色的
光
补
偿
FL2
FL1
利用电子技术或计算机软件等方法将串入相邻
荧光通道的信号加以扣除的方法称“荧光补偿”
荧光补偿
Mean值判断补偿
双或多参数荧光抗体的组合标记
荧光染料
激发波长（nm) 发射波长（nm)
颜色
FITC+PE
488
FITC+T red
488
568
FITC+PeCy5 488
FITC+ ECD
流式细胞术实验技 巧及数据分析(ppt)
BD公司不同型号流式细胞仪
FACSCalibur
FACSCanto
FACSCount
LSRII
FACSAria
FACSVantage&DiVa
一 流式细胞仪的基本原理
*稳定流动 *激发光斑 *荧光补偿 *荧光素选择
二 数据分析及开窗
FCM原理示意图
层流技术
细胞在激发光的照射下可测到较强的荧光 信号.
自发荧光信号与特异染色的荧光信号分析图 自 发 荧 光 信 号
特 异 染 色 的 荧 光 信 号
DNA分析比较
排除双联体细胞
细胞阻滞在G2M期
双 克 隆 细 胞 周 期 分 析
BrdUrd和DNA双标记染色
溴脱氧尿嘧啶核苷( Bromodeoxyuridine， BrdUrd )是胸苷的一种类似物。它可以替代
低速
高速
不同样本速率形成的样本流
激发光源与光束成形系统
光
束
聚焦距离
成
形 激光束
与
细
聚焦透镜
胞
受
照
方
.
这种椭圆形
20um 光斑的检测
区保证每个
64um
细胞分别受
到光照且受
检时受到一
强度
式
致的光照
FCM的单细
32um 0 32um
胞照明技术
荧 光 光 谱 重
FITC和PE荧光光谱重叠
荧
Uncompensated vs Compensated
血 小 板 检 测
血 小 板 检 测
血 小 板 检 测
血小板检测
胸腺嘧啶掺入到细胞新合成的DNA分子中，成为S 期细胞的一种标记物。流式细胞术采用抗BrdUrd 单克隆抗体免疫荧光和PI双参数检测细胞，不仅 可检测一个细胞群体的动力学参数和DNA含量，同
时可以了解不同细胞的DNA合成能力高低。
BrdUrd与PI检测
BrdUrd与PI检测
BrdUrd与PI检测
层流是液体稳定流动的必要条件,管道中层流 的形成要满足雷诺数
dρV Re = < 2300，
η 式中ρ、η分别为液体的密度和粘滞系数，d和 V分别为管道的直径和液体的平均流速。FCM 利用层流技术,使细胞流动稳定,并具有自聚焦 作用,为细胞分析分选提供技术保证.
液流驱动系统（示意图）
流速与压力的关系服从Bernoulli方程，即 P=(1/2)V2 (忽略高度的变化)。改变气压,就可获得不同的流速。
细 胞 三 色 荧 光 检 测
细胞因子测定
*检测T细胞(CD69)活化
G6=R1*R5
*CD4抗原分子结构引起CD4荧光强度下调
细胞因子分析图
*过敏性鼻息肉与鼻息肉细胞因子比较
纯化单核细胞
调节性T细胞检测
G3=R1*R3 G4=R1*R4
凋亡细胞测定
凋亡细胞测定
细胞凋亡检测
阴性的设置