人牙周膜干细胞的初步鉴定及体外成骨诱导

　万方数据

甄蕾，等．人牙周膜干细胞的初步鉴定及体外成骨诱导

ＺＨＥＮＬｅｉ．ｅｔａＬＨｕ眦ｎＰｅｒｉｏｄｏｎｔａｌＬｉｇａｍｅｎｔＳｔｅｍＣｅｌｌｓＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｉｎｔｏＯｓｔｅｏｂｌａｓｔｓ／ｎｖ／ｔｒｏ・３１９・

ＲＮＡ提取试剂盒、一步法ＲＴ．ＰＣＲ试剂盒（Ｔｉａｎｇｅｎ公司。北京）。

１．２方法

１．２．１牙周膜细胞原代培养收集临床１２一１８岁因正畸需要而拔除的牙周健康、无龋的新鲜前磨牙，ＰＢＳ洗３次，刮取根中ｌ，３牙周膜组织，采用酶解组织块法培养，每隔３ｄ换液．直至细胞从组织块周围游出。细胞生长达８０％汇合时传代。

１．２．２有限稀释法克隆化培养纯化ＰＤＬＳＣｓ取对数生长期的第１代细胞。以１～２个／孔的密度接种于９６孔板，常规培养７。１４ｄ，至出现细胞克隆（细胞数≥５０为判定标准）后扩大培养。

１．２．３ＰＤＬＳＣｓ的初步鉴定分别取第２代克隆形成细胞进行爬片。采用ＳＰ法检测波形蛋白和角蛋白的表达。同时利用兀ＴＣ荧光标记二抗检测ＳＴＲＯ．．１和ＣＤｌ４６的表达。

１．２．４体外诱导分化取第２代对数生长期的克隆形成细胞。按５ｘｌｌＹ个／ｍＬ接种于２４孔板中，待细胞进入对数生长期后弃去原培养液。ＰＢＳ洗３遍，换诱导液（１０ｍｍｏｌ／ＬＢ．甘油磷酸钠、１０｛ｍｏｌ／Ｌ地塞米松、５０Ｉ．Ｌｇ／ｍＬ维生素Ｃ）培养２１ｄ。对照组细胞常规培养。

１．２．５成骨性能的鉴定

１．２．５．１茜素红Ｓ染色观察钙结节形成人ＰＤＬＳＣｓ诱导培养２１ｄ后弃去培养液，４％多聚甲醛固定３０ｍｉｎ后饱和茜素红Ｓ溶液染色１０ｍｉｎ，观察钙结节形成情况。

１．２．５．２定性的细胞ＡＬＰ活性检测人ＰＤＬＳＣｓ诱导培养２１ｄ后弃去培养液。按ＡＬＰ检测试剂盒说明书规范操作。光学显微镜下观察染色情况。

１－２．５．３免疫细胞化学检测ＢＳＰ、Ｉ型胶原表达人ＰＤＬＳＣｓ诱导培养２１ｄ后常规ＳＰ法检测ＢＳＰ、Ｉ型胶原蛋白表达情况。

１．２．５．４ＲＴ－ＰＣＲ检测ＡＬＰ、ＢＳＰｍＲＮＡ表达收集诱导培养２１ｄ后的人ＰＤＬＳＣｓ．。使用细胞总ＲＮＡ提取试剂盒提取培养细胞总ＲＮＡ。采用一步法进行ＲＴ－ＰＣＲ反应，以Ｂ．ａｃｔｉｎ为内参照。参照ＧｅｎＢａｎｋ数据库，采用Ｏｌｉｇｏ计算机软件设计引物，Ｂ．．ａｃｔｉｎ上游引物５＇－ｇｃｇａｇａａｇａｔｇａｃｃｃａｇａｔｃａｔｇｔｔ一３’。下游引物５’一ｇｃｔｔｃｔｃｃｔｔａａｔｇｔｃａｃｇｃａｃｇａｔ－３’：ＡＬＰ上游引物５＇－ａｔｅｔｔｔｇ．－ｇｔｃｔｇｇｃｃｃｃｃａｔｇ－一３。下游引物５＇－ａｔｇｃａｇｇｃｔｇｃａａｔａｃｇｃｃａｔ一３７；ＢＳＰ上游引物５＇－ａｔｇｇｃｃｔｇｔｇｃｔｔｔｃｔａａｔ－３’。下游引物５＇－ｔｔｃｃｔｅｃｔｅｃｔｃｔｔｃｔｇａａｃｔｇ．－３’：由上海生工生物技术公司合成。反应条件：５０。Ｃ３０ｍｉｎ逆转录，９４。Ｃ５ｍｉｎ逆转录失活，然后９４。Ｃ３０ｓ，５８。Ｃ３０ｓ，７２。Ｃ３０ｓ，３５个循环，７２。Ｃ延伸７ｍｉｎ。ｌ％琼脂糖凝胶电泳检测，鉴定ＰＣＲ产物片断大小。

２结果

２．１ＰＤＬＳＣｓ的分离及纯化

本实验采用酶解组织块法培养原代细胞。３～１０ｄ组织块周围有细胞爬出。２周左右可达８０％汇合。有限稀释法筛选出来的细胞克隆呈圆形、多角形等多种形态，但都表现为胞核聚集在中心，胞质形成的突起向外呈放射状．具有成体干细胞的特征。２．２ＰＤＬｓＣｓ的鉴定

免疫细胞化学检查发现．ＰＤＬＳＣｓ广谱角蛋白阴性表达，波形蛋白阳性表达（图１），说明本实验克隆形成细胞为中胚层来源的间充质细胞．且无外胚层来源的细胞污染。免疫荧光检测可见克隆细胞ＳＴＲＯ．１、ＣＤｌ４６均呈阳性表达，细胞发出明亮的绿色荧光（图２、３），提示其具有干细胞特性。

田１第２代ＰＤＬｓＣｓ波形蛋白染色阳性（免疫组化。ｘ１００ｌ

Ｆｉｇｍｕｍ１Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｖｉｍｅｎｌｉｎｉｎｔｈｅｓｅｃｏｎｄｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ０ｆＰＤＬＳＣｓ（ｉｍｍｕｎｏｈｉａｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．ｘ１００）

圈２第２代ＰＤＬＳＧｓＳＴＲＯ．１染色阳性（免疫荧光，ｘ１００）

Ｆｉｇｍ陀２ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＳＴＲＯ・１ｉｎｔｈｅｓｅｃｏｎｄｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆ

ＰＤＬＳＣｓ（ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ，ｘ１００）

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口腔颌面外科杂志２００８年１０月第１８卷第５期

ＪｏｕｍｄｏｆＯｒａｌａｎｄＭａｘｉｌｌｏｆａｃｉａｌＳｕｒｇｅｒｙＶ０１．１８Ｎｏ．５Ｏｃｔｏｂｅｒ．２００８

圈３第２代ＰＤＬＳＣｓＣＤｌ４６染色阳性（免疫荧光。×１００）

Ｆｉｇｕｒｅ３ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＣＤｌ４６ｉｎｔｈｅｓｅｃｏｎｄｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆＤＬＳＣｓ（ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｖｅ，ｘ１００）

２．３钙结节形成

矿化液连续培养１４ｄ左右出现肉眼可见的针尖大小灰白色小结节，并逐渐增大，２１ｄ后茜素红Ｓ染色可见红色的钙结节，周围边界不清（图４）。

图４ＰＤＬＳＣｓ矿化诱导２１ｄ后钙结节染色（×１００）

ｒｉｇ，ｕｒｅ４ＣａｌｄｕｍｎｏｄｅｓｔａｉｎｉｎｇｏｆＰＤＬＳＣｓｃｕｌｔｕｒｅｄｗｉｔｈｉｎｄｕｃ－ｌｉｏｎｍｅｄｉｕｍｆｏｒ２１ｄａｙｓ（ｘ１００）

２．４ＡＬＰ活性

人ＰＤＬＳＣｓ经矿化诱导２１ｄ后．ＡＬＰ染色可见明显紫色颗粒（图５），对照组细胞无明显颗粒形成。

圈５ＰＤＬＳＣｓ矿化诱导２１ｄ后ＡＬＰ染色阳性（ｘ１００）

Ｆｉｇｕｒｅ５ＡＬＰｓｔａｉｎｉｎｇｏｆＰＤＬＳＣｓｃｕｌｔｕｒｅｄｗｉｔｈｉｎｄｕｃｔｉｏｎｍｅｄｌ－ａｍｆｏｒ２１ｄａｙｓ（ｘ１００）

２．５ＢＳＰ、Ｉ型胶原表达

诱导组细胞ＢＳＰ、Ｉ型胶原阳性表达。对照组细胞阴性表达（图６、７）。

图６ＰＤＬＳＣｓ矿化诱导２１ｄ后ＢＳＰ染色阳性【ｘ１００）

Ｆｉｇｕｒｅ６ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＢＳＰｉｎｔｈｅＰＤＬＳＣｓｃｕｌｔｕｒｅｄｗｉｔｈｉｎ－ｄｕｃｔｉｏｎｍｅｄｉｕｍｆｏｒ２１ｄａｙｓ（ｘ１００）

圈７ＰＤＬＳＣｓ矿化诱导２１ｄ后ｌ型胶原染色阳性（×１００）

Ｆｉｇｕｒｅ７ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｃｏｌｌａｇｅｎＩｉｎｔｈｅＰＤＬＳＣｓｃｕｌｔｕｒｅｄｗｉｔｈｉｎｄｕｃｔｉｏｎｍｅｄｉｕｍｆｏｒ２１ｄａｙｓ（ｘ１００）

２．６ＲＴ．ＰＣＲ结果

诱导组在２０４ｂｐ和２８８ｂｐ处可见特异性扩增条带，对照组无特异性扩增条带（图８）。

圈８矿化诱导２１ｄ后ＲＴ—ＰＣＲ检测ＡＬＰｍＲＮＡ和ＢＳＰｍＲＮＡ表达

（Ｍ：Ｍａｒｋｅｒ。ｌ：诱导组ｐ－ａｅｔｉｎ。２：诱导组ＢＳＰ。３：诱导组ＡＬＰ。４：对照组Ｂ－ａｃｔｉｎ，５：对照组ＢＳＰ，６：对照组ＡＬＰ）

Ｆｉｇｕｒｅ８ＡＬＰｍＲＮＡａｎｄＢＳＰｍＲＮＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＰＤＬＳＣｓｃｕｄ－ｔｕｒｅｄｗｉｔｈｉｎｄｕｃｔｉｏｎｍｅｄｉｕｍｆｏｒ２１ｄａｙｓｂｙＲＴ－ＰＣＲ（Ｍ：Ｍａｒｋｅｒ，ｈｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｇｒｏｕｐ１３－ａｅｔｉｎ，２：ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｇｒｏｕｐ８ＳＰ，

３：ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｇｒｏｕｐＡＬＰ，４：ｃｏｎｔｒｏｌ

ｇｒｏｕｐ

ｐａｅｔｉｎ，５：ｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐＢＳＰ，６：ｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ

ＡＬＰ）　万方数据