三种方法原代培养人牙周膜细胞

中国组织工程研究与临床康复第14卷第23期 2010–06–04出版Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research June 4, 2010 Vol.14, No.23

Department of Oral Medicine, Stomatological Hospital Affiliated to Luzhou Medical College, Luzhou 646000, Sichuan Province, China

Jiang Jun-qiang★, Master, Lecturer, Department of Oral Medicine, Stomatological Hospital Affiliated to Luzhou Medical College, Luzhou 646000, Sichuan Province, China jqjiang@

Correspondence to: Cai Wei, Lecturer, Department of Oral Medicine, Stomatological Hospital Affiliated to Luzhou Medical College, Luzhou 646000, Sichuan Province, China caiwei311@ Supported by: the Scientific Research Foundation of Health Department of Sichuan Province, No. [2007]431*

Received: 2010-01-19 Accepted: 2010-05-10

三种方法原代培养人牙周膜细胞*★

蒋俊强，王忠朝，黎春晖，蔡炜

Primary culture of human periodontal ligament cells using three methods

Jiang Jun-qiang, Wang Zhong-chao, Li Chun-hui, Cai Wei

Abstract

Jiang JQ, Wang ZC, Li CH, Cai W.Primary culture of human periodontal ligament cells using three methods. Zhongguo Zuzhi

Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu. 2010;14(23): 4290-4294. [ ]

摘要

蒋俊强，王忠朝，黎春晖，蔡炜.三种方法原代培养人牙周膜细胞[J].中国组织工程研究与临床康复，2010，14(23):4290-4294.

[ ]

0 引言

细胞培养技术是细胞生物学研究的基础[1]。从组织中分离的原代细胞较好地保存了原组织细胞的遗传特征和生物学特征[2]。体外培养的人牙周膜细胞(human periodontal ligament cell，hPDLC)对研究牙周细胞生物学、药理学、毒理学以及牙周组织工程研究具有重要意义[3-7]。牙周膜是一种致密的结缔组织，由细胞、基质和大量的胶原纤维组成。由于受到牙周组织的解剖结构和取材数量的限制，牙周膜细胞的原代培养较为困难，这也成了限制牙周细胞生物学研究的瓶颈[8-10]。大量的研究者对其培养方法进行了探索，目前常用的方法主要有两种：组织块法和酶消化法[11-15]。作者在实验过程中发现这两种方法存在培养周期较长，成功率较低、培养出的细胞活性欠佳等缺陷。若将两种方法结合起来，采用酶消化结合组织块法能够有效提高hPDLC培养的成功率。本实验分别采用这3种方法进行hPDLC的原代培养，比较其培养成功率，同时对所培养细胞进行鉴定，探索hPDLC原代培养的方法，为牙周细胞生物学研究奠定基础。

蒋俊强，等. 三种方法原代培养人牙周膜细胞

www.CRTER

.org

泸州医学院附属

口腔医院口腔内科，四川省泸州市646000

蒋俊强★，男，1976年生，四川省邻水县人，汉族，2006年四川大学华西口腔医学院毕业，硕士，讲师，主要从事牙周病病因及其防治的研究。

jqjiang@

通讯作者：蔡炜，讲师，泸州医学院附属口腔医院口腔内科，四川省泸州市646000

caiwei311@

中图分类号:R394.2 文献标识码:A

文章编号:1673-8225(2010)23-04290-05

收稿日期：2010-01-19

修回日期：2010-05-10(20091119002/WL.Q)

1 材料和方法

设计：随机分组设计，对比观察。 时间及地点：实验于2007-08/2008-05在泸州医学院口腔医学实验中心完成。

材料：选取于泸州医学院附属口腔医院口腔颌面外科门诊因正畸需要而拔除的双尖牙58颗，患者年龄12~16岁，平均14岁，征得患者本人及家长同意。所选牙无龋坏、根尖周炎和牙周炎。

主要试剂及仪器：

实验方法：

hPDLCs 原代培养：

组织来源及分组：将所选58颗牙随机分为3组，分别采用组织块法(n =19)、酶消化法(n =19)、酶消化结合组织块法(n =20)进行原代培养。牙离体后立即用含双抗的PBS 反复冲洗，去净血污后立即投入含双抗的DMEM 细胞培养液中，转送至超净工作台。在超净工作台内用双抗液漂洗后，在不含血清的细胞培养液润湿下用手术刀刮取牙根中1/3的牙周膜。

组织块法培养：将刮取的牙周膜组织剪成约 1 mm×1 mm×1 mm 的小块，均匀铺于无菌的25 mL 培养瓶。倒置培养瓶，加入含体积分数为20%胎牛血清、双抗的DMEM 培养基 5 mL ，然后将培养瓶置于CO 2恒温培养箱中(体积分数为5%CO 2，37 ℃、100%湿度)孵育。 4 h 后翻转培养瓶，继续培养。

酶消化法培养：将刮取的牙周膜组织剪成约 1 mm×1 mm×1 mm 的小块，0.25%胰蛋白酶消化5 min ，800 r/min 离心6 min ，弃上清液，再用0.2%Ⅰ型胶原酶于恒温摇床内，37 ℃消化50 min ，800 r/min 离心3 min ，弃上清液，加入含体积分数为20%胎牛血清、双抗的DMEM 培养基5 mL ，吹打混匀后将培养瓶置于CO 2恒

温培养箱中(体积分数为5%CO 2，37 ℃、100%湿度)培养。

酶消化结合组织块法培养：收集刮下的牙周膜组织不经剪切，直接移入离心管，加入含0.2%Ⅰ型胶原酶3 mL ，37 ℃振荡消化110 min ，见大部分细胞游离，用吸管吹打使其充分分散，加入少量含体积分数为10%胎牛血清的DMEM 培养基终止消化。1 000 r/min 离心10 min ，弃上清液，加入少量含体积分数为10%胎牛血清的DMEM 培养基，接种于25 mL 细胞培养瓶中，用巴氏吸管将组织块摆放均匀，倒置培养瓶，加入含体积分数为20%胎牛血清、双抗的

DMEM 培养基5 mL ，然后将培养瓶置于CO 2恒温培养箱中(体积分数为5%CO 2，37 ℃、100%湿度)孵育。4 h 后翻转培养瓶，继续培养。

传代培养：待细胞长满瓶底约80%时，弃原

培养基，用PBS 洗涤1次，加入0.25%胰蛋白酶消化3 min ，倒置显微镜下见大部分细胞回缩变圆后，用含血清的培养基终止消化，1 000 r/min 离心10 min ，弃上清液，加入含体积分数为10%胎牛血清的DMEM 培养基，1∶2进行传代培养。

hPDLCs 的鉴定：

细胞形态学观察：倒置显微镜下观察细胞生长情况以及细胞形态；第2代细胞接种于载玻片上，制备细胞爬片2张，常规苏木精-伊红染色，显微镜下观察细胞形态。

免疫组织化学染色鉴定：取第2代培养细胞，0.25%胰蛋白酶消化细胞后按1×107 L -1的密度接种于载玻片上，待细胞长满载玻片后，PBS 振洗3次，5 min/次；40 g/L 多聚甲醛固定20 min ；PBS 振洗吹干；体积分数为3%H 2O 2处理10 min ；正常血清工作液封闭10 min ；分别加入一抗Vimitin 和CK14于2张爬片(37 ℃， 2 h)；PBS 振洗后依次加入二抗、三抗处理 (37 ℃，0.5 h)；DBA 显色2~6 min ；苏木精复

染2~6 min ；树胶封固；显微镜下照相。 绘制细胞生长曲线：取第4代细胞，用0.25%

的胰蛋白酶消化后，接种细胞于24孔细胞培养

板，每孔接种1 mL ，细胞密度为1.5×107 L -1。将培养板置于CO 2恒温细胞培养箱中静置密闭培养。接种细胞后，每24 h 计数3孔，取均值；连续计数8 d ，绘制出细胞生长曲线。按下式计算细胞倍增时间：

DMEM 培养基，双抗液(含100 U/mL 青霉素、100 U/mL 链霉素)，胰蛋白酶，Ⅰ型胶原酶，胎牛血清抗细胞角蛋白多克隆抗体，抗波形丝蛋白多克隆抗体 ABC 免疫组织化学试剂盒 超净工作台

CO 2恒温培养箱

倒置相差显微镜 高速离心机 试剂及仪器

来源

Sigma ，美国

DACO ，美国

Vector ，美国

AIR TECH ，苏州净化设备厂Forma Scientific ，美国 Olympus 公司，日本 上海菲恰尔分析仪器有限

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