[课件]细胞原代培养与传代PPT

• 传代次数与物种寿命有关：小鼠寿命3年，传代12次； 龟寿命200年，传代140次。
• 传代次数与个体年龄成反比：人胚胎，40-60代； 幼 年，20-40代；成年，10-30代；早老病儿童，2-10代。
原代培养与细胞系
原代培养 细胞株 细胞系 克隆 （clone）亦称无 性繁殖系或无性 系。对细胞来说， 克隆是指由同一 个祖先细胞通过 有丝分裂产生的 遗传性状一致的 细胞群。
（primary culture） 从动物机体取出的进 行培养的细胞群。生 长缓慢，繁殖一定的 代数后（一般10代以 内）停止生长。
（cell strain） 从原代培养细 胞群中筛选出 的具有特定性 质或标志的细 胞群，能够繁 殖50代左右， 在培养过程中 其特征始终保 持。
（cell line） 从肿瘤组织 培养建立的 细胞群或培 养过程中发 生突变或转 化的细胞， 在培养条件 下可无限繁 殖




潜伏期
此时细胞有生长话动，而无细胞分裂。细胞株潜伏期 一般为6～24小时。


对数生长期：
细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。



停止期（平台期）：
细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂 机制：接触抑制、密度依赖性

二、细胞培养基本要求


常用仪器设备 培养器皿 培养基 血清 其他细胞培养试剂


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缺点：
人工所模拟的条件与体内实际情况仍不完全相同； 当细胞被置于体外培养后，生活在缺乏动态平衡的环境中，时间久了 ，必然发生变化。
细胞培养的基本概念
传代：


细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到 新的培养器皿中。 原代培养 取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长的细胞在 传代之前称为原代培养。
培养细胞生长的条件



1 细胞的营养需要 2 细胞的生存环境 温度: 37 ℃ O2 CO2: 5% CO2 +H2O ← →H2CO3 ← →H+ + HCO3pH: 7.2-7.4 渗透压 3 无污染 4 无毒
细胞培养的环境




细胞在体外培养中所需的条件与体内细胞基本相同。 1、无污染环境培养环境无毒和无菌是保证细胞生存的首要条件。当细胞放置于体外培养 时，与体内相比细胞丢失了对微生物和有毒物的防御能力，一旦被污染或自身代谢物质积 累等，可导致细胞死亡。因此在进行培养中，保持细胞生存环境无污染、代谢物及时清除 等，是维持细胞生存的基本条件。 2 、恒定的温度 维持细胞旺盛生长,必须有恒定适宜的温度.一般标准温度为36.5℃±0.5℃，偏离这一温 度范围，细胞的正常代谢会受到影响，甚至死亡。培养细胞对低温的耐受力较对高温强， 温度上升不超过39℃时，细胞代谢与温度成正比；人体细胞在39-40℃1小时，即能受到 一定损伤，但仍有可能恢复；在40-41℃1小时，细胞会普遍受到损伤，仅小半数有可能恢 复；41-42℃1 小时，细胞受到严重损伤，大部分细胞死亡，个别细胞仍有恢复可能；当 温度在43℃以上1小时，细胞全部死亡。 3、气体环境 气体是人体细胞培养生存必需条件之一，所需气体主要有氧气和二氧化碳。氧气参与 三羧酸循环，产生供给细胞生长增殖的能量和合成细胞生长所需用的各种成分。开放培养 时一般把细胞置于95%空气加5%二氧化碳混合气体环境中。二氧化碳既是细胞代谢产物， 也是细胞生长繁殖所需成分，它在细胞培养中的主要作用在于维持培养基的PH 值。大多 数细胞的适宜PH 为7.2—7.4，偏离这一范围对细胞培养将产生有害的影响。但细胞耐酸 性比耐碱性大一些，在偏酸环境中更利于细胞生长。
细胞原代培养与传 代
目录
一．
二．
三．
细胞培养基本概念 细胞培养基本要求 细胞培养基本技术
细胞培养定义

定义：
模拟机体内生理条件，将细胞从机体中取出，在人工条件下使其 生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程 等问题的研究。

优点：
1．活细胞：同时、大量、均一性、重复性； 2．可控制： 各种物理、化学、生物等因素可调控； 3．研究方法多样：倒置、荧光、电子、激光共焦显微镜、流式细胞术、 免疫组织化学、原位杂交、同位素标记； 4．应用广： 不同物种、不同年龄、不同组织、正常或异常（肿瘤）；

游离期 贴壁期 潜伏期 对数生长期 停止期（平台期）

游离期： 细胞接种后在培养液中呈悬浮 状态．也称悬浮期。此 时细胞质回缩，胞体呈圆球形。
10分钟一4小时



贴壁期：
细胞附着于底物上，游离期 结束。细胞株平均在10分钟一4小时 贴壁。 底物：胶原、玻璃、塑料、其它细胞等 血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘素、胶原等糖蛋白 （生长基质），这些带正电荷的糖蛋白的促贴壁因子先吸附于底 物上，悬浮细胞再与吸附有促贴壁因子的附着。 进口塑料培养瓶涂有生长基质（化学合成的功能基团）
原代培养细胞的生命归宿
原代培养期 传代期 衰退期

细胞系资源
• The American Type Culture Collection (ATCC) • The European Collection of Animal Cell Culture (ECACC) • National Institute of Health (NIH), USA • National Cancer Institute (NCI), USA

接触抑制（Contact inhibition）

细胞相互接触时，将停 止增长； 细胞停留在细胞周期的 G0期；


转化的细胞却可以继续 生长导致细胞重叠堆积 生长。
细胞传代次数（Passage Number）
• 体外培养的细胞增殖能力不是无限的，传代次数有一 定的界限，称为“ Hayflick极限”。

有限细胞系，无限细胞系 细胞系 cell line
细胞株 cell strain
培养细胞的特性


培养细胞的生长方式
贴附生长： 必须贴附于支持物表面才能生长。见于各种实体瘤细胞 悬浮生长： 于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物表面。见 于各种造血系统肿瘤细胞
每代贴附生长细胞的生长过程