[课件]细胞原代培养与传代PPT
《细胞原代培养》PPT课件
• 超净工作台 紫外消毒，鼓风，保持干净、整洁 • 高压锅 用电，带压力表，自动恒压，掌握时间 橡胶、塑料、药品——15’，金属——20’ • 培养瓶 玻璃瓶和塑料瓶，洗涤要干净，临时消毒 • 培养基 a.天然培养基：血清、胚胎浸出液、水解乳蛋白等 b.合成培养基：DMEM、RPMI1640、199培养基等 c.无血清培养基：Ham F12和DMEM混合的基础培 养基、自行设计与配制的培养基长的间质（基 质、纤维等），形成单个细胞或细胞团 • 对上皮、肝、肾、胚胎等间质少、较软组 织选择胰蛋白酶 • 对骨、前列腺、癌组织等纤维多、较硬的 组织可用胶原酶
• 短时间内可获得大量活细胞
主要实验器材
• 培养箱 二氧化碳恒温箱，5％CO2，37℃，保持湿 度，消毒灭菌。 • 倒置显微镜 可观察活细胞，直接观察培养瓶或培养板， 带拍摄等功能。 • 离心机 普通离心机（500～4000rpm），高速离心 机（1000～15000），冷冻离心机等 （离心力转换成转速： g ＝1.118×r2×10－5）
• 用400目不锈钢筛网过滤 • 收集滤液于离心管 4.离心 • 平衡、离心5min，1000～1500 rpm • 去上清，加PBS，混匀，离心（同上） • 重复上一步 5.接种 • 去上清，加3～5ml培养基，混匀，接种于培养瓶 • 加培养基3～5mm深，盖紧盖，观察细胞密度 6.培养 放入培养箱，2天后观察，换液。
操作步骤
1.取材 • 75％酒精浸泡乳鼠2min，取肝脏于平皿中 • PBS溶液洗涤3次 • 去除液体后，剪碎成1～2mm3小块 2.消化 • 加5～8倍组织量的胰蛋白酶溶液 • 转移到离心管内，加盖 • 37℃水浴15min，每5min摇晃1次 • 终止消化：加1ml含血清的培养基DMEM
《细胞传代》PPT课件
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也可将装有细胞的冻存管放入4 ℃ 冰箱 30min,-20℃冰箱30min ，然后放入70℃冰箱中过夜，最后移入液氮容器内
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注意事项
1.待冻存的细胞应具有较高的活力。从增殖期到形 成致密的单层细胞以前的培养细胞都可以用于冻 存，但最好为对数生长期细胞。在冻存前一天最 好换一次培养液；
加入消化液5滴，翻转培养瓶，使消化液浸没细 胞。(一般消化时间为1到5分钟，镜下观察发现 细胞质回缩，胞体变圆)
加入3mlD-Hanks液，轻轻吹打细胞生长面， 使细胞脱离瓶壁后形成细胞悬液。吹打时动作 要轻柔不要用力过猛。
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将细胞悬液移至15ml离心管中， 1000rpm*5min离心。
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培养细胞传代根据不同细胞采取不同的方 法。贴壁生长的细胞用消化法传代；部分 贴壁生长的细胞可直接吹打传代；悬浮生 长的细胞可以采用直接吹打或离心分离后 传代，或用自然沉降法吸除上清后，再吹 打传代。
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操作步骤
选择生长良好的A549细胞一瓶，轻轻摇动培养 瓶数次，悬浮起附着在细胞表面的碎片，然后 连同培养液倒出，用D-Hanks洗1次。
高密度 上皮样细胞
悬浮 圆形 未转化
成纤维样
贴附 成纤维或上皮样
转化后
可成上皮样
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悬浮型：
见于少数特殊的细胞，如某些类型的癌细 胞及白血病细胞。胞体圆形，不贴于支持 物上，呈悬浮生长。这类细胞容易大量繁 殖。
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体内细胞生长在动态平衡环境中，组织培养细胞 的生存环境是甁皿等容器，生存空间和营养是有 限的，当细胞增殖达到一定密度后，需要分离出 一部分细胞和更新营养液，这一过程称传代 （passage或subculture)。传代的频率与接种 细胞数量、细胞生物特性以及营养液的性质等有 关。
原代细胞培养和传代培养的方法
原代细胞培养和传代培养的方法原代培养原理将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。
仪器、材料及试剂仪器：培养箱（调整至37℃），培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37℃）材料：动物组织块试剂：1640培养基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hank′s液，碘酒初代消化培养法1. 准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。
开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。
2. 布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。
3. 处理组织：把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟。
4. 剪切：用眼科剪把组织切成2~3毫米大小的块，以便于消化。
加入比组织块总量多30~50倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角烧瓶中，结扎瓶口或塞以胶塞。
5. 消化：或用恒温水浴，或置于37℃温箱消化均可，消化中每隔20分钟应摇动一次，如用电磁恒温搅拌器消化更好。
消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。
6. 分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。
低速（500~1000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清，加入适量含有血清的培养液。
7. 计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中。
对大多数细胞来说，pH要求在7.2~7.4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHCO3调整。
8. 培养：置于36.5℃温箱培养，如用CO2温箱培养，瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞，纱布塞易生霉菌，每次换液时需要换新塞。
细胞培养PPT课件
悬浮生长型细胞
不需要附着于底物而于悬浮状态下即可生长。见 于各种造血系统肿瘤细胞
细胞培养常用的培养瓶、 培养皿、6孔板、96孔板
贴附生长型细胞
每代贴附生长细胞的生长过程
浸泡时器皿要充满清洁液，勿留气泡或器皿露出清洁液面 浸泡时间：一般为过夜，不应少于6 小时 清洁液 常用三种：重铬酸钾（g）浓硫酸（ml）蒸馏水（ml）
强清洁液 63∶1000∶200 次强清洗液 120∶ 200∶1000 弱清洁液 100∶ 100∶1000
配制时应注意安全，须穿戴耐酸手套和围裙，并要保护好面部 及身体裸露部分
游离期 贴壁期 潜伏期 对数生长期 停止期（平台期）
游离期：
细胞接种后在培养液中呈悬浮状态, 也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞 体呈圆球形。
10分钟一4小时
贴壁期：
细胞附着于底物上，游离期 结束。细胞株平均 在10分钟--4小时贴壁。
底物：胶原、玻璃、塑料、其它细胞等 血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘素、
细胞培养基本技术
医学科研实验中心
基本概念
原代培养 从供体取得组织细胞后在体外进
行的首次培养。 传代培养
将培养的细胞从原培养瓶中加以 分离，经稀释后再接种于新的培养瓶 中。
细胞系(cell line)
原代培养物经首次传代成功后即为细 胞系。
细胞株(cell strain)
通过克隆形成法或选择法从原代培养物 细胞系中获得的具有特殊性质或标志的 培养物。
细胞培养技术的主要优点
㈠ 研究的对象是活的细胞。 ㈡ 研究的条件可以人为的控制。 ㈢ 研究的样本，可以达到比较均一性。 ㈣ 研究的内容便于观察、检测和记录。
细胞培养---原代培养---传代培养
一． 细胞培养基本概念 二． 细胞培养基本要求 三． 细胞培养基本技术
细胞培养定义
定义：
模拟机体内生理条件，将细胞从机体中取出，在人工条件下使其 生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程 等问题的研究。
优点：
1．活细胞：同时、大量、均一性、重复性； 2．可控制： 各种物理、化学、生物等因素可调控； 3．研究方法多样：倒置、荧光、电子、激光共焦显微镜、流式细胞术、
自动双重纯水蒸馏器
纯水仪
酶标仪
微孔板震荡器
培养器皿
Culture flask
Culture Plate
常用玻璃器皿清洗
浸泡（自来水）、刷洗（洗衣粉）、酸泡（24小时）、 流水冲洗、蒸溜水浸泡和冲洗、50℃烘干
清洁液的配制
细胞培养基
干粉培养基和液体培养基
干粉培养基需使用者自己配制并灭 菌，其优点是价格便宜。缺点是配 制过程繁琐，质量不易控制
对数生长期：
细胞数随间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。
停止期（平台期）：
细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂 机制：接触抑制、密度依赖性
二、细胞培养基本要求
常用仪器设备 培养器皿 培养基 血清 其他细胞培养试剂
培养细胞生长的条件
1 细胞的营养需要
原代培养与细胞系
原代培养
（primary culture） 从动物机体取出的进 行培养的细胞群。生 长缓慢，繁殖一定的 代数后（一般10代以 内）停止生长。
细胞株
（cell strain） 从原代培养细 胞群中筛选出 的具有特定性 质或标志的细 胞群，能够繁 殖50代左右， 在培养过程中 其特征始终保 持。
细胞工程-原代及传代细胞培养
因此采用原代培养细胞做实验，如药物 测试、基因表达测试等有其独特优点， 是组织培养工作者应熟知和掌握的技术。 原代细胞培养主要有离散细胞原代培养 和组织块原代培养两种方法。
一、离散细胞原代培养
动物细胞在体内有严密的组织结构，群 体细胞之间以固有的分化方式相互联系、 相互依存。离体之后仍保持原有的组织 结构特性，多数组织的形态是固体结构， 细胞与细胞或细胞与细胞间质之间联系 紧密，要得到大量的离散细胞，必须采 取必要的措施进行人工分离（消化培 养）。
在普通恒温箱中培养细胞，培养容器需
要密闭，以免CO2逸出而造成培养液pH 上升。一但发现这种情况（溶液变红）
要及时调整pH。在CO2或三气培养箱中 进行培养，瓶盖一定要松开，以便换气。
培养过程中每天要检查细胞贴壁情况、
生长与增殖情况，并每隔3～5天更换一
次培养液。细胞铺满瓶壁时要及时进行
传代。
二、组织块原代培养
贴壁细胞传代的基本方法是：吸出培养 瓶内营养液，注入消化液（如0.02％ EDTA和0.25％胰蛋白酶混合液），置 37℃温箱或室温中作用一定时间。在消 化过程中，要在镜下随时监视细胞状态， 当见到细胞胞质回缩，胞体变圆，细胞 间缝隙变大时，便立即终止消化。
吸出消化液，注入适量平衡盐溶液洗 1～2次。吸出平衡盐溶液，加入适量培 养液后，用吸管吹吸营养液，反复轻轻 吹打瓶壁上细胞，使之脱落入培养液中 形成细胞悬液。 细胞悬液经细胞计数后 稀释到适当浓度，或按原培养液体积稀 释2～4倍，分装到2～4个培养瓶中继续 培养（图4-21）。
第四章 动物细胞培养
第四章 动物细胞培养 第一节 细胞培养需要具备的基本条件 第二节 培养基的种类、成分及其作用 第三节 原代及传代细胞培养 第四节 培养细胞的常规检测 第五节 无限细胞系的建立 第六节 动物细胞培养技术的应用
细胞培养基本方法(复苏、换液、传代、冻存).ppt
镜下观察，标明名称，序号和日期。
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6. 用酒精棉球擦板，放入培养箱内，培养24小时。 7. 从培养箱中取出，镜下观察，拿到工作台内，
用200µl的枪将孔内的培养基吸出； 8. 加入不同浓度的药物的无血清培养基,每孔200µl。 9. 盖上96孔板的盖子，拿出工作台，倒置显微镜下
观察，用酒精棉球擦板，放入培养箱内，培养24 小时。 10.从培养箱中取出，镜下观察，拿到工作台内， 每孔加MTT液20µl。
14.用吸管将细胞悬液移至5ml离心管中，盖上盖 子，在离心机内离心，1500转/分钟，时间为15 分钟。
15.离心结束后，拿至工作台内，烧离心管口。去掉 塞子，烧管口。
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16.弃上清液，加冻存液2ml 吹打，使细胞均匀混在 冻存液中，再加3ml冻存液，用吸管吸出打入多 个冻存管中，每管1.5ml。
10. 在倒置显微镜下观察细胞的消化情况。若细胞 变成单个圆形，则可进行传代。
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11.拿到工作台内，烧瓶口，取下盖子，烧瓶 口。用吸管吸出胰酶，烧瓶口。
12.拿出培养基瓶子，烧瓶口和镊子；用镊子 将塞子取出，烧瓶口（至少10圈）。
13.用吸管吸取5ml的培养基打入培养瓶内，用吸管 吹打成单个细胞悬液。
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6. 用吸管吸取3ml的PBS，打入培养瓶内。烧培养 瓶口，来回晃动PBS100次后到掉PBS。重复此 操作一次。
7. 拿出胰酶瓶子，烧瓶口和镊子；用镊子将塞子 取出，烧瓶口（至少10圈）。
8. 用吸管吸取1ml的胰酶，打入培养瓶内，烧培养 瓶口和盖子，盖上盖子；
9. 拿出工作台外，在倒置显微镜下观察细胞，然 后用酒精棉球擦瓶口及瓶身，放入培养箱内；5 分钟后取出；
3. 用酒精擦拭冻存管，放入工作台内。 4. 用镊子将封口膜夹掉，轻烧管口； 5. 用吸管吸出冻存管内的细胞悬液，打入已
原代细胞培养和传代培养的方法
原代细胞培养和传代培养的方法原代培养原理将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。
仪器、材料及试剂仪器：培养箱（调整至37℃），培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37℃）材料：动物组织块试剂：1640培养基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hank′s液，碘酒初代消化培养法1. 准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。
开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。
2. 布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。
3. 处理组织：把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟。
4. 剪切：用眼科剪把组织切成2~3毫米大小的块，以便于消化。
加入比组织块总量多30~50倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角烧瓶中，结扎瓶口或塞以胶塞。
5. 消化：或用恒温水浴，或置于37℃温箱消化均可，消化中每隔20分钟应摇动一次，如用电磁恒温搅拌器消化更好。
消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。
6. 分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。
低速（500~1000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清，加入适量含有血清的培养液。
7. 计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中。
对大多数细胞来说，pH要求在7.2~7.4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHCO3调整。
8. 培养：置于36.5℃温箱培养，如用CO2温箱培养，瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞，纱布塞易生霉菌，每次换液时需要换新塞。
细胞原代培养、传代培养、冻存和复苏
细胞原代培养、传代培养、冻存和复苏1实验原理细胞培养可分为原代培养和传代培养。
直接从体内获取的组织细胞进行首次培养为原代培养；当原代培养的细胞增殖达到一定密度后，则需要做再培养，即将培养的细胞分散后，从一个容器以1：2或其他比率转移到另一个或几个容器中扩大培养，为传代培养，传代培养的累积次数就是细胞的代数。
细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。
目前细胞冻存多采用甘油或DMSO作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。
复苏细胞应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。
2实验方法一：材料小鼠，生理盐水，100ml灭菌烧杯，15ml离心管，培养皿，滴管，无菌镊子、剪刀，筛网，泡沫板，大头针，酒精灯，培养瓶，培养液，PBS，0.25%胰酶，超净工作台、二氧化碳培养箱、倒置显微镜，显微镜，计数板，离心机，恒温水浴箱，冰箱（4℃、-20℃、-70℃），液氮罐，冻存管，冻存液，废液缸等。
二：方法（1）原代培养：1.取出小鼠后沥干酒精，放入超净台内，固定在泡沫板上。
2.用镊子提起皮肤，用解剖剪剪开皮肤一个横切口，将皮肤向上撕开，然后剪开肌肉等，暴露出腹腔，在左侧找到脾脏，用弯头眼科镊取出脾脏，置于无菌培养皿中。
3.用生理盐水将取出的脾脏清洗多次，并剔除多余无用的组织。
4.将筛网置于平皿中，脾脏置于筛网上，用弯头镊镊住，轻轻在筛网上进行碾磨，同时不停滴加不含血清的培养液冲洗。
5.将碾磨好的细胞悬液吸入至离心管中，离心(1000rpm,5min)，吸去上清（去除血液等）。
6.加入10ml培养液，吹打混匀，取样计数。
7.将稀释好的细胞悬液分装于培养瓶中，轻轻摇晃混匀，在培养瓶上。
面做好标志，注明细胞、组别及日期。
原代培养和传代培养的理解
一、原代培养和传代培养1、原代培养定义：将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、化学试剂或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。
注意：人体是复杂的，一般从器官取出的组织都是很多类型细胞混合组成的（规范的说是多克隆，定义见下一条），也就是有很多种类型的细胞，基本上是不可能提取出来一种类型的细胞（单克隆）的，那个概率太小了。
TIPS：克隆在细胞培养中的定义：是原代培养开始时，揪出来的那一坨组织中的细胞类型数，有一种类型就是单克隆，两种类型就是两个克隆，很多类型就是多克隆（比如你肌肉组织，里面不但有肌肉细胞还有神经细胞，于是就是双克隆）2、传代培养定义：细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再培养）。
传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。
同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。
贴壁细胞需经消化后才能分瓶。
记住：神经细胞等终末分化细胞是没有传代培养的，因为它们无法复制注意：十代之前为原代，十代之后为传代的说法是完全可以的，但这是一个经验规律（一般细胞培养十代长满培养基），不具有普适性，但做题的时候用的基本上都是这个，不要杠精，特殊说明除外。
TIPS:癌细胞是一种特殊的细胞，它不具有贴壁生长特性，还不具有接触抑制作用，所以临床上常说癌细胞具有扩散性细胞系：直译就是细胞的集合，实际意义是进行传代培养后（这是前提！！！），对原代培养所使用的那一坨组织的称呼。
二、分离：酶消化分离法酶消化分离法常采用胰蛋白酶和胶原酶1、胰蛋白酶分散原理：胰蛋白酶是一种胰脏制品，对蛋白质有水解作用，主要作用于赖氨酸或精氨酸相连接的肽键，使细胞间质中的蛋白质水介而使细胞分散开。
为什么不用胃蛋白酶？因为胃蛋白酶最适PH值2.0左右，而且胃蛋白酶很生猛，消化完不但细胞之间连接没了，细胞也没了。
细胞培养-原代培养-传代培养
鼠胎组织细胞原代培养
换液：
全量换液和半量换液
换液时机的选择：
培养液pH值：细胞生长旺盛，代谢产生酸性物质积累增多， pH值下降，营养液酸化变黄，。 细胞状态
细胞换液
细胞传代
细胞传代方法
根据细胞生长的恃点，传代方法有3种。 1.悬浮生长细胞传代 离心法传代：离心（1000转/分）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。 直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除1/2一2/3，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。 2 半悬浮生长细胞传代（Hela细胞） 此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。 3贴壁生长细胞传代 采用酶消化法传代。常用的消化液有0.25％的胰蛋白酶液。
红色表示中性pH 黄色代表酸性pH 紫色表示碱性pH
在一些特殊培养液中不含酚红
酚红
水：新鲜配置的三蒸水或去离子水 平衡盐溶液：无Ca2+、Mg2+的缓冲液 PBS：NaCl 8.0 g KCl 0.2 g Na2HPO4.H2O 1.56 g KH2PO4 0.20 加水至1000 ml
01
细胞原代培养
02
细胞换液与传代
03
细胞冻存与复苏
三、细胞培养基本技术
取材：用颈椎脱位法使孕鼠迅速死亡。把整个孕鼠浸入盛有75％乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入超净台。用消过毒的剪刀在躯干中部环行剪开皮肤，剖腹取出子宫置于无菌平皿中。用消过毒的剪刀剪开子宫，取出鼠胎，剪去头、爪，以平衡盐溶液洗去血污
01
碳酸氢钠 2.0 g
02
03
加三蒸水 至 1000ml, 过滤除菌。
04
调节pH值至7.2
细胞原代培养课时课件PPT
含义:包含 ①原代培养实质是初次培养，即培养物接种 到培养器皿中就不再分割，任其生长繁殖； ②原代培养中的“代”并不是指细胞繁殖的 “代”数； ③原代培养过程中不分割培养物不等于不更 换培养液。
特点
(1)性质 ①性状似体内，可表达某些形态、结构、功能,
防腐(antisepsis)和防腐剂 消化后组织不仅要尽量使消化液失活，以避免毒性产生，而且动作要轻，以避免膨松的细胞随漂洗而丢失。
影响胰蛋白酶作用的主要因素 需及时传代 传不传代及何时传代
根接据种的抑细胞数菌量 (bacteriostasis)
培养瓶皿的大小
无菌(asepsis) 培养条件
在一定程度上具有可人为操作的特征 去除无用组织和避免干燥； 有关数据的计算要事先做好。
【操作】
进行培养时，动作要准确敏捷，但又不必太快， 以防空气流动，增加污染机会。
不能用手触及已消毒器皿，如已接触，要用火 焰烧灼消毒或取备品更换。
二、原代培养 Primary culture
1.细胞原代培养概论
概念
从体内取出组织细胞开始培养到第一次进行传代之前 的时期，一个特征性的必然的生长阶段。
浮生 存。
特点发展过程
选择第二步: 时间数小时后至铺满 (汇合confluence) 变化数小时后至进一步选择中 3种情况:能增殖 能存活 不能存活 细胞类型继续改变,至铺满
特点发展过程
选择第三步:
经离心后由于各种细胞的比重不同可在分层液中形成不同层，这样可根据需要收获目的细胞。
时间铺满后 离开净化室必须断开必要的仪器电源；
【火焰消毒】 进入原代培养室需彻底洗手还要戴口罩、着消毒衣帽。
《原代细胞培养实验》PPT课件
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3
实验内容：
❖ 动物的选择：
选择大约一半足孕时间的胚胎，10－13 天龄胚胎含有最大数量的未分化的间质细胞， 成纤维细胞可从这些细胞衍生获得。
每组小鼠胚胎2-5个
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4
实验材料：
❖ 每组的超净台中有以下物品：
❖ 1. 50ml 配制好的RPMI1640培养液1瓶；8ml小牛 血清（FCS) 1瓶；100ml 0.25%胰蛋白酶 1瓶； PBS(-)1 瓶
❖ 4)在温暖的环境中或置于37 °C培养箱中轻轻摇动15分 钟。
❖ 5)让存留的组织块在重力作用下慢慢沉降，将含有悬浮 细胞的液体转移至一无菌50ml的离心管中，该管内按照 每10ml上清加入l ml小牛血清的比例加入牛血清以灭活, 胰蛋白酶。
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10
❖ 6)加人新鲜胰蛋白酶溶液(见前述步骤)于含有残留未消化组 织块的原来的50ml离心筒中，重复步骤4和5。
3在无菌状态下将绞碎的胚胎转移于一50ml的无菌离加入40ml025的无菌胰蛋白酶用搅拌棒轻轻搅动4在温暖的环境中或置于37c培养箱中轻轻摇动15分5让存留的组织块在重力作用下慢慢沉降将含有悬浮细胞的液体转移至一无菌50ml的离心管中该管内按照每10ml上清加入lml小牛血清的比例加入牛血清以灭活胰蛋白酶
❖ 2. 100ml灭菌烧杯2个；
❖ 3、50ml离心筒2个
❖ 4、灭菌培养皿1个，细胞培养瓶1个
❖ 4、1ml ，200μl移液器各1支；枪头盒2个；无菌 玻璃搅拌棒1个
❖ 5、细胞计数板1块；
❖ 6、灭好菌的镊子1把，剪刀1把；
❖ 7、酒精灯1台；
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5
试验操作步骤：
❖ 1)胚胎的分离。适用哺乳动物(仓鼠、小鼠和大鼠)
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接触抑制（Contact inhibition）
细胞相互接触时，将停 止增长； 细胞停留在细胞周期的 G0期；
转化的细胞却可以继续 生长导致细胞重叠堆积 生长。
细胞传代次数（Passage Number）
• 体外培养的细胞增殖能力不是无限的，传代次数有一 定的界限，称为“ Hayflick极限”。
（primary culture） 从动物机体取出的进 行培养的细胞群。生 长缓慢，繁殖一定的 代数后（一般10代以 内）停止生长。
（cell strain） 从原代培养细 胞群中筛选出 的具有特定性 质或标志的细 胞群，能够繁 殖50代左右， 在培养过程中 其特征始终保 持。
（cell line） 从肿瘤组织 培养建立的 细胞群或培 养过程中发 生突变或转 化的细胞， 在培养条件 下可无限繁 殖
• 传代次数与物种寿命有关：小鼠寿命3年，传代12次； 龟寿命200年，传代140次。
• 传代次数与个体年龄成反比：人胚胎，40-60代； 幼 年，20-40代；成年，10-30代；早老病儿童，2-10代。
原代培养与细胞系
原代培养 细胞株 细胞系 克隆 （clone）亦称无 性繁殖系或无性 系。对细胞来说， 克隆是指由同一 个祖先细胞通过 有丝分裂产生的 遗传性状一致的 细胞群。
原代培养细胞的生命归宿
原代培养期 传代期 衰退期
细胞系资源
• The American Type Culture Collection (ATCC) • The European Collection of Animal Cell Culture (ECACC) • National Institute of Health (NIH), USA • National Cancer Institute (NCI), USA
Biblioteka 潜伏期此时细胞有生长话动，而无细胞分裂。细胞株潜伏期 一般为6～24小时。
对数生长期：
细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。
停止期（平台期）：
细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂 机制：接触抑制、密度依赖性
二、细胞培养基本要求
常用仪器设备 培养器皿 培养基 血清 其他细胞培养试剂
有限细胞系，无限细胞系 细胞系 cell line
细胞株 cell strain
培养细胞的特性
培养细胞的生长方式
贴附生长： 必须贴附于支持物表面才能生长。见于各种实体瘤细胞 悬浮生长： 于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物表面。见 于各种造血系统肿瘤细胞
每代贴附生长细胞的生长过程
细胞原代培养与传 代
目录
一．
二．
三．
细胞培养基本概念 细胞培养基本要求 细胞培养基本技术
细胞培养定义
定义：
模拟机体内生理条件，将细胞从机体中取出，在人工条件下使其 生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程 等问题的研究。
优点：
1．活细胞：同时、大量、均一性、重复性； 2．可控制： 各种物理、化学、生物等因素可调控； 3．研究方法多样：倒置、荧光、电子、激光共焦显微镜、流式细胞术、 免疫组织化学、原位杂交、同位素标记； 4．应用广： 不同物种、不同年龄、不同组织、正常或异常（肿瘤）；
培养细胞生长的条件
1 细胞的营养需要 2 细胞的生存环境 温度: 37 ℃ O2 CO2: 5% CO2 +H2O ← →H2CO3 ← →H+ + HCO3pH: 7.2-7.4 渗透压 3 无污染 4 无毒
细胞培养的环境
细胞在体外培养中所需的条件与体内细胞基本相同。 1、无污染环境培养环境无毒和无菌是保证细胞生存的首要条件。当细胞放置于体外培养 时，与体内相比细胞丢失了对微生物和有毒物的防御能力，一旦被污染或自身代谢物质积 累等，可导致细胞死亡。因此在进行培养中，保持细胞生存环境无污染、代谢物及时清除 等，是维持细胞生存的基本条件。 2 、恒定的温度 维持细胞旺盛生长,必须有恒定适宜的温度.一般标准温度为36.5℃±0.5℃，偏离这一温 度范围，细胞的正常代谢会受到影响，甚至死亡。培养细胞对低温的耐受力较对高温强， 温度上升不超过39℃时，细胞代谢与温度成正比；人体细胞在39-40℃1小时，即能受到 一定损伤，但仍有可能恢复；在40-41℃1小时，细胞会普遍受到损伤，仅小半数有可能恢 复；41-42℃1 小时，细胞受到严重损伤，大部分细胞死亡，个别细胞仍有恢复可能；当 温度在43℃以上1小时，细胞全部死亡。 3、气体环境 气体是人体细胞培养生存必需条件之一，所需气体主要有氧气和二氧化碳。氧气参与 三羧酸循环，产生供给细胞生长增殖的能量和合成细胞生长所需用的各种成分。开放培养 时一般把细胞置于95%空气加5%二氧化碳混合气体环境中。二氧化碳既是细胞代谢产物， 也是细胞生长繁殖所需成分，它在细胞培养中的主要作用在于维持培养基的PH 值。大多 数细胞的适宜PH 为7.2—7.4，偏离这一范围对细胞培养将产生有害的影响。但细胞耐酸 性比耐碱性大一些，在偏酸环境中更利于细胞生长。
游离期 贴壁期 潜伏期 对数生长期 停止期（平台期）
游离期： 细胞接种后在培养液中呈悬浮 状态．也称悬浮期。此 时细胞质回缩，胞体呈圆球形。
10分钟一4小时
贴壁期：
细胞附着于底物上，游离期 结束。细胞株平均在10分钟一4小时 贴壁。 底物：胶原、玻璃、塑料、其它细胞等 血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘素、胶原等糖蛋白 （生长基质），这些带正电荷的糖蛋白的促贴壁因子先吸附于底 物上，悬浮细胞再与吸附有促贴壁因子的附着。 进口塑料培养瓶涂有生长基质（化学合成的功能基团）
缺点：
人工所模拟的条件与体内实际情况仍不完全相同； 当细胞被置于体外培养后，生活在缺乏动态平衡的环境中，时间久了 ，必然发生变化。
细胞培养的基本概念
传代：
细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到 新的培养器皿中。 原代培养 取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长的细胞在 传代之前称为原代培养。