细胞的原代和传代培养PPT讲稿
原代培养和传代培养
原代培养:即第一次培养，是指将培养物放置在体外生长环境中持续培养，中途不分割培养物的培养过程。
有几方面含义：●培养物一经接种到培养器皿（瓶）中就不在分割，任其生长繁殖；●原代培养中的“代”并非细胞的“代”数，因为培养过程中细胞经多次分裂已经产生多代子细胞；●原代培养过程中不分割培养物不等于不更换培养液，也不等于不更换培养器皿。
正常细胞培养的世代数有限，只有癌细胞和发生转化的细胞才能无限生长下去。
所谓转化即是指正常细胞在某种因子的作用下发生突变而具有癌性的细胞。
目前世界上许多实验室所广泛传用的HeLa细胞系就是1951年从一位名叫Henrietta Lacks的妇女身上取下的宫颈癌细胞培养而成。
此细胞系一直延用至今。
原代培养的细胞一般传至10代左右就不易传下去了，细胞的生长就会出现停滞，大部分细胞衰老死亡。
但是有极少数的细胞能够度过“危机”而继续传下去，这些存活的细胞一般能够传到40～50代，这种传代细胞叫做细胞株。
细胞株的遗传物质没有发生改变,在培养过程中其特征始终保持。
当细胞株传至50代以后又会出现“危机”，不能再传下去。
但是有部分细胞的遗传物质发生了改变，并且带有癌变的特点，有可能在培养条件下无限制地传代下去，这种传代细胞称为细胞系。
原代培养是建立各种细胞系（株）必经的阶段，其是否成功与组织污染与否、供体年龄、培养技术和方法、适宜培养基的选择等多种因素有关。
由于原代培养的细胞转化性极小，对病毒敏感性好，因此适应制备疫苗等生物制品；但也存在有潜在外源因子、不能事先检查标本、且受供体年龄健康状况的影响而导致批间差异大等缺陷。
目前常用的原代细胞培养有鸡胚成纤维细胞及猪肾、猴肾、地鼠肾等原代细胞。
原代培养的基本过程包括取材、培养材料的制备、接种、加培养液、置培养条件下培养等步骤，在所有的操作过程中，都必须保持培养物及生长环境的无菌。
多数情况下，分散的细胞若属于贴壁依赖型细胞，就能黏附、铺展于培养器皿和载体表面生长而形成细胞单层，这种培养方式称为单层细胞培养（monolayer culture），又叫贴壁培养（adherent culture）。
细胞传代培养和原代培养
细胞传代培养和原代培养一：原代细胞培养(一)原理：细胞培养(Cell culture)是模拟机体内生理条件，将细胞从机体中取出，在人工条件下使其生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。
近年来，广泛地应用于分子生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学、细胞工程等领域，发展成一种重要生物技术，并取得显著成就。
由体内直接取出组织或细胞进行培养叫原代培养。
原代培养细胞离体时间短，性状与体内相似，适用于研究。
一般说来，幼稚状态的组织和细胞，如：动物的胚胎、幼仔的脏器等更容易进行原代培养。
(二)操作：1．取材：用颈椎脱位法使乳兔迅速死亡。
然后，把整个动物浸入盛有75％乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入超净台。
用消过毒的剪刀剪开用和乙醇再次消毒后的皮肤，剖腹取出肝脏或肾脏。
置于无菌平皿中。
2．切割：用灭菌的PBS液将取出的脏器清洗三次，然后用眼科手术剪刀仔细将组织反复剪碎，直到成1mm3左右的小块，再用PBS清洗，洗到组织块发白为止。
移入无菌离心管中，静置数分钟，使组织块自然沉淀到管底，弃去上清。
3．消化、接种培养：吸取0.25％胰蛋白酶一0.02％混合消化液1ml，加入离心管中，与组织块混匀后，加上管口塞子，37℃水浴中消化8～10分钟，每隔几分钟摇动一下试管，使组织与消化液充分接触，静止，吸去上清，向离心管中加入5～10ml含5％小牛血清的MEM培养基，用吸管吹打混匀，移入二个培养瓶中，置于二氧化碳培养箱中培养。
(三)结果:细胞接种后一般几小时内就能贴壁，并开始生长，如接种的细胞密度适宜，5天到一周即可形成单层。
二：传代细胞培养(一)原理：体外培养的原代细胞或细胞株要在体外持续地培养就必须传代，以便获得稳定的细胞株或得到大量的同种细胞，并维持细胞种的延续。
培养的细胞形成单层汇合以后，由于密度过大生存空间不足而引起营养枯竭，将培养的细胞分散，从容器中取出，以1:2或l:3以上的比率转移到另外的容器中进行培养，即为传代培养。
传代培养和原代培养的概念辨析
传代培养和原代培养的概念辨析1．原代培养和传代培养的概念从机体上获取的组织，通过酶或机械方法分散成单个细胞进行培养，在首次传代前的培养一般称为原代培养。
原代培养的最大优点是：组织细胞刚脱离机体，生物性状尚未发生较大变化，在一定程度上能够反映体内的状态。
原代培养的细胞在生长、繁殖一定时间后，由于空间不足或细胞密度过大导致营养枯竭，会影响细胞的生长，因此需要进行扩大培养，即传代或称为传代培养，也就是将细胞按1：2~1：4的比例传代。
但严格说来，不论在进行传代时稀释与否，将细胞从一个培养瓶转移到另一个培养瓶即称为传代培养。
传代代数与细胞的世代（增殖代数）并不是同一个概念。
在细胞培养时，所说的“第10代细胞”，仅指该细胞已经传代10次；细胞传一代后，一般能倍增3~6次，经过三个阶段，即潜伏期、指数生长期和平台期。
当细胞达到平台期时，就需要进行传代培养，否则细胞会中毒，发生形态改变，甚至死亡。
2．关于传代培养在进行传代时，如果是悬浮细胞，只需简单稀释即可，若需完全更换培养液只需低速离心沉淀，再悬浮于合适的培养液中即可。
一般细胞每毫升接种数量为5?104~8?105个，传代密度太低，细胞容易死亡，表现出细胞在达到增长前有较长的滞留期。
在培养过程中，培养液会由于pH下降而呈现黄色，表明细胞已经达到最大密度需要换液或进行传代培养。
如果是单层贴壁的细胞，等长满培养瓶表面，即可进行传代，多数细胞需用胰蛋白酶处理将细胞从生长物表面分离下来，以促进传代培养。
3．细胞系和细胞株细胞系和细胞株，两者曾一度混用，导致有些文献中概念不清。
下面所指的概念是现在国内外比较通用的，也是绝大多数研究者接受的观点。
原代培养物经首次传代成功即称为细胞系（Cell Line），因此细胞系可泛指一般可能传代的细胞。
其中能够连续传代的细胞叫做连续细胞系或无限细胞系，不能连续培养的称为有限细胞系。
大多数二倍体细胞为有限细胞系。
通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得具有特殊性质或标志物的培养物称为细胞株（Cell Strain），也就是说，细胞株是用单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单细胞增殖形成的细胞群。
传代培养法
传代培养法是一种细胞培养技术，用于将原代细胞转化为可反复传代的细胞系。
这种方法的步骤如下：
1. 原代细胞适应阶段：原代细胞从组织中分离出来后，需要经过适应阶段以适应该培养环境。
在此期间，细胞逐渐适应贴壁生长，并逐渐分裂增殖。
2. 传代阶段：当原代细胞生长到一定阶段后，需要进行传代。
传代是将原代细胞接种到新的培养液中，以继续增殖生长。
传代过程中需要注意细胞的生长状态和密度，以避免过度生长或污染。
3. 维持培养：传代后的细胞系需要继续培养，以维持其生长和增殖。
在此过程中，需要定期更换培养液，以避免代谢产物的积累和细菌污染。
4. 细胞冻存：为了保持细胞的活力和稳定性，需要进行细胞冻存。
细胞冻存是将细胞保存在低温下，以延长细胞的寿命并保持其遗传稳定性。
传代培养法是一种常用的细胞培养技术，可以用于原代细胞的扩大培养和细胞的遗传稳定性研究。
同时，传代培养法还可以用于制备疫苗、基因治疗和组织工程等领域。
细胞原代培养、传代培养、冻存和复苏
细胞原代培养、传代培养、冻存和复苏细胞培养是指将生物体内分离出的细胞种植在培养基中，供其生长和繁殖的实验过程。
细胞培养已成为生命科学和医学研究中不可或缺的基础工具。
在细胞培养中，常见的术语有原代培养、传代培养、冻存和复苏。
原代培养原代培养是将从组织中分离出的细胞直接进行培养，即首次培养。
通常将组织切割成小段或分散成单细胞悬液，加入培养基中，使其中的细胞粘附在培养基表面上生长。
原代培养中所得细胞经常受到组织来源、细胞类型和培养条件等因素的影响，因此可能表现出较高的细胞异质性。
传代培养传代培养是将进行了原代培养的细胞进行维持和扩增的过程。
在细胞生长到足够数量时，将细胞分散到更大容量的培养器中，以继续扩增细胞数量。
传代培养次数过多时可能导致细胞老化并失去功能。
在细胞传代培养过程中，注意以下几点：•选择合适的培养基和培养条件；•周期性检测细胞的形态、生长状态和细胞数目；•保持细胞复合度和细胞同型性。
冻存为了保存细胞株，通常会将细胞用特殊培养基和添加剂冻存。
冻存过程中，细胞首先保护在保护剂中，然后在液氮的温度下迅速冷冻，以避免细胞深受冰晶形成的伤害。
冻存后的细胞可保存数年，并可进行后续的实验研究。
## 复苏冻存后，需要将细胞复苏。
推荐以下步骤：•用生长培养基预热，将细胞移植到生长培养基中，尽量使样品在细胞数目、时间和温度上保持一致；•在细胞培养箱中培养，控制CO2浓度（通常为5％）和口袋气体混合在空气中的湿度；•更换完整的生长培养基，加入所需的辅助剂，如血清或其它所需的生长因子。
如上所述，细胞培养是生物学和医学研究中不可或缺的基础工具。
正确地进行细胞培养和细胞处理很重要，因为不同的操作条件将影响最终培养出的细胞的数量和质量。
在实验中进行细胞培养和处理时，应该遵守正式的安全和操作规程。
《细胞传代》PPT课件
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也可将装有细胞的冻存管放入4 ℃ 冰箱 30min,-20℃冰箱30min ，然后放入70℃冰箱中过夜，最后移入液氮容器内
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注意事项
1.待冻存的细胞应具有较高的活力。从增殖期到形 成致密的单层细胞以前的培养细胞都可以用于冻 存，但最好为对数生长期细胞。在冻存前一天最 好换一次培养液；
加入消化液5滴，翻转培养瓶，使消化液浸没细 胞。(一般消化时间为1到5分钟，镜下观察发现 细胞质回缩，胞体变圆)
加入3mlD-Hanks液，轻轻吹打细胞生长面， 使细胞脱离瓶壁后形成细胞悬液。吹打时动作 要轻柔不要用力过猛。
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将细胞悬液移至15ml离心管中， 1000rpm*5min离心。
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培养细胞传代根据不同细胞采取不同的方 法。贴壁生长的细胞用消化法传代；部分 贴壁生长的细胞可直接吹打传代；悬浮生 长的细胞可以采用直接吹打或离心分离后 传代，或用自然沉降法吸除上清后，再吹 打传代。
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操作步骤
选择生长良好的A549细胞一瓶，轻轻摇动培养 瓶数次，悬浮起附着在细胞表面的碎片，然后 连同培养液倒出，用D-Hanks洗1次。
高密度 上皮样细胞
悬浮 圆形 未转化
成纤维样
贴附 成纤维或上皮样
转化后
可成上皮样
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悬浮型：
见于少数特殊的细胞，如某些类型的癌细 胞及白血病细胞。胞体圆形，不贴于支持 物上，呈悬浮生长。这类细胞容易大量繁 殖。
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体内细胞生长在动态平衡环境中，组织培养细胞 的生存环境是甁皿等容器，生存空间和营养是有 限的，当细胞增殖达到一定密度后，需要分离出 一部分细胞和更新营养液，这一过程称传代 （passage或subculture)。传代的频率与接种 细胞数量、细胞生物特性以及营养液的性质等有 关。
细胞的原代培养与传代培养
细胞的原代培养与传代培养原代培养通过组织块直接长出单层细胞或用酶或机械方法将组织分散成单个细胞开始培养，在首次传代前的培养可认为是原代培养。
原代培养最大的优点是，组织和细胞刚刚离体，生物性状尚未发生很大变化，在一定程度上能反映体内状态。
特别是在细胞培养会合时，原代培养的某些特殊功能表达尤为强烈。
在这样的培养阶段能更好地显示与亲体组织紧密结合的形态学特征。
在供体来源充分、生物学条件稳定的情况下，采用原代培养做各种实验，如药物测试、细胞分化等，效果很好。
但应注意，原代培养组织是由多种细胞成分组成的，比较复杂。
即使全为同一类型的细胞，如上皮细胞或成纤维细胞，也仍具有异质性，在分析细胞生物学特性时比较困难。
其次，由于供体的个体差异及其他一些原因，细胞群生长效果有时也不一致。
原代培养也是建立各种细胞系（株）必经的阶段。
假如原代培养能够维持几小时甚至更长，即可进行进一步筛选。
有的细胞具有继续增殖能力，有的细胞类型只是存活而不增殖，而另外一些细胞只是在特殊条件下应用而不存活，因而细胞类型的分布将会改变。
在单层培养的情况下，瓶底全部铺满细胞，达到会合以后，对密度有依赖性的细胞则逐渐减少生长，而失去密度依赖敏感性的细胞则生长增加，天然或自发转化的细胞则过度生长。
借助于频繁传代，保持细胞低密度生长，有利于保存细胞的正常表型（如小鼠成纤维细胞）。
而自发转化则倾向于高细胞密度的过度生长。
细胞密度过大，培养基消耗将尽，细胞代谢产物积聚过度，细胞增殖变慢，应进行传代培养。
传代培养原代培养形成的单层细胞汇合以后，需要进行分离培养，否则细胞会因生成空间不足或由于细胞密度过大引起营养枯竭，都将影响细胞的生长，这一程序常称为传代或传代培养。
原代培养在首次传代时即为细胞系，能连续培养下去的为连续细胞系；不能连续培养的为有限细胞系。
通常，传代培养是指扩大培养，也就是将一份细胞一分为二或者一分为三进行培养等。
但严格说来，不论稀释与否，将细胞从一个培养瓶转移或移植到另一个培养瓶即称为传代或传代培养。
细胞培养---原代培养---传代培养
一． 细胞培养基本概念 二． 细胞培养基本要求 三． 细胞培养基本技术
细胞培养定义
定义：
模拟机体内生理条件，将细胞从机体中取出，在人工条件下使其 生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程 等问题的研究。
优点：
1．活细胞：同时、大量、均一性、重复性； 2．可控制： 各种物理、化学、生物等因素可调控； 3．研究方法多样：倒置、荧光、电子、激光共焦显微镜、流式细胞术、
自动双重纯水蒸馏器
纯水仪
酶标仪
微孔板震荡器
培养器皿
Culture flask
Culture Plate
常用玻璃器皿清洗
浸泡（自来水）、刷洗（洗衣粉）、酸泡（24小时）、 流水冲洗、蒸溜水浸泡和冲洗、50℃烘干
清洁液的配制
细胞培养基
干粉培养基和液体培养基
干粉培养基需使用者自己配制并灭 菌，其优点是价格便宜。缺点是配 制过程繁琐，质量不易控制
对数生长期：
细胞数随间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。
停止期（平台期）：
细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂 机制：接触抑制、密度依赖性
二、细胞培养基本要求
常用仪器设备 培养器皿 培养基 血清 其他细胞培养试剂
培养细胞生长的条件
1 细胞的营养需要
原代培养与细胞系
原代培养
（primary culture） 从动物机体取出的进 行培养的细胞群。生 长缓慢，繁殖一定的 代数后（一般10代以 内）停止生长。
细胞株
（cell strain） 从原代培养细 胞群中筛选出 的具有特定性 质或标志的细 胞群，能够繁 殖50代左右， 在培养过程中 其特征始终保 持。
《细胞培养基础》PPT课件
▪ 指数生长期是细胞活力最好的时期，可对 细胞进行各种实验
▪ 指数生长期持续3-5d后，随细胞数量不断 增多，生长空间日趋减少，细胞相互接触 汇合成片，呈现接触抑制。而恶性细胞则 无接触抑制现象。
• 除少数特别注明对DMSO 敏感之细胞外， 绝大部分细胞株（包括悬浮性细胞）， 在解冻之后，应直接放入含有10-15ml 新鲜培养基之培养角瓶中，待隔天再置 换新鲜培养基以去除DMSO 即可，如此 可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴 附之问题
支原体(mycoplasma) 污染的细胞， 是否能以肉眼观察出异状？
▪ 癌细胞则由于营养成分的消耗和细胞代谢 产物的影响而发生密度抑制
（三）停滞期：
即细胞数量达到饱和密度后，细胞 与营养液的交换面积减少，代谢产物积 累，pH下降细胞停止增殖，进入停滞期。
在此时应及时进行传代，否则因细胞 中毒受损，大量细胞出现死亡，至少再 传1-2代后，细胞才能恢复。
细胞的传代培养操作
细胞培养的污染和检测
• 细胞污染的种类 细菌、酵母菌、霉菌和病毒 • 污染源 无菌操作技术不当 操作室环境不佳 污染之血清 污染之细胞
细菌培养液被洋葱佰克霍尔德菌污染了。 洋葱佰克霍尔德菌（Burkholderiacepacia）原属假单 胞菌属，是植物病原菌。
白色念珠菌污染
真菌感染
支原体污染电镜照片, 煎蛋状和其他形状
– 分离培养物，检测支原体。清洁支架和培养 箱。如发现支原体污染，丢弃培养物
• 培养液中无贴壁因子
原代细胞培养物污染
• 原代培养组织在进入培养前已污染
– 培养前用含高浓度抗生素的平衡盐溶液 反复冲洗组织
细胞培养基本方法(复苏、换液、传代、冻存).ppt
镜下观察，标明名称，序号和日期。
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6. 用酒精棉球擦板，放入培养箱内，培养24小时。 7. 从培养箱中取出，镜下观察，拿到工作台内，
用200µl的枪将孔内的培养基吸出； 8. 加入不同浓度的药物的无血清培养基,每孔200µl。 9. 盖上96孔板的盖子，拿出工作台，倒置显微镜下
观察，用酒精棉球擦板，放入培养箱内，培养24 小时。 10.从培养箱中取出，镜下观察，拿到工作台内， 每孔加MTT液20µl。
14.用吸管将细胞悬液移至5ml离心管中，盖上盖 子，在离心机内离心，1500转/分钟，时间为15 分钟。
15.离心结束后，拿至工作台内，烧离心管口。去掉 塞子，烧管口。
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16.弃上清液，加冻存液2ml 吹打，使细胞均匀混在 冻存液中，再加3ml冻存液，用吸管吸出打入多 个冻存管中，每管1.5ml。
10. 在倒置显微镜下观察细胞的消化情况。若细胞 变成单个圆形，则可进行传代。
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11.拿到工作台内，烧瓶口，取下盖子，烧瓶 口。用吸管吸出胰酶，烧瓶口。
12.拿出培养基瓶子，烧瓶口和镊子；用镊子 将塞子取出，烧瓶口（至少10圈）。
13.用吸管吸取5ml的培养基打入培养瓶内，用吸管 吹打成单个细胞悬液。
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6. 用吸管吸取3ml的PBS，打入培养瓶内。烧培养 瓶口，来回晃动PBS100次后到掉PBS。重复此 操作一次。
7. 拿出胰酶瓶子，烧瓶口和镊子；用镊子将塞子 取出，烧瓶口（至少10圈）。
8. 用吸管吸取1ml的胰酶，打入培养瓶内，烧培养 瓶口和盖子，盖上盖子；
9. 拿出工作台外，在倒置显微镜下观察细胞，然 后用酒精棉球擦瓶口及瓶身，放入培养箱内；5 分钟后取出；
3. 用酒精擦拭冻存管，放入工作台内。 4. 用镊子将封口膜夹掉，轻烧管口； 5. 用吸管吸出冻存管内的细胞悬液，打入已
原代细胞培养和传代培养的方法
原代细胞培养和传代培养的方法原代培养原理将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。
仪器、材料及试剂仪器：培养箱（调整至37℃），培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37℃）材料：动物组织块试剂：1640培养基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hank′s液，碘酒初代消化培养法1. 准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。
开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。
2. 布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。
3. 处理组织：把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟。
4. 剪切：用眼科剪把组织切成2~3毫米大小的块，以便于消化。
加入比组织块总量多30~50倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角烧瓶中，结扎瓶口或塞以胶塞。
5. 消化：或用恒温水浴，或置于37℃温箱消化均可，消化中每隔20分钟应摇动一次，如用电磁恒温搅拌器消化更好。
消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。
6. 分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。
低速（500~1000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清，加入适量含有血清的培养液。
7. 计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中。
对大多数细胞来说，pH要求在7.2~7.4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHCO3调整。
8. 培养：置于36.5℃温箱培养，如用CO2温箱培养，瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞，纱布塞易生霉菌，每次换液时需要换新塞。
细胞原代培养、传代培养、冻存和复苏
细胞原代培养、传代培养、冻存和复苏1实验原理细胞培养可分为原代培养和传代培养。
直接从体内获取的组织细胞进行首次培养为原代培养；当原代培养的细胞增殖达到一定密度后，则需要做再培养，即将培养的细胞分散后，从一个容器以1：2或其他比率转移到另一个或几个容器中扩大培养，为传代培养，传代培养的累积次数就是细胞的代数。
细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。
目前细胞冻存多采用甘油或DMSO作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。
复苏细胞应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。
2实验方法一：材料小鼠，生理盐水，100ml灭菌烧杯，15ml离心管，培养皿，滴管，无菌镊子、剪刀，筛网，泡沫板，大头针，酒精灯，培养瓶，培养液，PBS，0.25%胰酶，超净工作台、二氧化碳培养箱、倒置显微镜，显微镜，计数板，离心机，恒温水浴箱，冰箱（4℃、-20℃、-70℃），液氮罐，冻存管，冻存液，废液缸等。
二：方法（1）原代培养：1.取出小鼠后沥干酒精，放入超净台内，固定在泡沫板上。
2.用镊子提起皮肤，用解剖剪剪开皮肤一个横切口，将皮肤向上撕开，然后剪开肌肉等，暴露出腹腔，在左侧找到脾脏，用弯头眼科镊取出脾脏，置于无菌培养皿中。
3.用生理盐水将取出的脾脏清洗多次，并剔除多余无用的组织。
4.将筛网置于平皿中，脾脏置于筛网上，用弯头镊镊住，轻轻在筛网上进行碾磨，同时不停滴加不含血清的培养液冲洗。
5.将碾磨好的细胞悬液吸入至离心管中，离心(1000rpm,5min)，吸去上清（去除血液等）。
6.加入10ml培养液，吹打混匀，取样计数。
7.将稀释好的细胞悬液分装于培养瓶中，轻轻摇晃混匀，在培养瓶上。
面做好标志，注明细胞、组别及日期。
原代细胞培养和传代培养的方法及其注意事项
初代培养原理将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。
仪器、材料及试剂仪器：培养箱（调整至37℃），培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37℃）材料：动物组织块试剂：1640培养基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hank′s液，碘酒初代消化培养法1. 准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。
开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。
2. 布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。
3. 处理组织：把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟。
4. 剪切：用眼科剪把组织切成2~3毫米大小的块，以便于消化。
加入比组织块总量多30~50倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角烧瓶中，结扎瓶口或塞以胶塞。
5. 消化：或用恒温水浴，或置于37℃温箱消化均可，消化中每隔20分钟应摇动一次，如用电磁恒温搅拌器消化更好。
消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。
6. 分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。
低速（500~1000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清，加入适量含有血清的培养液。
7. 计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中。
对大多数细胞来说，pH要求在7.2~7.4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHCO3调整。
8. 培养：置于36.5℃温箱培养，如用CO2温箱培养，瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞，纱布塞易生霉菌，每次换液时需要换新塞。
初代组织块培养法1. 剪切：把组织小块置于小烧杯或青霉素小瓶中，用Hanks液漂洗二三次以去掉表面血污，吸静Hanks液，用眼科剪反复剪切1mm3块为止。
原代培养和传代培养的理解
一、原代培养和传代培养1、原代培养定义：将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、化学试剂或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。
注意：人体是复杂的，一般从器官取出的组织都是很多类型细胞混合组成的（规范的说是多克隆，定义见下一条），也就是有很多种类型的细胞，基本上是不可能提取出来一种类型的细胞（单克隆）的，那个概率太小了。
TIPS：克隆在细胞培养中的定义：是原代培养开始时，揪出来的那一坨组织中的细胞类型数，有一种类型就是单克隆，两种类型就是两个克隆，很多类型就是多克隆（比如你肌肉组织，里面不但有肌肉细胞还有神经细胞，于是就是双克隆）2、传代培养定义：细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再培养）。
传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。
同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。
贴壁细胞需经消化后才能分瓶。
记住：神经细胞等终末分化细胞是没有传代培养的，因为它们无法复制注意：十代之前为原代，十代之后为传代的说法是完全可以的，但这是一个经验规律（一般细胞培养十代长满培养基），不具有普适性，但做题的时候用的基本上都是这个，不要杠精，特殊说明除外。
TIPS:癌细胞是一种特殊的细胞，它不具有贴壁生长特性，还不具有接触抑制作用，所以临床上常说癌细胞具有扩散性细胞系：直译就是细胞的集合，实际意义是进行传代培养后（这是前提！！！），对原代培养所使用的那一坨组织的称呼。
二、分离：酶消化分离法酶消化分离法常采用胰蛋白酶和胶原酶1、胰蛋白酶分散原理：胰蛋白酶是一种胰脏制品，对蛋白质有水解作用，主要作用于赖氨酸或精氨酸相连接的肽键，使细胞间质中的蛋白质水介而使细胞分散开。
为什么不用胃蛋白酶？因为胃蛋白酶最适PH值2.0左右，而且胃蛋白酶很生猛，消化完不但细胞之间连接没了，细胞也没了。
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（3）消化及分散组织块：将上述清洗过的组织放入无 菌三角烧瓶内，加入5～6倍量的0.1％胰蛋白酶液 （pH7.4 ～ 7.6），置37℃恒温磁力搅拌器上分次 消化：每次消化8-10分钟。在超净台中吸出胰蛋白 酶液于带盖离心管中，加入2滴血清终止消化。直到 组织块基本消化完全。
（6）观察：逐日检查培养物是否污染，观察细胞生 长情况。待细胞已基本长成致密单层时，即可进行 传代培养。
原代细胞培养结果:
• 细胞接种后一般几小时内就能贴壁，
并开始生长
• 如接种的细胞密度适宜，5天到一周即
可形成单层
细胞原代贴块培养法 贴块培养步骤图解
VSMCs原代培养第4天和第9天（×100）
（5）观察：细胞培养24h后，即可进行观察。
传代细胞培养结果
• 一般情况，传代后的细胞在2小时左右
就能附着在培养瓶壁上，2～4天就可 在瓶内形成单层，需要再次进行传代
• 三、人体活检(或手术)材料
• (1) 在准备以临床材料为实验材料时,要预先与
临床外科医生和护士商量,并做好一切必要的准备 工作。争取拿到新鲜、无菌、少坏死的标本。
• (2)与临床联系好手术时间后，立即做好如下准备
工作：准备好1-2个贮有培养液和抗生素的标本收 集瓶，将盖盖紧，保持无菌，瓶外贴上标签，写 上工作人员名字、地点和电话号码；将收集瓶送 往医院，并与医生和护士讲清截取手术标本的部 位及注意事项。
• (3)标本放入收集瓶后，送出手术间，立即送往
组织培养实验室。工作人员最好是等在手术间外。 但有时手术时间难以掌握。则请护士将收集材料 的瓶子盖好后，放入4℃冰箱，尽快打电话通知 工作人员。
二、传代细胞培养
• 细胞“一代”指从细胞接种到分离再培养
的一段期间，与细胞世代或倍增不同。在 一代中，细胞倍增3～6次
• 离体培养的细胞群体增殖达到一定密度时，
细胞的生长和分裂速度就会减慢甚至停止， 如不及时分离传代培养，细胞将逐渐衰老 死亡。
• 传代培养是指细胞从一个培养瓶以1:2或
1:3比率转移，接种到另一培养瓶的培养。
• (4)取临床标本时，虽然尽可能做到无菌操作，
但仍有污染可能性的存在。可选用抗生素类控制 污染。如手术标本比较大（约200mg以上），可 将其浸于70%酒精中约30-60秒，这样会减少表面 污染而不损坏内部组织的结构和存活。不要用纱 布包裹标本，纱布纤维易粘附在组织上。
原
代 培
贴块法
养
方
法
分
类
消化法
93
分次消化
消化法的分类
解离释放细胞的方法
• 最常用的是机械解离细胞法、酶学解离细
胞法以及螯合剂解离细胞法。
• 用酶学解离细胞法解离细胞是体外培养动
物细胞时分散组织的基本方法，最常用的 消化酶是胰蛋白酶和胶原酶两种。
动物细胞原代培 养流程的示意图
器材和液体的准备
各管配平后离心，收集细胞，无血清培养液洗 2-3次后，将细胞悬液用两层灭菌纱布过滤至另一 烧杯中。
（4）计数与稀释：从过滤的细胞悬液中取出1ml滴于 血细胞计数板上，按白细胞法进行计数；计数后用 培养液稀释，稀释后的浓度一般以每毫升含30 ～ 50万个细胞为宜。
（5）分装与培养：将稀释好的细胞悬液分装于细胞 培养瓶中，盖好瓶盖，在培养瓶上做好标记，置于 37℃的CO2培养箱中培养。
• 贴壁培养细胞的传代通常是采用胰蛋白酶
消化，把细胞分散成单细代法或离心法
传代。
方法与步骤
（一）贴壁细胞传代培养 （1）选取生长良好的细胞，在超净工作台的酒精
灯旁，倒去瓶中的旧培养液，加入2～3ml的DHanks液，轻轻振荡漂洗细胞，以除去悬浮在 细胞表面的碎片(思考：还有什么作用？） （2）加入适量0.１％－ 0.25％胰蛋白酶消化液， 室温消化，倒置显微镜下观察，待细胞单层收 缩突起出现空隙时，倒去酶液。
（3）用Hanks液洗涤1次，加入适量培养液，反复吹 打细胞，使其成细胞悬液。
（4）以1：2或1：3进行分装，并在培养瓶上做好标 记，注明代号、日期，轻轻摇匀， 37 ℃CO2 培养箱培养。
（5）观察：细胞培养24h后，即可观察培养液的颜 色及细胞的生长情况。
VSMCs传代培养第1天和第3天（×100）
• 细胞培养用的玻璃器材
培养瓶、吸管等在清洗干净以后，装在铝 盒和铁筒中，干热或湿热灭菌后备用
• 手术器材、瓶塞等
15磅，121℃，20分钟蒸气灭菌
• DMEM培养液、消化液、PBS液等
用滤器过滤后备用
方法与步骤（举例:心肌细胞消化培养法）
（1）动物处死：将出生2～3d乳鼠，用拉颈椎方法 处死。腹部向上钉在蜡盘中，用碘酒和酒精棉球 擦拭腹部消毒。
胞分化及病毒学方面的试验效果很好。
• 原代培养也是建立各种细胞系（株）必须经
过的阶段。
原代培养
消化法 贴块法
冷消化 温消化
一次性消化 分次消化
消化法：这种培养过程主要是采用无菌操 作的方法，把组织（或器官）从动物体内取 出，经酶消化处理，使分散成单个细胞，然 后在人工条件下培养，使其不断地生长和繁 殖。
（二）悬液细胞的传代培养
（1）取生长良好的细胞，在超净工作台用无菌吸管 把培养瓶中的细胞吹打均匀。
（2）转移到无菌的离心管中，盖紧胶盖，平衡后离 心（1 000r/min）5min。
（3）在超净工作台中吸去上清液，加入适量新培养 液，用吸管吹打细胞，制成悬液。
（4）以1：2或1：3进行分装，并在培养瓶上做好标 记，注明代号、日期，轻轻摇匀，37 ℃ CO2培 养箱培养。
细胞的原代和传代培养课件
• 一、原代培养
概念：取自体内新鲜组织并置于体外条 件下生长的细胞在传代之前称为 原代培养。
原代培养技术的重要意义:
• 原代培养的最大优点是细胞刚刚离体，生物
性状尚未发生很大变化，具有二倍体的遗传 性，而且大多数细胞表现出原来组织的特性。
• 利用原代培养做各种实验，如药物测试、细