细胞的传代培养和细胞计数法
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• 细胞生长缓慢 ：培养液或血清改变 ，
基本促生长成分的消耗、缺乏或降解,如 谷氨酰胺、生长因子等 ，低水平的细菌 或霉菌污染，接种细胞数太少 ，有限培 养细胞衰老 ，支原体污染
精品课件
精品课件
开始传代。
• 首次传代培养应适当提高接种细胞浓度。 • 细胞混杂生长时, 可根据需要选择合适的
方法纯化细胞。
精品课件
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血球计数板法
• 制备细胞悬液：细胞密度＞104/ml, 细胞过
多时需适当稀释,单个细胞率>95%。
• 加样：混悬细胞，取少许细胞悬液，从计
数池一侧加入，不要溢出或出现气泡。
Days in culture
DT = t × lg2 ÷精品(l课g件Nt－lgNo)
培养细胞的纯化方法
• 机械刮除法：用细胞刮刮出不需要的细胞 • 差速粘附法：成纤维样细胞，上皮样细胞 • 选择性酶消化法：金属管套取需要的细胞 • 密度梯度离心法：细胞漂浮密度，
Ficoll, Percoll
• 克隆化培养法：琼脂法，有限稀释法 • 免疫磁珠分离法：细胞表面标志，免疫磁珠 • 速度沉降法：细胞大小，离心淘洗技术 • 电泳分离法：细胞表面电荷
• 5. 吹打：镜下看到细胞收缩变园, 加1～2ml含血清培
养液, 用吸管按顺序轻轻吹打，避免出现泡沫；
• 6. 计数：取样,计数,调整细胞浓度； • 7. 接种及培养：按104 细胞/ml接种,37℃、5%CO2 ，饱
和湿度条件下培养。
精品课件
注意事项
• 细胞生长至覆盖培养瓶底面积80%左右时,
Medium 0.9ml
106/ml
Cell susspension
105/m l
104/m l
103/m l
0.1ml
0.1ml
精品课件
0.1ml
细胞生长曲线测定－计数法
Cell number（X 104）
80
70
M3SP2
60
M3SP2-pBp
50 40
M3SP2-PTEN
30 20
10
0
0 12 3 45 67 8
精品课件
细胞培养过程中常见的问题
• 培养液pH值快速偏离 ：CO2浓度异常，
培养瓶盖过紧 ；细菌、酵母或霉菌污 染
• 培养液出现沉淀 ：细菌或霉菌污染 • 细胞不贴壁 ：胰酶过度消化细胞 ，
支原体污染 ，缺乏附着因子
精品课件
• 细胞死亡 ：孵箱中缺CO2 ， 孵箱温度
不稳定 ，细胞冻融损伤 ，渗透压改变， 培养液中毒性代谢产物堆积
• 计数：用血细胞计数板镜下分别计数活细胞（染
料拒染）和死细胞（呈淡蓝色）
• 计算细胞活力：
活细胞率（％）＝［活细胞数／（活细胞数＋
数）］×100
死细胞
精品Baidu Nhomakorabea件
精品课件
细胞密度调整
• 稀释公式：C1·V1＝C2·V2
稀释前细胞密度C1，溶液体积V1 稀释后细胞密度C2，溶液体积V2
精品课件
细胞计数
细胞传代培养及细胞计数
精品课件
人癌细胞系传代培养
• 1. 观察：培养细胞生长活跃，占瓶底80%-90%，无污染； • 2.弃废液：倒掉瓶中培养液，尽量沥干液体； • 3. 漂洗：加1ml 0.25%胰蛋白酶消化液漂洗1次,弃去消
化液；
• 4. 消化：再加1ml消化液漂洗1次,倒掉大部分消化液,
保留约0.3ml,室温放置3～5min；
• 计数：10倍物镜下计数四角大方格内的细
胞，压线者只计左边线和上边线。
• 计算：细胞数/ml=（四大格细胞总数／4）
×104×稀释倍数
精品课件
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细胞活力测定－台盼蓝染色法
• 制备单个细胞悬液：105～106／ml
• 染色：0.04%台盼蓝染色1 min (9滴细胞悬液＋1
滴0.4%台盼蓝)， 3min 内计数
基本促生长成分的消耗、缺乏或降解,如 谷氨酰胺、生长因子等 ，低水平的细菌 或霉菌污染，接种细胞数太少 ，有限培 养细胞衰老 ，支原体污染
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开始传代。
• 首次传代培养应适当提高接种细胞浓度。 • 细胞混杂生长时, 可根据需要选择合适的
方法纯化细胞。
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血球计数板法
• 制备细胞悬液：细胞密度＞104/ml, 细胞过
多时需适当稀释,单个细胞率>95%。
• 加样：混悬细胞，取少许细胞悬液，从计
数池一侧加入，不要溢出或出现气泡。
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DT = t × lg2 ÷精品(l课g件Nt－lgNo)
培养细胞的纯化方法
• 机械刮除法：用细胞刮刮出不需要的细胞 • 差速粘附法：成纤维样细胞，上皮样细胞 • 选择性酶消化法：金属管套取需要的细胞 • 密度梯度离心法：细胞漂浮密度，
Ficoll, Percoll
• 克隆化培养法：琼脂法，有限稀释法 • 免疫磁珠分离法：细胞表面标志，免疫磁珠 • 速度沉降法：细胞大小，离心淘洗技术 • 电泳分离法：细胞表面电荷
• 5. 吹打：镜下看到细胞收缩变园, 加1～2ml含血清培
养液, 用吸管按顺序轻轻吹打，避免出现泡沫；
• 6. 计数：取样,计数,调整细胞浓度； • 7. 接种及培养：按104 细胞/ml接种,37℃、5%CO2 ，饱
和湿度条件下培养。
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注意事项
• 细胞生长至覆盖培养瓶底面积80%左右时,
Medium 0.9ml
106/ml
Cell susspension
105/m l
104/m l
103/m l
0.1ml
0.1ml
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0.1ml
细胞生长曲线测定－计数法
Cell number（X 104）
80
70
M3SP2
60
M3SP2-pBp
50 40
M3SP2-PTEN
30 20
10
0
0 12 3 45 67 8
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细胞培养过程中常见的问题
• 培养液pH值快速偏离 ：CO2浓度异常，
培养瓶盖过紧 ；细菌、酵母或霉菌污 染
• 培养液出现沉淀 ：细菌或霉菌污染 • 细胞不贴壁 ：胰酶过度消化细胞 ，
支原体污染 ，缺乏附着因子
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• 细胞死亡 ：孵箱中缺CO2 ， 孵箱温度
不稳定 ，细胞冻融损伤 ，渗透压改变， 培养液中毒性代谢产物堆积
• 计数：用血细胞计数板镜下分别计数活细胞（染
料拒染）和死细胞（呈淡蓝色）
• 计算细胞活力：
活细胞率（％）＝［活细胞数／（活细胞数＋
数）］×100
死细胞
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细胞密度调整
• 稀释公式：C1·V1＝C2·V2
稀释前细胞密度C1，溶液体积V1 稀释后细胞密度C2，溶液体积V2
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细胞计数
细胞传代培养及细胞计数
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人癌细胞系传代培养
• 1. 观察：培养细胞生长活跃，占瓶底80%-90%，无污染； • 2.弃废液：倒掉瓶中培养液，尽量沥干液体； • 3. 漂洗：加1ml 0.25%胰蛋白酶消化液漂洗1次,弃去消
化液；
• 4. 消化：再加1ml消化液漂洗1次,倒掉大部分消化液,
保留约0.3ml,室温放置3～5min；
• 计数：10倍物镜下计数四角大方格内的细
胞，压线者只计左边线和上边线。
• 计算：细胞数/ml=（四大格细胞总数／4）
×104×稀释倍数
精品课件
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细胞活力测定－台盼蓝染色法
• 制备单个细胞悬液：105～106／ml
• 染色：0.04%台盼蓝染色1 min (9滴细胞悬液＋1
滴0.4%台盼蓝)， 3min 内计数