几种常用生物活性测试方法简介[优质ppt]
生物活性测定法的原理
生物活性测定法的原理
生物活性测定法是一种通过观察或测量生物体对化学物质或其他环境因素的反应来评估其活性的方法。
常用的生物活性测定法包括细胞增殖或生长抑制实验、细胞毒性实验、酶活性实验、抗菌活性实验等。
生物活性测定法的原理主要基于以下几个方面：
1. 细胞反应原理：生物活性测定法常通过观察或测量细胞对化学物质的反应来评估其活性。
例如，通过在培养基中加入待测物质，观察细胞的增殖情况或生物学特征的改变，从而评估其对细胞的生长抑制或促进作用。
2. 酶反应原理：酶在生物体内发挥着极为重要的生物催化作用。
生物活性测定法中常通过测量酶的活性来评估待测物质的生物活性。
例如，通过添加待测物质到含有酶底物的体系中，观察酶反应的速率或生成产物的量来评估待测物质对酶的影响。
3. 细菌抗菌原理：生物活性测定法中常通过测量待测物质对细菌的抑制作用来评估其抗菌活性。
例如，利用平板扩散法或微量稀释法，将待测物质与细菌共同培养，观察细菌的生长情况或测量细菌的最小抑菌浓度，从而评估其抗菌活性。
4. 动物体内反应原理：一些药物或化学物质的生物活性往往需要通过动物体内实验来评估。
常见的方法包括动物行为观察、组织活检、毒性评估等。
通过观察
动物对待测物质的生理、行为或组织结构的变化，来评估其生物活性。
综上所述，生物活性测定法的原理主要是通过观察或测量生物体对待测物质的反应来评估其活性。
具体的原理可以根据不同实验方法和待测物质的性质来确定。
具有细胞伤害性的生物活性测定法
具有细胞伤害性的生物活性测定法一、生物学检测法生物学检测又称生物活性检测，是根据细胞因子特定的生物活性而设计的检测法。
由于各种细胞因子具有不同的活性，例如IL-2促进淋巴细胞增殖，TNF杀伤肿瘤细胞，CSFci激造血细胞集落形成，IFN保护细胞免受病毒攻击，因此选择某一细胞因子独特的生物活性，即可对其进行检测。
生物活性检测法又可分为以下几类：1、细胞增殖法许多细胞因子具有细胞生zhang因子活性，特别是白细胞介素，如IL-2 ci激t细胞生zhang、IL-3 ci激肥大细胞生zhang、IL-6 ci 激浆细胞生zhang等。
利用这一特性，现已筛选出一些对特定细胞因子起反应的细胞，并建立了只依赖于某种因子的细胞系，即依赖细胞株(简称依赖株)。
这些依赖株在通常情况下不能存活，只有在加入特定因子后才能增殖。
例如IL-2依赖株ctll-2在不含IL-2的培养基中很快死亡，而加入IL-2后则可右体外zhang期培养。
在一定浓度范围内，细胞增殖与IL-2量呈正比，因此通过测定细胞增殖情况(如使用3h-tdr掺入法、MTT法等)鉴定IL-2的含量。
除依赖株外，还有一些短期培养的细胞，如胸腺细胞、骨髓细胞、促有丝分裂原ci 激后的淋巴母细胞等，均可作为靶细胞来测定某种细胞因子活性。
2、靶细胞杀伤法是根据某些细胞因子(如TNF)能在体外杀伤靶细胞而设计的检测方法。
通常靶细胞多选择体外zhang期传代的肿瘤细胞株，利用同位素释放法或染料染色等方法判定细胞的杀伤率。
3、细胞因子诱导的产物分析法某些细胞因子可ci激特定细胞产生生物活性物质，如IL-2、IL-3诱导骨髓细胞合成胺、IL-6诱导肝细胞合成α1-抗糜蛋白酶等。
通过测定所诱生的相应产物，可反映细胞因子的活性。
4、细胞病变抑制法病毒可造成靶细胞的损伤，干扰素等则可抑制病毒所导致的细胞病变，因此可利用细胞病变抑制法检测这类因子。
二、免疫学检测法细胞因子均为蛋白或多肽，具有较强的抗原性。
细胞活力检测方法
细胞活力检测方法细胞活力是指细胞内外环境稳定，细胞结构完整，代谢活跃，功能正常的状态。
细胞活力的高低直接影响着生物体的生长、发育、免疫功能等多个方面。
因此，准确、快速地检测细胞活力对于生物学研究和临床诊断具有重要意义。
下面将介绍几种常见的细胞活力检测方法。
一、MTT法。
MTT法是一种常用的细胞活力检测方法。
其原理是将MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基-2H-四唑溴化物）加入培养基中，MTT会被细胞内的还原酶还原为可溶性的紫色产物，然后用溶剂将产物溶解，最后用酶标仪测定其吸光值。
吸光值越高，代表细胞内还原酶活性越高，细胞活力越强。
二、CCK-8法。
CCK-8法是一种新型的细胞活力检测方法，其原理是将CCK-8（Cell Counting Kit-8）溶液加入培养基中，CCK-8会被细胞内的还原酶还原为橙黄色的产物。
然后用酶标仪测定其吸光值，吸光值越高，代表细胞内还原酶活性越高，细胞活力越强。
相比MTT法，CCK-8法更为灵敏和稳定。
三、荧光染料法。
荧光染料法是一种常用的细胞活力检测方法，其原理是利用荧光染料（如FDA、PI等）染色活细胞和死细胞，然后观察染色情况来判断细胞的活力。
活细胞呈绿色荧光，而死细胞呈红色荧光。
通过计数活细胞和死细胞的比例，可以间接反映细胞的活力情况。
四、细胞代谢物测定法。
细胞代谢物测定法是一种直接反映细胞活力的方法。
通过测定细胞产生的代谢产物（如乳酸、ATP等）的含量，可以客观地评价细胞的活力情况。
这种方法不仅可以用于细胞培养液的检测，也可以用于组织样本的检测。
综上所述，细胞活力的检测方法有多种多样，每种方法都有其独特的优势和适用范围。
在实际应用中，我们可以根据具体情况选择合适的方法来检测细胞活力，以便更好地开展生物学研究和临床诊断工作。
希望本文介绍的内容对您有所帮助。
几种常用生物活性测试方法简介
ITC的用途： 获得生物分子相互作用的完整热力学参数，包括结合常数(Ka)、结合位点数(n)、摩 尔结合焓(△H）、摩尔结合熵（ △S）、摩尔恒压热容（ △ Cp），和动力学参数
Eu永久性嵌合穴状口袋（非螯合作用） 耐受性好，对温度，光强，PH，离子 强度变化影响较小。不易受化学物质 干扰，如EDTA，二价离子（Mg2+， Mn2+）等。
Stokes shift >300nm
持续激活后没有光漂白现象,可以多次 读数，从而进行动力学实验。
镧系元素的半衰期大于1毫秒，与普 通荧光纳秒级的半衰期相差6个数量 级。当延迟50微秒读数时，普通荧光 的信号近似于零。检测的发射光中没 有来自于激发波长的干扰。
Journal of Molecular Recognition.2008, 21, 289.
Isothermal Titration Calorimetry (ITC)
ITC独特之处： ➢ 样品用量小，方法灵敏度和精确度高。最小可检测热效应0.125uJ，生物样品最
小用量0.4ug，滴定池体积1.43 ml ➢ 实验时间较短。典型的ITC实验只需30-60分钟，并加上几分钟的响应时间。 ➢ 操作简单。整个实验由计算机控制，使用者只需输入实验的参数，如温度、注
7 .室温静置反应1h后，测值340/665nm。[(620/670nmCayman]
[BRD4(BD1)TR-FRET Assay Kit 购买自 BPS Bioscience 公司]
enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)
生物活性材料PPT课件
缺点
在于惰性材料仅仅是以机械锁合的方式进行骨 的替换与修复，而不能与活体组织有效键合。
Ancleregg 等 对15 例中度或重度牙周炎患者的30 处下磨牙根分 叉病变进行治疗, 随机分为实验组、对照组。实验组行根向复位瓣术加 生物玻璃(45S5 倍骼生)植入, 对照组仅用根向复位瓣术, 并以探诊出血 情况及探诊牙周袋深度作为评价标准。结果显示实验组效果明显优于 对照组。故认为生物玻璃是治疗I I 型根分叉病变的有效材料。
熔融法 制备钙磷微晶玻璃的试验方法
溶胶-凝胶法
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多孔微晶玻璃的制备方法
一是利用玻璃分相原理，经热处理在玻璃中获得可溶晶相， 再用酸侵蚀掉可溶相，形成多孔材料。 二是先合成玻璃粉末然后加入诸如CaCO3 、PMMA、淀粉 等作发泡剂，烧结发泡成为多孔材料。
（2）钙磷微晶玻璃的组成 目前生物玻璃主要被用作骨的替代材料，根据天然骨的成分
19
D. Arcos, R. P.del Real, M. Vallet-Reg ì. A novel bioactive and magnetic biphasic material[J]. Biomaterials, 2002(23): 21512158.
20
3
生物活性陶瓷
生物活性陶瓷包括表面生物活性陶瓷和生物降解陶瓷。这 类材料的组成中含有能够通过人体正常的新陈代谢进行转换 的钙（Ca）、磷（P）等元素，或含有能与人体组织发生键 合的羟基（-OH）等基团。
生物活性测定法
生物活性测定法
重组人促红素体内生物学活性测定法 网织红细胞法) (网织红细胞法)
本法系依据人促红素(EPO)可刺激网织红 可刺激网织红 本法系依据人促红素 细胞生成的作用,给小鼠皮下注射EPO后, 细胞生成的作用,给小鼠皮下注射 后 其网织红细胞数量随 EPO注射剂量的增加 注射剂量的增加 而升高. 而升高.利用网织红细胞数对红细胞数的 比值变化,通过剂量-反应平行线法检测 比值变化,通过剂量 反应平行线法检测 EPO体内生物学活性. 体内生物学活性. 体内生物学活性
按标准品说明书, 标准品溶液的制备 按标准品说明书, 标准品复溶, 将EPO标准品复溶,用稀释液将 标准品复溶 用稀释液将EPO标准 标准 品稀释成高, 个剂量EPO标准溶 品稀释成高,中,低3个剂量 个剂量 标准溶 液. 供试品溶液的制备 用稀释液将供试 品稀释成高, 个剂量与EPO标准 品稀释成高,中,低3个剂量与 个剂量与 标准 溶液单位相近的供试品溶液. 溶液单位相近的供试品溶液.
然后弃去细胞培养板中的上清液, 然后弃去细胞培养板中的上清液,每孔 加染色液50ul 室温放置30分钟后, 50ul, 30分钟后 加染色液50ul,室温放置30分钟后,用 流水小心冲去染色液,并吸干残留水分, 流水小心冲去染色液,并吸干残留水分, 每孔加入脱色液100ul 室温放置3 100ul, 每孔加入脱色液100ul,室温放置3～5分 混匀后,用酶标仪以630nm 630nm为参比波 钟.混匀后,用酶标仪以630nm为参比波 在波长570nm处测定吸光度, 570nm处测定吸光度 长,在波长570nm处测定吸光度,记录测 定结果. 定结果. 试验数据采用计算机程序或四参数回归 计算法进行处理. 计算法进行处理.并按下式计算试验结 果:
生物活性测定法
按标准品说明书, 标准品溶液的制备 按标准品说明书, 标准品复溶, 将EPO标准品复溶,用稀释液将 标准品复溶 用稀释液将EPO标准 标准 品稀释成高, 个剂量EPO标准溶 品稀释成高,中,低3个剂量 个剂量 标准溶 液. 供试品溶液的制备 用稀释液将供试 品稀释成高, 个剂量与EPO标准 品稀释成高,中,低3个剂量与 个剂量与 标准 溶液单位相近的供试品溶液. 溶液单位相近的供试品溶液.
将配制完成的标准品溶液和供试品溶液 移入接种WISH细胞的培养板中,每孔加 移入接种WISH细胞的培养板中, WISH细胞的培养板中 100ul. 37℃, 入100ul.于37℃,5%二氧化碳条件下 培养18 24小时 18～ 小时. 培养18～24小时.弃去细胞培养板中的 上清液.将保存的水泡性口炎病毒(VSV (VSV, 上清液.将保存的水泡性口炎病毒(VSV, 70℃保存 用攻毒培养液稀释至100 保存) -70℃保存)用攻毒培养液稀释至100 每孔100ul 100ul. 37℃, CCID50,每孔100ul.于37℃,5%二氧 化碳培养24小时(镜检标准品溶液的50 24小时 化碳培养24小时(镜检标准品溶液的50 病变点在lIU/m1) lIU/m1). %病变点在lIU/m1).
重组人白介素重组人白介素-2生物学活性测定法 (CTLL- 细胞/MTT比色法) /MTT比色法 (CTLL-2细胞/MTT比色法)
本法系根据在不同白介素-2 (IL-2)的 本法系根据在不同白介素- (IL-2)的 浓度下,其细胞依赖株CTLL CTLL浓度下,其细胞依赖株CTLL-2细胞存活 率不同,以此检测IL 的生物学活性. IL率不同,以此检测IL-2的生物学活性.
试剂 RPMI1640培养液 1640培养 (1) RPMI1640培养液 取RPMI 1640培养 基粉末1 规格为1L) 1L), 基粉末1袋(规格为1L),加水溶解并稀释至 1000ml,加青霉素10 IU和链霉素 和链霉素10 IU, 1000ml,加青霉素105IU和链霉素105 IU, 再加碳酸氢钠2.1g,溶解后,混匀,除菌 再加碳酸氢钠2.1g,溶解后,混匀, 2.1g 过滤,4℃保存 保存. 过滤,4℃保存. 取新生牛血清(FBS) (2) 基础培养液 取新生牛血清(FBS) 10ml, 1640培养液90ml.4℃保存 培养液90ml 保存. 10ml,加 RPMl 1640培养液90ml.4℃保存. (3)完全培养液 取基础培养液100ml 100ml, (3)完全培养液 取基础培养液100ml, 加重组人自介素- 至终浓度400 800IU. 400～ 加重组人自介素-2至终浓度400～800IU. 4℃保存 保存. 4℃保存.
生物学活性检测ppt课件
2018/11/17
例：抗肿瘤药物细胞学活性检测
• 肿瘤细胞（对数期） 胰蛋白酶处理 细胞悬液 稀释 96孔板培养24h 实验组、对照组设置 培养4~5d 弃去上清液 加MTT， 37℃继续培养4 h 小心弃上清，加 DMSO 37℃继续培养4 h 测定光密度值
肿瘤细胞生长抑制率％＝(1- OD实验/OD对照) ×100％
生物学活性检测
2018/11/17
2018/11/17
2018/11/17
1.生物学活性检测必要性
• 药品有效性必须是疗效确切，且含有特定 的有效活性成分和一定浓度含量 • 凡是不能用理化方法测定其含量或有效成 分或虽有理化方法测定但不能真实反映临 床实际应用价值的药物效价测定，可用生 物测定法进行测定 • 生物学活性测定是生物测定的重要内容
2018/11/17
2.生物技术药物的生物学活性检测方法
• 体内：动物模型分析 • 体外：细胞（组织、器官）培养分析 • 酶促反应法、免疫学法（体外）
2018/11/17
• 蛋白药物的细胞学活性检测原理：相同条 件下通过实验组与对照组对特定细胞生理 或生存状况的影响程度来判断药物的活性 • 例：抗肿瘤药物活性检测
3.药物生物学活性检测的意义
•
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• 思考题:
1.重组蛋白药物的生物学活性检测方法主要有哪些？ 2.抗肿瘤药物细胞学活性检测一般步骤？
thank you！
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在酶标仪上以实验波长为570 nm，参比波长为450 nm
2018/11/17
细胞培养分析
• 优点：时间较短（1~3d）成本低、重复性好 • 缺点：不精确
• 如：MTT显色反应
生物活性测定法
EA K3
X
A+ E
有R'
RO
E + PX
有机磷类
K d PX .E K2
PX K3
P+ E
X
PX代表有机磷杀虫剂，X代表侧链部分例如对氧磷中的-O- NO2。E代表 AChE，Kd是解离常数(或者称亲和力常数)，K2是磷酰化反应速率常数有时写作 Kp，K3是脱磷酰基水解速率常数或者称酶致活常数。反应开始时有机磷酸酯先与 酶形成复合体(PX·E)，X分离后形成磷酰化酶(PE)，再经过脱磷酰基使AChE恢复。
淡水发光菌青海弧菌的发现解决了这一问题。
2 用家蝇检测蔬菜中的残留农药
60年代后期，台湾农业试验所采用生物测定方法进行农药残留 检验，其原理是释放高敏感性的家蝇于菜汁中，4～5ｈ后家蝇死亡 率在10%以下即为合格，该方法优点是过程简单无须复杂仪器检测， 缺点是检测时间较长，仅适用于田间未采收的蔬菜，另外该方法只 对部分杀虫剂有反应，无法分辨残留农药的种类，准确性较低。
明亮发光杆菌(Photobacterium phosphoreum)
最小检出浓度为3ｍｇ·Ｌ-1 已用于检测甲胺磷、敌敌畏等常用有机磷农 药。 特点：快速、简便、灵敏、价廉，适合于现 场分析 缺点：农药浓度与发光强度的线性关系不够 准确，只能用于半定量测定。
长期以来使用的发光细菌是海洋发光细菌，但该方法有严重不 足，即必须在检测的样品中加入3%的ＮａＣｌ的细菌才能正常发 光。
AchE及其功能 Ach是一种神经传递介质 , AchE是一个水解酶，底物
是Ach。水解作用的反应式如下：
CH3COOCH2CH2N+(CH3)3 + H2O CH3COOH+HOCH2CH2N+(CH3)3
蛋白的生物活性测定方法(结晶紫法和MTT法)
蛋白的生物活性测定方法（结晶紫法和MTT法）结晶紫法活性测定1、取对数生长期的人胰腺癌SW1990细胞，用0.25%胰酶（以无钙镁离子PBS溶液配制，pH7.4）消化后，加入RPMI-1640培养基（10%新生牛血清，100U/ml青霉素，100U/ml链霉素，pH7.2）吹打细胞，使形成细胞悬液。
进行细胞计数，使细胞数为2~2.5×105个/ml。
接种于96孔细胞培养板，100µl/孔。
接种细胞时须不断摇动细胞悬液，以保证各孔细胞数的均匀一致。
96孔板放置于37℃、5%CO2培养箱中培养22h，观察到孔中细胞长满70~80%。
2、在上述RPMI-1640完全培养基中加入放线菌素D，使终浓度为1.5µg/ ml，配成样品稀释液。
取此稀释液900µl至Eppendorf管中，另在9个5m l管中加入700µl稀释液。
3、用完全培养基将基因工程人肿瘤凋亡素样品（上海恰尔生物技术有限公司研制，批号：0304，冻干粉剂，蛋白浓度：2mg/支）复溶至100 0µl（液体样品测定蛋白浓度后，直接进行下一步操作），取出100µl 至已装有900µl稀释液的Eppendorf管中，充分混匀，尽量不起泡沫。
再从此管中吸出100µl至下一管中，如此反复 n次（即测定前10倍稀释若干次，直到与估计活性相接近时）。
4、从最后稀释的Eppendorf管中吸出700µl样品至已装有700µl稀释液的5ml管中，充分混匀。
再从此管中吸出700µl至下一管同样装有700µl 稀释液的5ml管中，如此反复9次（即测定时倍比稀释样品）。
5、弃去96孔板中旧的培养基，从第一个5ml管中吸取已稀释的样品100µl至第2排细胞孔中，每个稀释度作6复孔(n=6)；从第二个5ml管中吸取的样品加入第3排细胞中，依此类推，直至第10排孔结束。
第13章、生物活性测定技术
3 荧光法（fluorescence）
氧化态的黄素（ flavin ）化合物发出强
烈 的 荧 光 ， 还 原 态 失 去 荧 光 。 NAD+ 和
NADP+ 无 荧 光 ， 而 NADH 和 NADPH 有 460nm蓝色荧光。荧光法灵敏度高。
4 同位素测定法（isotope determination）
6 化学分析法（chemical analysis）
酶促反应一段时间后，取出一部分反应液，
用化学方法分析底物或产物的量。如 ACC合成酶
的 产 物 ACC 的 测 定 ： 加 HgCl2 终 止 反 应 ， 加
NaOCl-NaOH 混合液使 ACC转化成乙烯，再用气 相色谱测乙烯。
1-氨基环丙烷-1-羧酸 （ACC）
No inhibitor
Vmax
（变小）
With noncompetitive inhibitor
Km (不变) Fig. Noncompetitive inhibitio13.
[S]
1
) ) = (1+ (1+ + v Vmax [ ki ] [S] Vmax [ ki ]
1/ v With
1 [I] (1+ ) Vmax [ Ki ] noncompetitive inhibitor
比活性
酶的纯度往往用比活性来表示，比活性是
用同一酶制剂的酶活性除以蛋白质的质量，即 单位质量蛋白质所具有的酶活性，常用的单位 为u/mg protein。酶制剂的比活性越高说明酶 的纯度越高。
二、酶活性测定的主要方法
温度、 pH 、离子强度（ I=(1/2)Σ CZ2 ）等因 素对酶活性有很大的影响，测定酶活性时一般采 用最适环境条件。若酶催化反应时需要辅助因子， 应加入最适量的辅助因子。底物浓度应采用零级 反应时的底物浓度，这时反应速度只与酶浓度有 关，而与底物浓度无关。随着反应的进行，产物 浓度越来越高，而底物浓度越来越低，导致反应 速度下降，所以测酶活性时应测反应的初速度， 即反应开始后较短一段时间内的反应速度（反应 了的底物不超过5%）。
生物活性检测
Part 2 生物活性检测
02
生物传感器定义为 : 生物传感器是一种精密的分析器件 , 它结合一种生物或 生物衍生敏感元件与一只理化换能器 , 能够产生间断或连续的数字电信号 , 信号强度与被分析物成正比。生物传感器一般由两部分组成 : 一是分子识别 元件 , 即具有分子识别能力的生物活性物质 ( 如组织、微生物细胞、细胞器、 细胞受体、酶、抗体、核酸等 ) ；二是信号转换元件 , 主要为电化学电极、 光学检测元件、气敏电极、热敏电阻、场效应晶体管、压电晶体及表面等 离子共振器件等。当待测物与分子识别元件特异性结合后 , 所产生的复合物 ( 或光、热等 ) 通过信号转换器转变为可以输出的电信号、光信号等 , 从而 达到分析检测的目的。
Part 2 生物活性检测
03 在合时膜片上用戊二醛交联冻干酵母粉 破碎液和酶混合液制备了用于检测蔗糖 含量的酶传感器，采用生物传感器检测 方式测定梨和海棠两种作物不同时期不 同部位的蔗糖含量，结果显示，作物的 蔗糖含量与总光合源呈正相关，光照天 数越多，时间越长其含量就要越高，此 外果实积累贮存蔗糖还与茎的运输能力， 果实的卸糖能力密不可分。
Part 2 生物活性检测
03 利用生物传感器检测植物组织中的蔗糖含量的变化 在高等植物中,蔗糖具有至关重要的作用。蔗糖是 光合作用的主要产物,蔗糖形成于细胞质内，从叶 片通过韧皮部向库器官输送,是糖运输的主要形式, 植物中同化产物主要是以蔗糖的形式从源向库输送 的,供应植物的生长，参与调控植物花的诱导维管 组织的分化种子发育以及贮藏物质的积累等生长发 育过程。因此在分子水平上研究植物碳水同化产物 在源器官的分配对于提高作物植株的产量很有帮助。 酶电极是迄今最为快速准确的测糖方法之一。
Part 3 生物活性检测的扩展
生物技术药物的生物学活性测定
生物技术药物的生物学活性测定生物技术药物1、生物技术：基因工程、细胞工程、发酵工程、酶工程2、生物技术药物：细胞因子、抗体、疫苗、寡核苷酸药物、基因治疗药物等3、临床应用：预防、治疗、诊断肿瘤、心血管疾病、遗传病、神经系统疾病、传染病、哮喘、伤口愈合等生物技术药物的特点1生物技术药物与化学药物性质不同——化学本质为蛋白质、多肽、核酸等蛋白质四级结构示意图生物技术药物的特点2活性由产品的高级结构决定——质量数不能反映产品的药效学和生物学活性3影响活性因素：表达体系——大肠杆菌、酵母、哺乳动物，是否糖基化纯化方案——尤其是包含体变性、复性过程冻干工艺——生物技术药物质量标准的要求1保证药物的安全性、有效性和质量可控；2活性（效力）的测定是保障产品有效性的最重要指标之一，是考察产品全面特征的重要步骤：重组细胞因子—生物学活性(效价)测定3在原液和成品检定中，生物学活性测定都是重要指标；生物学活性测定——体内和体外均可以进行；——获得的结果在一定程度上依赖于采用的方法；——几乎所有的生物活性测定都是比较分析实验，需要标准品或参考品；——不一定直接反映产品的临床适应症，但要能够准确测定产品效价、评价产品稳定性与批间一致性生物学活性测定的几种主要方法1体内测定法----整体测定，利用动物体内某些指标的变化；2离体动物器官测定法----3生化酶促反应测定法----不依赖于活的生物系统，主要基于产品与某种物质的结合或产品本身的化学反应生物学活性测定的几种主要方法4免疫学活性测定法——利用蛋白对异种动物有相应的免疫原性，制备抗体，然后通过E L I S A测定含量。
5体外细胞培养测定法——促进细胞生长、抑制细胞生长、间接保护细胞作用体外细胞培养测定法1、促进细胞增殖——a)促进某种细胞的生长，但不依赖：3T3细胞/E G F、b F G Fb)是某种细胞生长的依赖因子：T F-1/G M-C S F、N F S-60/G-C S F、C T L L-2/I L-22、抑制细胞增殖——L929/T N F3、间接保护细胞作用——I F N/W I S H-V S V测定方法的选择1传代细胞（因子依赖细胞>非因子依赖细胞）>原代细胞>离体器官>体内测定法2定量方法>半定量方法>定性方法生物学活性和比活性●生物学活性——每m l或每支待测样品中含有的生物学活性单位，U或I U或A U/m l(支)●比活性——主要针对原液或原料药每单位质量(m g)蛋白质中含有的特定生物学活性单位，U/m g或I U/m g或A U/m g●比活性(U o r I U/m g)=生物学活性(U o r I U/m l)/蛋白质浓度(m g/m l)生物学活性测定标准范围的确定不同测定方法的规定标准不同：1、80-150%——如I F N、G M-C S F、G-C S F等细胞因子依赖、抑制细胞生长或直接杀死细胞2、70-200%——如E G F、b F G F等剂量-反应曲线不特别陡峭标准品（参考品）的作用1、所用试剂或培养基的配制、纯度、灵敏度不同；2、细胞系代次或来源不同；3、试验动物的品系和健康状况；4、不同实验室、不同试验人员、不同试验时间统一尺度、最大限度地消除误差，从而获得一致的结果；生物学活性测定需要的条件（以细胞为基础的活性测定）1、细胞培养所需要的全部条件2、活性测定用标准品或参考品3、酶标仪及软件分析系统细胞培养的基本概念1、细胞系和细胞株2、传代细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器皿中。
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surface plasmon resonance , SPR
SPR的优点：
可以实时、连续监测反应的动态过程， 灵敏度较高 。
可实时记录反应的结合与解离过程。 每次检测结束后，结合在金属膜芯片
上的反应物可以用洗脱液洗脱使芯片 再生，可重复使用，节约耗材。 可以得到高通量数据。
(如酶以应用于蛋白质-蛋白质相互作用、蛋白质折叠/去折叠、蛋白质-小分子相互作用、 酶-抑制剂相互作用、酶促反应动力学、药物-DNA/RNA相互作用、RNA折叠、蛋 白质-核酸相互作用、核酸-小分子相互作用、核酸-核酸相互作用、生物分子-细胞 相互作用等方面。
Journal of Molecular Recognition.2008, 21, 289.
Isothermal Titration Calorimetry (ITC)
ITC独特之处： 样品用量小，方法灵敏度和精确度高。最小可检测热效应0.125uJ，生物样品最
小用量0.4ug，滴定池体积1.43 ml 实验时间较短。典型的ITC实验只需30-60分钟，并加上几分钟的响应时间。 操作简单。整个实验由计算机控制，使用者只需输入实验的参数，如温度、注
SPR的缺点：
待测物在金属薄膜表面的固定：由于生物大分子本身理化性质的复杂性，空间 结构的特殊性，偶联结果可能导致偶联物特异作用位点的失活。
分析物在金属薄膜表面的结合：难以区分非特异性结合，若分析物在芯片表面 是非特异性结合， 会给整个实验带来干扰，造成错误的结论。
待测物的分子大小：适用于生物大分子，小分子的质量变化对折射率变化不明 显， 因此会给小分子待测物的检测造成困难。
ITC是一种热量连续变化的量热器。主 要由隔热夹套包裹着的样品池(反应池) 和参比池、注射器和一台计算机组成， 注射器同时具有搅拌作用，计算机控 制温度控制装置和信息反馈系统。
受体-配体复合物的形成伴随着能量的释放或吸收，导致样品池温度的变化，参比池 始终保持在实验温度，反馈系统提供热或降低热量来补偿样品池的温度变化，每注 射一次后系统恢复至平衡状态再进行下一滴滴定。结果以峰的形式表示平衡温度偏 移所需要的能量，峰的面积相当于反应释放或吸收的热量。
而折射率的变化又与金属表面结合的 分子质量成正比。 可通过 SPR 角的变化捕获生物反应过 程中生物分子之间相互作用的特异信 号，对待测物质进行测定直接测量反 应平衡常数 Ka，解离平衡常数 Kd 等。
surface plasmon resonance , SPR
将待测分子键合在生物传感芯片表面，使其形成分子敏感膜， 再将分析物分子溶液 注入，使其以恒定流速流过芯片表面，如果两者通过相互作用而结合，则将引起生 物传感器表面质量的增加， 导致传感器表面折射率的变化，从而引起SPR角的改变。 SPR被广泛应用于分析生物分子如蛋白质-蛋白质、药物-蛋白质、蛋白质-核酸、核 酸-核酸之间的相互作用，所涉及的研究领域包括免疫学、蛋白质组学及药物筛选等。
射次数、注射量等，计算机就可以完成整个实验，再由软件分析ITC得到的数据。 量热实验完毕的样品未遭破坏，还可以进行后续生化分析。
ITC的用途： 获得生物分子相互作用的完整热力学参数，包括结合常数(Ka)、结合位点数(n)、摩 尔结合焓(△H）、摩尔结合熵（ △S）、摩尔恒压热容（ △ Cp），和动力学参数
Methods In Cell Biology, 2008, 84,79.
Isothermal Titration Calorimetry (ITC) ITC数据图
左图： 横坐标：时间 纵坐标：热功率 峰底与峰尖之间的峰面积为每次注射时释放或吸收的总热量。 右图： 横坐标：滴定物与样品溶液的摩尔比 纵坐标：滴定产生的总热量 反应过程的结合等温曲线
surface plasmon resonance , SPR 表面等离子共振（SPR）原理
消逝波：当入射光到达界面时并不是直 接产生反射光，而是先透过光疏介质约 一个波长的深度，再沿界面流动约半个 波长再返回光密介质，透过光疏介质的 波被称为消逝波。
等离子波：当金属受电磁干扰时，金属内部 的电子密度分布会变得不均匀。因为库仑力 的存在，电子不会在引力与斥力的平衡位置 停下而向前运动一段距离，之后电子间存在 的斥力会迫使已经聚集起来的电子再次离开 该区域。由此会形成一种整个电子系统的集 体震荡，而库仑力的存在使得这种集体震荡 反复进行震荡，并以波的形式表现。
surface plasmon resonance , SPR
表面等离子共振原理
光在棱镜与金属膜表面上发生全反射 现象时，会形成消逝波进入到光疏介 质中与介质中存在一定的等离子波相 遇时可能会发生共振。当消逝波与表 面等离子波发生共振时，检测到的反 射光强会大幅度地减弱。
SPR角：反射光完全消失的角。 SPR角随金属表面折射率变化而变化，
几种常用生物活性 测试方法简介
CONTENTS
1
分子水平活性测试方法
2
细胞水平活性测试方法
3
总结
Isothermal Titration Calorimetry (ITC)
等温滴定量热法(Isothermal Titration Calorimetry, ITC)是近年来发展起来的一种 研究生物热力学与生物动力学的重要方法，它通过高灵敏度、高自动化的微量 量热仪连续、准确地监测和记录一个变化过程的量热曲线，原位、在线和无损 伤地同时提供热力学和动力学信息。
基本原理：
Q = △Ho x V x [H.G]
= △Ho x V x
Ka [G] 1+Ka [G]
x [H]o
△Go = -RT ln K a
△Go = △Ho - T△So
注：H 为受体（主体），G为配体（客体），Ka为结合常数 △Go为Gibbs自由能变化，△Ho 为焓变，△So 为熵变
Isothermal Titration Calorimetry (ITC) ITC仪结构示意图