DNA提取注意事项1
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一、实验原理
2、核酸制备的一般原则
分离纯化核酸总的原则: ①应保证核酸一级结构的完整性; ②排除其它分子的污染。 核酸纯化应达到的要求: ①核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高 浓度的金属离子; ②其它生物大分子的污染应降低到最低程度; ③排除其它核酸分子的污染。
一、实验原理
3、核酸制备的一般原则
二、材料、设备及试剂
菌种 :DBT降解菌 设备 :eppendorf管、微量取液器(20μl,200μl,1000μl), 台式 高速离心机, 涡旋振荡器 试剂:LB液体培养基 、裂解液(40mMTris-醋酸,20mM醋酸 钠,1mMEDTA,1%SDS,pH8.0)、5M NaCl 、Tris-饱和酚、氯仿、 RNA酶A 、无水乙醇
六、问题与讨论
1.简要叙述酚氯仿抽提DNA体系后出现的 现象及其成因。
2.
沉淀DNA时为什么要用无水乙醇?
基因工程教学网站: http://210.32.200.206/gene
• •
TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+离子,抑制DNase
pH值为8.0,可防止DNA发生酸解
五、DNA提取常见问题 问题一:DNA样品不纯,抑制后续酶解和PCR反应。
原 因
1.
DNA中含有蛋白、 多糖、多酚类杂质 DNA在溶解前,有 酒精残留,酒精抑 制后续酶解反应 DNA中残留有金属 离子
2.
对 策
3.
4. 5.
6.
尽量取新鲜材料,低温保存材料避 免反复冻融 液氮研磨或匀浆组织后,应在解冻 前加入裂解缓冲液 在提取内源核酸酶含量丰富的材料 的DNA时,可增加裂解液中螯合剂 的含量 细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔 所有试剂用无菌水配制,耗材经高 温灭菌 将DNA分装保存于缓冲液中,避免 反复冻融
核酸制备时应注意的事项: ①尽量简化操作步骤,缩短提取过程。 ②减少化学因素对核酸的降解。 ③减少物理因素对核酸的降解:机械剪切力和高温 ④防止核酸的生物降解。
核酸制备的步骤:
I.材料准备
破碎细胞 II.破碎细胞或包膜-内容物释放
提取
III.核酸分离、纯化
纯化
IV.沉淀或吸附核酸,并去除杂质
V.核酸溶解在适量缓冲液或水中
一、实验原理
4、核酸制备的一般方法和原理
核酸酶的抑制和抑制剂 降低温度,改变pH及盐的浓度,都利于对核酸酶 活性的抑制,但均不如利用核酸酶抑制剂更有利,当 然,几个条件并用更好。 对于DNA,抑制DNase活力很容易,但防止机械 张力拉断则更重要。 对于RNA,因分子较小,不易被机械张力拉断, 但抑制RNase活力较难,故在RNA提取中设法抑制 RNase更重要。
核酸提取的一般过程 1)破碎细胞(防止核酸酶的作用) 微生物:溶菌酶、SDS裂解。 高等植物:捣碎器破碎、液氮研磨。 酶法:蛋白酶,如胰蛋白酶, 冰冻法:反复冻融或液氮冻后组织捣碎。 动物:液氮处理后用匀浆器破碎。 细胞器DNA:首先纯化细胞器。
以上处理时均要同时加入核酸酶抑制剂
核酸提取的一般过程 2)破碎抽提核酸除去杂质 1.首先使脱氧核糖核蛋白、核糖体、病毒的核蛋白与 其它成分分离 2.使核酸与蛋白质分离 3.除去脂类 4.多糖的除去
核酸制备中常用的蛋白质变性剂
蛋白质变性剂的作用: 1.使蛋白质变性、沉淀,从核酸提取液中分离除去,以防造 成蛋白污染。 2.使蛋白质变性,故可使核糖体解聚释放出核酸。 3.某些蛋白质变性剂也有抑制RNase活性和破裂细胞的作用。
如:苯酚、氯仿、盐酸胍、DEPC
核酸制备中常用的酶 DNase RNase 蛋白酶K 溶菌酶
核酸提取的一般过程 3)核酸的纯化 根据所需核酸的性质和特点除去其它核酸污 染,并除去提取过程中的系列试剂(盐、有机溶剂 等)杂质,最后得到均一的核酸样品。
4)核酸样品的保存 核酸保存的主要条件是温度和介质 温度: 4℃(5℃)最佳和最简单 -70℃是长期保存的良好温度,为一次性保存 -20℃保存 保存介质: TE缓冲溶液(最常用) 10mmol/L Tris-Cl pH8.0 1mmol/L EDTA pH8.0
三、操作步骤
1、1.5ml菌液(每组两管)4 ℃ 12000rpm离心30sec, 弃去上清,倒置试管于吸水纸上吸干。 2、每管加入400µ l裂解液,用移液枪枪头反复抽吸辅 助裂解,37 ℃水浴30min。 3、每管加入132µ l的5M NaCl溶液,颠倒试管,充分混 匀后,13000rpm离心15min。用粗口的枪头(用剪刀剪 去1ml枪头的尖端)小心取出上清液转倒两支新的 eppendorf管中。 4、加入等体积的饱和苯酚/氯仿,充分混匀后, 12000rpm离心3min,离心后的水层如混浊则说明仍含 有蛋白质,则需将上清液转入新的试管,重复上述步骤 直到水层透明,水层和酚层之间不再白色沉淀物为止 (约2次)。
四、注意事项——材料准备
最好使用新鲜材料,低温保 存的样品材料不要反复冻融
提取血液基因组DNA时,要 选择有核细胞(白细胞) 组培细胞培养时间不能过长, 否则会造成DNA降解
含病毒的液体材料DNA含量 较少,提取前先富集
四、注意事项——细胞裂解
材料应适量,过多会影响裂解,导致DNA量 少,纯度低 针对不同材料,选择适当的裂解预处理方式: • 植物材料--液氮研磨 • 动物组织--匀浆或液氮研磨 • 组培细胞--蛋白酶K • 细菌--溶菌酶破壁 • 酵母--破壁酶或玻璃珠 高温温浴时,定时轻柔振荡
四、注意事项——核酸分离、纯化
采用吸附材料吸附的方式分离DNA时,应提 供相应的缓冲体系 采用有机(酚/氯仿)抽提时应充分混匀,但 动作要轻柔 离心分离两相时,应保证一定的转速和时间 针对不同材料的特点,在提取过程中辅以相 应的去杂质的方法
四、注意事项——核酸沉淀、溶解
当沉淀时间有限时,用预冷的乙醇或异丙醇沉淀, 沉淀会更充分 沉淀时加入1/10体积的NaAc(pH5.2,3M),有利 于充分沉淀 沉淀后应用70%的乙醇洗涤,以除去盐离子等 晾干DNA,让乙醇充分挥发(不要过分干燥) 若长期储存建议使用TE缓冲液溶解
核酸制备中常用的去垢剂 核酸本身带负电荷,结合带正电荷的蛋白质。用 于核酸提取的去垢剂,一般都是阴离子去垢剂, 去垢剂的作用: 1.溶解膜蛋白及脂肪,使细胞膜破裂; 2.溶解核糖体上面的蛋白质,使其解聚,将核酸 释放出来; 3.对RNase、DNase有一定的抑制作用。
如:SDS、脱氧胆酸钠、4-氨基水杨酸钠、萘-1.5-二磺酸钠、 三异丙基萘磺酸钠
5、将上层清液转入新的eppendorf管,加等体积的氯仿,混匀 后13000rpm离心3miபைடு நூலகம்,除去苯酚。
6、小心吸出上清液转入新的eppendorf管,用预冷的两倍体积 的无水乙醇沉淀,放置-20℃冰箱30min,然后13000rpm离心 15min,可见白色丝状沉淀物。 7、小心吸出液体,弃上清液,用预冷的400µ l 70%乙醇洗涤2 次,室温干燥后,用50µ lTE (含20µ g/ml的Rnase)溶解DNA, -20℃冰箱放置备用。
实验一 细菌基因组DNA的提取 一、实验原理
1、核酸的分类
DNA 主要存在于细胞核的染色体中。核外也有少量DNA, 如线粒体DNA(mtDNA),叶绿体DNA (cpDNA),质粒DNA。 RNA 存在于细胞质中,如mRNA, rRNA, tRNA等。 除上述DNA,RNA外,还有非细胞形式存在的病毒和 噬菌体,其或只含DNA,或只含有RNA。
核酸酶的抑制和抑制剂 DNase抑制
①加入少量金属离子螯合剂,如0.01 mol/L EDTA 或柠檬酸钠,DNase基本可以全部失活。 ②去垢剂、蛋白变性剂及DNase抑制剂也可使 DNase失活。
核酸酶的抑制和抑制剂 RNase抑制 ①操作要带手套。 ②所有器皿要严格消毒, ③试剂处理 ④低温操作 ⑤在分离过程中要加入一定的RNase抑制剂。
1.
重新纯化DNA,去 除蛋白、多糖、多酚 等杂质
2.
对 策
2.
重新沉淀DNA,让 酒精充分挥发
增加70%乙醇洗涤 的次数(2-3次)
3.
3.
五、DNA提取常见问题
问题二:DNA降解
原 因
1. 2.
1.
3.
4. 5.
材料不新鲜或反复冻 融 未很好抑制内源核酸 酶的活性 提取过程操作过于剧 烈,DNA被机械打断 外源核酸酶污染 反复冻融
五、DNA提取常见问题 问题三:DNA提取量少
1.
原 因
1. 2. 3. 4.
2.
实验材料不佳或量少 破壁或裂解不充分 沉淀不完全
3.
对 策
4. 5. 6.
洗涤时DNA丢失
尽量选用新鲜(幼嫩)的材 料 动植物要匀浆研磨充分;G+ 菌、酵母裂解前先用生物酶 或机械方式破壁 高温裂解时,时间适当延长 (对于动物细胞、细菌可增 加PK的用量) 低温沉淀,延长沉淀时间 加辅助物,促进沉淀 洗涤时,最好用枪头将洗涤 液吸出,勿倾倒