DNA提取注意事项1
实验一-DNA提取
实验一-DNA提取实验一DNA的小量制备小量法提取植物基因组DNA（CTAB法）1 实验目的：随着基因工程等分子生物学技术的迅速发展及广泛应用，人们经常需要提取高分子量的植物DNA，用于构建基因文库、基因组southern 分析、酶切及克隆等，这是研究基因结构和功能的重要步骤。
本实验目的是学习从植物材料中提取和测定DNA 的原理并掌握CTAB 提取DNA 的方法，进一步了解DNA 的性质。
2 实验原理细胞中的DNA 绝大多数以DNA-蛋白复合物（DNP）的形式存在于细胞核内。
提取DNA 时，一般先破碎细胞释放出DNP，再用含少量异戊醇的氯仿除去蛋白质，最后用乙醇把DNA 从抽提液中沉淀出来。
DNP 与核糖核蛋白（RNP）在不同浓度的电解质溶液中溶解度差别很大，利用这一特性可将二者分离。
以NaCl 溶液为例：RNP 在0.14mol/L NaCl中溶解度很大，而DNP 在其中的溶解度仅为纯水中的1％。
当NaCl 浓度逐渐增大时，RNP的溶解度变化不大，而DNP 的溶解则随之不断增加。
当NaCl 浓度大于1mol/L 时，DNP的溶解度最大，为纯水中溶解度的2 倍，因此通常可用1.4mol/L NaCl 提取DNA。
为了得到纯的DNA 制品，可用适量的RNase 处理提取液，以降解DNA 中搀杂的RNA。
关于植物总DNA 的提取主要有两种方法：1．CTAB 法：CTAB（十六烷基三甲基溴化铵，hexadecyltrimethylammonium bromide, 简称CTAB）：是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（0.7mol/LNaCl）是可溶的，当降低溶液盐的浓度到一定程度（0.3 mol/L NaCl）时从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB 与核酸的复合物同蛋白、多糖类物质分开，然后将CTAB 与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液中，再加入乙醇使核酸沉淀，CTAB 能溶解于乙醇中。
酚氯仿法提取dna注意事项
酚-氯仿法提取DNA时，需要注意以下几点：
1. 在吸取基因组DNA时，需要使用专用的粗口吸头，避免使用普通的吸头，因为这可能会切断或损坏DNA。
2. 在准备实验的过程中，应将DNA样品放在碎冰上，以保持其低温状态。
3. 加缓冲液后，可以轻轻晃动或轻弹试管，以加速DNA的溶解。
4. 加入缓冲液后，可以置于4度过夜，这样也有助于溶解DNA。
5. 将DNA溶液在65度下温育10分钟，可以灭活DNase，防止其降解DNA。
6. 在抽提过程中，如果水相和有机层的界面不太清楚，说明其中蛋白质含量较高，这时可以增加酚/氯仿抽提的次数或适当延长离心的时间。
7. 在酚抽提过程中，如果上清液太粘稠而无法进行水相转移，可以加入适量TES稀释后再抽提。
8. 氯仿的作用是克服酚的缺陷，加快有机相与液相的分层，最后用氯仿抽提出DNA。
由于酚易溶于氯仿中，可以快速去掉核酸溶液中的微量酚。
9. 加入异戊醇能减小分子表面张力，减少抽提流程中的泡沫发生。
通常选用氯仿与异戊醇为24:1的比例，异戊醇可
以帮助分相，使离心后的上层水相、下层有机溶剂相、中层变性蛋白相保持稳定的层次。
以上信息仅供参考，建议咨询专业人士获取准确信息。
全血基因组DNA提取试剂盒使用说明
全血基因组DNA提取试剂盒使用说明一、试剂盒组成及存储条件：1.试剂盒包括蛋白酶K、缓冲液、洗涤缓冲液、脱水溶液等。
2.试剂盒应存放在4℃以下避光干燥处，避免冻结。
二、实验前准备：1.准备所需的实验耗材和设备，如离心管、恒温振荡器、离心机等。
2.取出全血样品，可以是新鲜全血或已离心制备的全血细胞。
三、DNA提取步骤：1.取出全血样品，用洗涤液洗涤细胞沉淀并离心收集，去除红细胞。
2.加入蛋白酶K将细胞裂解，释放DNA。
3.加入缓冲液和脱水溶液，沉淀DNA并洗涤。
4.最终稀释DNA并保存在适当的条件下。
四、实验注意事项：1.操作过程中需注意无菌操作，避免污染。
2.加入蛋白酶K的量应准确控制，不要过多或过少。
3.混合溶液时需轻轻摇匀，避免气泡的产生。
4.稀释保存DNA时，需使用无核酸酶的载体溶液，如TE缓冲液。
五、质控及结果分析：1.可以通过琼脂糖凝胶电泳或比色法检测提取的DNA质量。
2.检测DNA浓度和纯度，确保提取的DNA适用于后续实验。
3.可以保存提取好的DNA样品，以备后续实验使用。
六、应用领域：1.该试剂盒适用于从全血样品中提取DNA，可用于基因分析、疾病诊断、遗传研究等领域。
2.可以用于个体基因检测、种群遗传学研究、药物反应性研究等。
总结：全血基因组DNA提取试剂盒是用于从全血样品中提取DNA的重要工具，操作简便、提取效率高。
在实验中需注意操作规范，保证提取的DNA质量和纯度。
该试剂盒广泛应用于科研领域，为基因研究和临床诊断提供了有力支持。
希望上述使用说明能够帮助用户正确、高效地使用全血基因组DNA提取试剂盒。
DNA提取工作总结
DNA提取工作总结
DNA提取是分子生物学中的一项重要工作，它是从生物体细胞中分离出DNA 分子的过程。
DNA提取工作在基因测序、PCR扩增、分子克隆等实验中起着至关重要的作用。
在进行DNA提取工作时，需要遵循一系列操作步骤和技术要求，以确保提取到高质量的DNA样品。
首先，DNA提取工作需要选择合适的样本。
样本的选择对提取工作的结果至关重要，因为不同的样本来源会影响到DNA的纯度和含量。
通常情况下，血液、细胞培养物、组织样本等都可以作为提取DNA的样本来源。
其次，DNA提取需要使用适当的提取试剂盒和工具。
目前市面上有许多不同品牌的DNA提取试剂盒，每种试剂盒都有其特定的提取原理和操作步骤。
在选择试剂盒时，需要根据实验的具体要求和样本来源来进行选择。
在进行DNA提取的过程中，需要严格遵循操作规程和技术要求。
比如，在样本裂解、蛋白质沉淀、DNA沉淀等步骤中，需要控制好温度、离心速度、酶的使用量等因素，以确保提取到纯度高、含量足够的DNA样品。
最后，对提取得到的DNA样品需要进行质量检测。
通过紫外分光光度计或者凝胶电泳等方法可以对提取得到的DNA进行浓度和纯度的检测，以确保提取到的DNA可以满足后续实验的需求。
总的来说，DNA提取工作是一项复杂而又重要的实验操作，它对实验结果的准确性和可靠性有着直接的影响。
只有严格遵循操作规程和技术要求，选择合适的试剂盒和工具，才能够提取到高质量的DNA样品，为后续实验工作奠定坚实的基础。
实验二 全血基因组DNA的提取
实验二：全血基因组DNA的提取一实验目的：1．学习并掌握动物全血提取DNA的方法2．从全血中提取到一定量的纯净的DNA样品二实验原理DNA存在于细胞核中，用细胞裂解液除取红细胞，核裂解液破坏白细胞，氯仿使蛋白质变性，用无水乙醇洗涤DNA，从而得到纯净的DNA分子。
三、实验仪器、材料、试剂（一）仪器1．高速离心机 2．烘箱 3．冰箱4．水浴锅5．微量移液器6．高压灭菌锅（二）材料1．鸡血、2．细胞裂解液3．核裂解液、4．饱和NaCl、5．氯仿、6．无水乙醇、7．ddHO、8.滤纸、9．微量取液器、10.1.5mL/2mL 离心管、11.一次性2手套、12.离心管架、13.记号笔等（三）试剂配制细胞裂解液:10mm/l Tris-Hcl(1mol/L) ,11%w/l蔗糖,5 mmol/L Mgcl2,1%v/vEDTA, 10mm/L Triton 核裂解液：10mm/l Tris-Hcl, 1%w/v SDS, 10mm/L Na2柠檬酸三钠四、实验步骤1．吸取500ul血液至2ml离心管，加入1000ul的细胞裂解液，上下颠倒2-3min。
2．在4°C，6000rpm转速离心3min,弃上清液。
3．重复1-2步（1-3次），直至洗净红细胞，颜色变白为止。
4.加入300ul核裂解液，上下颠倒2min,室温静置2min。
5.加入100ul饱和NaCl和600ul氯仿，轻轻上下颠倒2min, 4°C，6000rpm 转速离心5min。
6.小心吸取上清液（不能吸入下层液体），移至新的1.5ml的离心管。
7.加入600ul冷藏无水乙醇，轻轻摇动，观察有无絮状物质。
8. 4°C，13000rpm转速离心3min，小心倒掉上清液，用滤纸吸取管壁周围的液体，室温下是离心管完全干燥。
（1h左右）9.沿管壁慢慢加入50ul ddHO，然后轻轻吹打均匀。
210.-20°C的冰箱保存。
手提DNA部分注意事项1
手提DNA部分注意事项1、裂解液要预热，以抑制DNase，加速蛋白变性，促进DNA溶解。
2、酚一定要碱平衡。
苯酚具有高度腐蚀性，飞溅到皮肤、粘膜和眼睛会造成损伤，因此应注意防护。
3、各操作步骤要轻柔，尽量减少DNA的人为降解。
4、取各上清时,不应贪多,以防非核酸类成分干扰。
5、异丙醇，乙醇.NaAc，KAc等要预冷，以减少DNA的降解，促进DNA与蛋白等的分相及DNA沉淀。
6、提取DNA过程中所用到的试剂和器材要通过高压烤干等办法进行无核酸酶化处理。
7、所有试剂均用高压灭菌双蒸水配制。
8、用大口滴管或吸头操作，以尽量减少打断DNA的可能性。
9、要用新鲜样品或液氮冷冻-80度保存的样品。
这样通过降低内切酶的活性DNA的降解。
10、避免剧烈吸打DNA，不能搅动基因组DNA。
11、吸取基因组DNA时，要用专用的粗口吸头，普通吸头可能会切断DNA或造成DNA缺口。
材料应适量，过多会影响裂解，导致DNA量少，纯度低针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式：植物材料－－液氮研磨动物组织－－匀浆或液氮研磨组培细胞－－蛋白酶K细菌－－溶菌酶破壁酵母－－破壁酶或玻璃珠高温温浴时，定时轻柔振荡当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，沉淀会更充分沉淀时加入1/10体积的NaAc（pH5.2，3M），有利于充分沉淀沉淀后应用70％的乙醇洗涤，以除去盐离子等晾干DNA，让乙醇充分挥发（不要过分干燥）若长期储存建议使用TE缓冲液溶解TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+离子，抑制DNasepH值为8.0，可防止DNA发生酸解采用吸附材料吸附的方式分离DNA时，应提供相应的缓冲体系采用有机（酚/氯仿）抽提时应充分混匀，但动作要轻柔离心分离两相时，应保证一定的转速和时间针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的去杂质的方法。
实验一、血液标本提取DNA(蛋白酶K-酚抽提法)
实验一、血液标本提取DNA（蛋白酶K-酚抽提法）一、实验原理离心分离到外周血的白细胞层；用细胞裂解液溶解细胞膜、核膜，使组蛋白与DNA分离，再用酚、三氯甲烷/异戊醇抽提去除蛋白质，最后经乙醇沉淀即可得到基因组DNA片段。
二、实验步骤：1、血液标本处理 1.0ml抗凝全血(ACD、EDTA抗凝均可)2000rpm离心10min（1.5mlEP管）。
轻轻去上清液（血浆），吸出淡黄色悬浮液（白细胞层）置于另一2.0mlEP管中。
（约50μl）2、细胞裂解加入10倍体积组织细胞裂解液，37℃1h，3、加入蛋白酶K消化加入蛋白酶K至终浓度100μg/ml（约4μl），充分混匀，37℃震荡12-24h或37℃1h后，56℃水浴3h。
保温过程中不时摇动，混匀反应液。
液体逐渐变粘稠，表明已有DNA释放出来，操作应轻柔。
4、酚抽提：将上述溶液冷却至室温，加等体积的Tris饱和酚（pH8.0）溶液，温和缓慢颠倒离心管10min，混匀两相成乳液。
12000rpm 5分钟，两相分层。
用宽口径移液管小心吸出上层粘稠的水相，移至一新的2.0mlEP管中。
（小心一点，不要吸入蛋白层。
如交界处有白色沉淀，需重新抽提有机相，用酚重新抽提两次，合并水相）5、三氯甲烷/异戊醇抽提上清液加等体积三氯甲烷：异戊醇（24：1），倒转混匀10分钟，12000rpm5分钟，取上层水相0.5ml入另一新的2.0mlEP管；6、DNA沉淀上清液中加0.2倍体积3.0mol/L 醋酸钠，再加2倍体积的4℃冰箱冷却后的无水乙醇，轻柔振摇，充分混匀；应可看到白色絮状物（DNA）。
12000rpm 5分钟，弃上清液；7、纯化：加1ml 70%乙醇洗涤，12000rpm 离心5分钟，去上清夜，重复1次；（此过程不得振荡摇动）8、溶解：弃上清液后，自然干燥（挥发痕量乙醇）后，用30μl pH8.0TE完全溶解，保存在-20℃备用。
三、注意事项1、加样准确，操作轻柔；微量加样器绝对不能超过最大量程；2、加酚试剂时，不要接触到皮肤上，有腐蚀性；如不小心弄到，立即用清水冲洗；3、取上清液时，不可吸到下层溶液；4、加TE液后轻摇10min溶解DNA或-4˚C保存待用。
使用DNA提取试剂盒有哪些注意事项？
使用DNA提取试剂盒有哪些注意事项？
使用试剂盒提取DNA是一种常见的DNA提取方法，它提供了方便和标准化的操作流程。
以下是在使用试剂盒提取DNA时需要注意的几个重要事项：
实验室安全：在进行任何实验操作前，务必遵守实验室安全规范。
佩戴实验室个人防护装备，如实验手套、实验服和护目镜，确保实验环境的卫生和安全。
试剂保存：检查试剂盒的有效期和储存条件。
确保试剂的完整性和保存状态，避免使用过期或受损的试剂。
样本准备：根据试剂盒的说明书准备样本。
样本类型可以是细胞、组织或其他生物材料。
确保样本质量和数量符合试剂盒要求，避免使用受污染或质量不佳的样本。
操作流程：仔细阅读并按照试剂盒的操作手册执行步骤。
遵循说明书中的指导，严格按照操作顺序和时间表进行操作。
确保准确称量和混合试剂，并注意任何特殊的温度和时间要求。
避免污染：DNA提取过程中严格控制污染的发生。
使用无DNase、RNase和蛋白酶的试剂和工具，避免外源性DNA的污染。
同时，使用无菌技术和无菌操作条件，防止细菌或其他污染物的引入。
质量控制：进行质量控制步骤，如阳性和阴性对照的添加和检测。
数据记录：在实验过程中记录关键的实验参数、样本信息和操作步骤。
这将有助于追踪实验过程和数据分析，并在需要时进行结果验证和复现。
废弃物处理：遵循正确的废弃物处理程序，将废弃物分别投放到适当的容器中，确保遵守实验室的废弃物管理规定。
总之，使用试剂盒提取DNA时，准确遵循试剂盒的操作手册和注意事项，确保实验的准确性、可靠性和安全性。
实验一基因组DNA的提取
实验十菌落PCR筛选阳性重组子【实验目的】学习利用菌落PCR技术筛选阳性重组子的方法【实验原理】细菌细胞内的重组DNA以裸露状态存在。
在高温条件下，细菌细胞破裂，细胞内DNA暴露并因高温的作用而变性成为单链状态的DNA，此时该DNA可作为模板用于PCR，进而检测该DNA中是否含有重组的外源DNA序列。
【仪器、材料与试剂】1 仪器生化培养箱，超净工作台，离心机，PCR仪，电泳仪，电泳槽，连续可调移液器，凝胶成像系统2 材料含待检测菌的阳性筛选平板，PCR试剂盒，引物1（primer 1）和引物2（primer 2），PCR管，移液器枪头，ddH2O，电泳级琼脂糖，Tris碱，硼酸。
3 试剂PCR试剂盒：10X PCR buffer，MgCL2或MgSO4，dNTPs，DNA聚合酶；primer 1和primer 2：均配成10μmol的使用液；DNA Marker：根据PCR产物大小确定。
【实验步骤】1 配制25μL的PCR反应体系10×buffer 2.5 μLMgCL2或MgSO4 1.5～2.5μL（若buffer里有，则可不加或少加）dNTPs（2µmol） 2.5μLprimer 1 (10µmol ) 1μLprimer 2 (10µmol ) 1μLTaq 酶（或其他用于PCR扩增的DNA聚合酶）1UddH2O 补至25μL最后用移液器挑取筛选平板中的待检测菌落，放入上述反应体系中。
2 PCR程序配制好反应体系后，将其放入PCR仪中。
然后根据最初设计引物时的相关数据，设定PCR程序中的每一步的反应条件。
通常设计的反应条件如下：94℃预变性3～5min；94℃变性30sec～1min50～60℃退火1min 30～35个循环72℃延伸2min72℃最终延伸8～10min设定好程序后，即可开始运行程序，进行PCR。
3 PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测见实验六PCR完成后，取5～8μL PCR产物与适宜的上样缓冲液（loading buffer ）混匀后，加样电泳。
DNA与RNA提取的区别及注意事项
DNA与RNA提取的区别及注意事项DNA与RNA提取的区别及注意事项引言：DNA和RNA是生物体内两种重要的核酸分子，它们在遗传信息的传递和蛋白质合成中起着关键作用。
DNA提取和RNA提取是生物学研究和分子诊断中常用的实验技术。
本文将探讨DNA与RNA提取的区别，包括提取方法、提取的样本类型及注意事项，以帮助我们更好地理解和应用这两种技术。
一、DNA提取与RNA提取的方法1. DNA提取方法：DNA提取技术旨在从细胞或组织样本中分离出DNA分子。
DNA提取方法一般包括以下几个步骤：1) 细胞破碎：将样本中的细胞破碎，使DNA被释放出来；2) 蛋白质去除：利用蛋白酶等方法去除样本中的蛋白质污染；3) DNA纯化：通过溶液浓缩、离心等步骤，去除样本中的杂质，使DNA得到纯化。
2. RNA提取方法：RNA提取技术旨在从细胞或组织样本中分离出RNA分子。
RNA提取方法一般包括以下几个步骤：1) 细胞破碎：将样本中的细胞破碎，使RNA被释放出来；2) RNA保护：由于RNA容易被外界核酸酶降解，需使用RNA保护试剂保护RNA的完整性；3) 蛋白质去除：利用蛋白酶等方法去除样本中的蛋白质污染；4) RNA纯化：通过溶液浓缩、离心等步骤，去除样本中的杂质，使RNA得到纯化。
二、DNA提取与RNA提取的样本类型1. DNA提取的样本类型：DNA提取适用于多种生物样本，包括：1) 细胞：体液中的白细胞、培养细胞等；2) 组织：肌肉组织、肿瘤组织等；3) 体液：血液、唾液、尿液等。
2. RNA提取的样本类型：RNA提取也适用于多种生物样本，但需要更加谨慎处理，以保持RNA 的完整性。
常见的样本包括：1) 细胞：培养细胞、血液中的白细胞等；2) 组织：肝脏、心脏、肺等；3) 体液：血液、唾液、尿液等。
三、DNA提取与RNA提取的注意事项1. 样本采集：1) 注意采集样本时的卫生防护，避免外界污染；2) RNA提取时需快速处理，以防RNA被降解。
环境样品总DNA的提取 1
环境样品总DNA的提取一．前言DNA是遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子，是分子生物学研究的主要对象。
因此，DNA的提取是分子生物学实验技术中最重要/最基本的操作。
在DNA提取过程中应做到：1.保证结构的完整性；2.尽量排除其他大分子成分的污染（蛋白质、多糖及RNA等）。
3.保证提取样品中不含对酶有抑制作用的有机溶剂及高浓度的金属离子。
DNA的提取方法多种多样，目前本实验室采用的是“试剂盒法”提取微生物基因组。
这种方法就是用买来的成品套装试剂，按照内附的说明书一步步地操作即可完成样品DNA的提取。
一般来说出于保密原则，各个公司生产的试剂盒不会明确标出每种试剂的成分。
而对于从事分子生物学研究的我们来说，掌握基本的操作原理与理论知识又是必需的，因此本讲义将会从原理出发，解构DNA的提取，然后再附上一般的试剂盒法操作流程。
二. 实验目的学习油藏中微生物总DNA的提取方法。
三. 实验原理1. 样品预处理样品的预处理分为直接裂解和先分离再裂解，分离细胞主要利用离心等方法来得到完整的细胞，然后提取所得细胞的DNA，直接裂解的方法是不分离细胞而直接对环境样品进行裂解，目前应用较多的方法是直接裂解法，这种方法比起先回收细胞的方法具有更高的回收率，由于有更多的微生物被裂解，所以这种方法回收得到的DNA看起来更能代表样品中的微生物。
但是有利也有弊，此类方法如果用于提取像油田这样的含污泥土壤的样品的话，容易使提取物中含有腐殖酸（humin acid）和棕黄酸（fulvic acid）等杂质。
由于此类杂质会影响后续的操作，尤其是PCR扩增，所以这种方法得到的DNA通常需要进一步纯化。
2. 细胞裂解细胞裂解是提取DNA过程中最重要的步骤之一，是指破坏微生物细胞壁和细胞膜的过程。
常用的方法包括化学裂解法、酶裂解法和机械裂解法。
化学裂解法和酶裂解法是比较温和的裂解方法，通常很少会使得DNA断裂。
这两种方法（包括SDS和溶菌酶处理等）是传统的提取培养微生物DNA中常用的方法。
实验一 真核生物基因组DNA的提取和分析
（八）废弃液体除指定有专门容器收集者外，应倒 入水池，并放水冲走，固体废物倒入废物缸内。 动物尸体应放入指定的容器中。
（九）实验过程中自己不能解决或决定的问题，切 勿盲目处理，应及时向指导教师反映取得帮助。
（十）实验完毕，须将试剂排列整齐，整理好公用 物品，将仪器洗净收起。檫净实验台，请指导教 师检查，允许后方可离开。
1) 破碎细胞 2) 去除蛋白质，糖类等等生物大分子；由于真核细胞 基因组较大，在纯化出的DNA的操作中应注意动作轻 柔，且在低温下进行，以最大限度地减少机械和化学 作用对DNA的剪切，从而获得相对完整的DNA 3) 沉淀核酸
DNA提取和分析步骤图解
SDS裂解 蛋白酶K消化
酚氯仿抽提
二苯胺法
紫外分光光度法分析
答辩ppt内容： 实验目的，意义，原理，实验方法选择，预计结果及数据表现形式， 实验难点及可能出现问题，可能出现的实验结果偏差及解释
答辩安排： 最后一周答辩，每组时间控制为20分钟演讲，10分钟提问。
设计性实验题
1 免疫球蛋白IgG的分离纯化与鉴定。 2 人血清白蛋白的提取纯化及分子量的测定。 3 蛋清中溶菌酶的分离鉴定。 4 小鼠肝脏过氧化氢酶的分离纯化及酶动力学研究。 5 如何从动物心肌细胞中提取乳酸脱氢酶同工酶？ 6 如何提取真核细胞中的线粒体基因组DNA？ 7 请设计实验从基因及蛋白表达角度讨论老年痴呆症模型小鼠与人类老年痴 呆症的可比较性 （即小鼠模型建立的可靠性） 8 请设计实验从基因及蛋白表达角度追踪老年痴呆模型小鼠发病期典型变化， 及给药治疗后效果评价 9 蛋白质的表达具有一定的组织特异性，请以实验小鼠胰腺和肝脏为材料设 计实验检测羧肽酶A1酶原(procarboxypeptidase A1)和白蛋白(Albumin) 并计算这两种蛋白质在胰腺和肝脏中的表达量。 10 细胞色素氧化酶（Cytochrome oxidase）在肝脏中有三种亚型，即细 胞色素氧化酶1，2和3，请以实验小鼠肝脏为材料设计实验检测这三种酶的 表达并计算它们的表达量。
血液中DNA提取的原理
血液中DNA提取的原理：如果以外周血为DNA提取材料，在外周血中提取DNA就是从有核的白细胞中提取DNA。
因此，从外周血中提取DNA包括以下几个关键步骤：第一，破坏红细胞，通常利用红细胞与白细胞膜结构的差异，先使红细胞裂解，经离心后收集白细胞；第二，白细胞裂解：使膜蛋白和核蛋白变性，游离DNA，通常是采用离子型表面活性剂使蛋白质变性；第三，除去变性蛋白质：通常采用蛋白沉淀剂沉淀变性蛋白质，使DNA留在上清液中；第四，在高盐环境下使DNA从有机溶剂如无水乙醇中析出。
取材取外周血5ml，EDTA抗凝1.新鲜抗凝血，离心弃去上清液；2.取出4℃冰箱预冷的ELS裂解液，按1:6-10的比例向细胞沉淀中加入ELS裂解液（1ml 细胞压积加入6-10ml裂解液），轻轻吹打混匀；红细胞裂解液ELS配方：NH4Cl:4.15克加双蒸水500ml,取450ml;Tris:1.0297克加双蒸水50ml,再加上上面的450ml,共计500ml,高压灭菌,用时加10-20ml3.800-1000rpm离心5-8分钟，离心弃去上层红色清液；4.收集沉淀部分，加入Hank’s液或无血清培养液离心洗2-3次；5.如裂解不完全可重复步骤2和3；6.重悬细胞，用于后续实验；提取DNA，最好是于步骤4开始使用DEPC水配制的溶液进行.酚氯仿方法提取DNA在DNA提取过程中应尽量避免使DNA断裂和降解的各种因素，以保证DNA的完整性，为后续的实验打下基础。
是采用在EDTA以及SDS等试剂存在下用蛋白酶K消化细胞，随后用酚抽提而实现的。
这一方法获得的DNA不仅经酶切后可用于Southern分析，还可用于PCR的模板、文库构建等实验。
原则：（1）防止和抑制DNase对DNA的降解；（2）尽量减少对溶液中DNA的机械剪切破坏。
一、试剂准备1．TE: 10mM Tris-HCl (pH 7.8); 1mM EDTA (pH 8.0)。
2．TBS: 25mM Tris-HCl (pH 7.4); 200mM NaCl; 5mM KCl。
CTAB法提取DNA、Trizol一步法提RNA及注意事项
CTAB法提取DNA及注意事项0.1g菌丝体（植物新鲜组织）+ CTAB+适量石英砂研磨－→混匀－→ 65℃水浴1 h－→ 冰浴10min－→ 离心取研磨液于1.5mL 离心管－→ +700μL苯酚，混匀（5~20min）－→ 离心15min(10,000r) －→取上清液三次－→ +500μL（等体积）氯仿，混匀5—10 min－→ +离心15min －→取200μL上清液2次－→ 400μL异丙醇（等体积）上下颠5次，静置15min,离心10min－→去溶液，+700μL70%乙醇－→摇晃、离心10min－→去溶液，倒扣于纸上至酒精及水分挥发完原理及注意事项：1、加CTAB研磨：这一步骤是使得细胞裂解，CTAB是离子型表面活性剂能溶解细胞膜及核膜蛋白，使核蛋白解聚、DNA游离。
（注意：若是用液氮研磨，则加CTAB前需将CTAB65℃预热，因为当环境温度低于15℃时，CTAB析出，加冰冷样品前需预热。
在液氮中研磨使材料易于破碎，减少酶的作用）2、水浴过程中每需10 min混匀一次，使样品裂解充分。
3、加氯仿：异戊醇（24:1），使蛋白质变性、抽提液分相，核酸水溶性强，离心可除去细胞碎片及大部分蛋白质。
4、取上清液（400微升，避免吸油层），RNA提取（提前分装75%乙醇-DEPC及DEPC水）Trizol一步法1. 100 mg 叶片，液氮研磨（进口2 mL 管）。
2. 加入1 mL左右（800 μL）Trizol抽提液，摇匀，静置5 min （室温）。
3. 按每mL Trizol提取液加入200 μL 氯仿，剧烈震荡15 s ，室温静置5 min （3 min）。
4. 1,2000 r ,4℃离心15 min （提前将离心机调至4℃，盖上盖子，按下short键）。
取400-500μL 上清液（1.5 mL进口），加入等体积（500-600μL）异丙醇，颠倒混匀，-20℃，20 min （可省）。
实验一---DNA提取
天然状态的DNA 是以脱氧核糖核蛋白(DNP)形式存在于细胞核 中。要从细胞中提取DNA时，先把DNP抽提出来，再把蛋白质 和糖去除，同时除去RNA及无机离子等，从中分离DNA 。
提取植物 DNA 的方法主要采用 SDS 和 CTAB 法，对它们进行稍 加修改就可以应用于 DNA的微量提取。两种方法均采用去污剂 裂解细胞并保护DNA不受内源核酸内切酶降解。
实验材料和试剂
实验材料：新鲜植物组织。 实验所需试剂： DNA提取缓冲液 100 mmol/L Tris-HCl (pH8.0) 50mmol/L EDTA 500 mmol/L NaCl 1.5% SDS 24:1/氯仿:戊醇 2×CTAB buffer 100mM Tris pH8.0 1.4M NaCl 20 mM EDTA pH8.0 2% CTAB 0.2% 巯基乙醇 酚/氯仿（1:1） 氯仿：50 ml 无水乙醇
核酸的理化性质
RNA和核苷酸的纯品都呈白色粉末或结晶，DNA则为白色类 似石棉样的纤维状物。除肌苷酸、鸟苷酸具有鲜味外，核酸 和核苷酸大都呈酸味。 DNA、RNA和核苷酸都是极性化合物，一般都溶于水，不溶 于乙醇、氯仿等有机溶剂，它们的钠盐比游离酸易溶于水， RNA钠盐在水中溶解度可达 40g/L。DNA在水中为10g/L，呈 黏性胶体溶液。在酸性溶液中，DNA、RNA易水解，在中性 或弱碱性溶液中较稳定。
具体方法简单说来就是利用液氮对植物组织进行研磨，从而破 碎细胞。细胞提取液中含有的 SDS溶解膜蛋白而破坏细胞膜， 使蛋白质变性而沉淀下来。 EDTA抑制 DNA酶的活性。再用酚、 氯仿抽提的方法去除蛋白，得到的DNA溶液经乙醇沉淀。
细胞破碎
①机械方法： 超声波处理法、研磨法、匀浆法；
【高中生物】高中生物实验DNA的粗提取和鉴定实验中应注意的问题
【高中生物】高中生物实验DNA的粗提取和鉴定实验中应注意的问题1.盛放鸡血细胞液的容器，最好是塑料容器。
因为鸡血细胞破碎后释放出的dna，容易被玻璃容器吸附，细胞内dna的含量比较少，如果被玻璃窖吸附却一部分，提取的dna就会更少。
因此，实验过程中最好使用塑料的烧杯和试管，这样可以减少提取过程中dna的损失。
2.获取较纯净的dna的关键步骤。
⑴充份烘烤鸡血细胞液。
dna存有于鸡血细胞的细胞核中。
将鸡血细胞液与蒸馏水混合后，必须用玻璃棒沿一个方向快速烘烤，并使鸡血细胞快速断裂，并放出dna。
⑵沉淀dna时必须用冷酒精。
实验前必须准备好大量的体积分数为95%的酒精，并在冰箱中至少存放24h。
⑶恰当烘烤所含悬浮物的溶液。
实验步骤3、5、7都须要用玻璃棒烘烤。
在展开步骤3、5时，玻璃棒不要轻易碰触烧杯底部，而且烘烤必须轻缓，以便赢得较完整的dna分子。
展开步骤7时，必须将玻璃棒填入烧杯中溶液的中间，用手缓慢旋转5min～10min。
3.本实验中鉴定dna的方法为二苯胺法。
如果在没有二苯胺的情况下也可以用以下几种方法。
⑴酿制染色剂。
用蒸馏水酿制0.05%的溴化乙锭(eb)溶液。
⑵将玻璃棒上缠绕的白色絮状物抹于蜡纸上，再滴1滴eb溶液染色。
⑶将蜡纸放到紫外灯(260nm)下反射(暗室中)，可知橙红色的荧光(dna的紫外稀释高峰在260nm处为)。
4．典例解析1.以下关于“dna的细抽取与鉴别”的实验原理中，观点错误的就是a.dna在氯化钠溶液中的溶解度随溶液浓度的变化而改变b.利用dna不溶酒精的性质，可以除去细胞中溶酒精的物质而获得醇钠的dnac.dna是大分子有机物，不溶于水而溶于某些有机溶剂d.dna溶液中重新加入二苯胺试剂经沸水浴后可以发生蓝色反应解析：该实验依据的原理是a、b、d，dna不溶于酒精(属有机溶剂)，c说法错误。
答案：c2.下列关于实验操作的说法中，有误的是()a.该实验中存有两次重新加入蒸馏水，均就是为了划出dnab.该实验学生操作中多次用到搅拌，除最后一步未强调方向外，其余均要求单向搅拌c.该实验中存有3次过滤器，过滤器时采用纱布层数与需以滤液或粘稠物有关d.实验三次加入nacl溶液，无论浓度是2mol/l，还是0.015mol/l，均是为了溶解dna解析：对照比较表中所述，除a观点有误外，其余各项均恰当。
DNA提取注意事项1
核酸制备中常用的去垢剂 核酸本身带负电荷，结合带正电荷的蛋白质。用 于核酸提取的去垢剂，一般都是阴离子去垢剂， 去垢剂的作用： 1．溶解膜蛋白及脂肪，使细胞膜破裂； 2．溶解核糖体上面的蛋白质，使其解聚，将核酸 释放出来； 3．对RNase、DNase有一定的抑制作用。
如：SDS、脱氧胆酸钠、4-氨基水杨酸钠、萘-1.5-二磺酸钠、 三异丙基萘磺酸钠
三、操作步骤
1、1.5ml菌液（每组两管）4 ℃ 12000rpm离心30sec， 弃去上清，倒置试管于吸水纸上吸干。 2、每管加入400µ l裂解液，用移液枪枪头反复抽吸辅 助裂解，37 ℃水浴30min。 3、每管加入132µ l的5M NaCl溶液，颠倒试管，充分混 匀后，13000rpm离心15min。用粗口的枪头（用剪刀剪 去1ml枪头的尖端）小心取出上清液转倒两支新的 eppendorf管中。 4、加入等体积的饱和苯酚/氯仿，充分混匀后， 12000rpm离心3min，离心后的水层如混浊则说明仍含 有蛋白质，则需将上清液转入新的试管，重复上述步骤 直到水层透明，水层和酚层之间不再白色沉淀物为止 （约2次）。
核酸制备时应注意的事项: ①尽量简化操作步骤，缩短提取过程。 ②减少化学因素对核酸的降解。 ③减少物理因素对核酸的降解：机械剪切力和高温 ④防止核酸的生物降解。
核酸制备的步骤：
I.材料准备
破碎细胞 II.破碎细胞或包膜－内容物释放
提取
III.核酸分离、纯化
纯化
IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质
V.核酸溶解在适量缓冲液或水中
5、将上层清液转入新的eppendorf管，加等体积的氯仿，混匀 后13000rpm离心3min，除去苯酚。
6、小心吸出上清液转入新的eppendorf管，用预冷的两倍体积 的无水乙醇沉淀，放置－20℃冰箱30min，然后13000rpm离心 15min，可见白色丝状沉淀物。 7、小心吸出液体，弃上清液，用预冷的400µ l 70％乙醇洗涤2 次，室温干燥后，用50µ lTE （含20µ g/ml的Rnase）溶解DNA， －20℃冰箱放置备用。
DNA提取实验
DNA提取实验DNA提取是现代生物学研究的基础实验之一，它可以从生物体内分离和纯化DNA分子，为各种分子生物学技术和研究提供重要的基础。
本实验旨在介绍DNA提取的基本步骤和操作技巧。
材料和仪器：1. 新鲜的生物样本（如水果、蔬菜、口腔拭子等）2. DNA提取试剂盒3. 离心管4. 加热器5. 离心机6. 显微镜实验步骤：1. 样本处理：a) 将生物样本取出，如水果则切成小块，口腔拭子可直接使用。
b) 将样本放入离心管中。
c) 使用试剂盒提供的试剂，在样本中加入适量的细胞裂解缓冲液。
d) 轻轻摇动离心管，使样本与缓冲液均匀混合。
e) 将离心管放入加热器中，在60摄氏度恒温加热20-30分钟，以促进细胞的破裂和DNA的释放。
2. 细胞裂解：a) 将加热后的样本离心管取出，稍微晃动离心管使样本充分混合。
b) 加入适量的蛋白酶，用离心管盖密封离心管，并再次摇动离心管混合。
c) 将离心管放入加热器中，以高温（通常为60-65摄氏度）恒温孵育10分钟，以使蛋白酶发挥作用，降解细胞蛋白。
3. DNA沉淀：a) 将加热后的样本离心管取出，加入等体积的冷异丙醇，并摇动离心管使两者充分混合。
b) 将混合溶液离心10-20分钟，以最大速度离心沉淀DNA。
c) 抽掉上层溶液，离心沉淀的DNA。
d) 加入适量的70%乙醇洗涤一次，以去除残留的盐和其他杂质。
e) 将离心管倒置于纸巾上，待乙醇挥发后，加入适量的去离子水重新溶解DNA。
4. DNA纯化：a) 使用显微镜观察提取的DNA溶液中是否有明显的纹理和颜色，以确保DNA提取的成功。
b) 使用测量纯度和浓度的仪器对提取的DNA进行定量分析，并记录结果。
c) 将DNA溶液保存在低温冷冻条件下，以防止DNA的降解和损伤。
实验注意事项：1. 实验前需佩戴实验手套和口罩，防止污染和细菌感染。
2. 操作过程中需注意无菌操作，避免污染。
3. 实验前要确保所有仪器和材料已经正确消毒和清洗。
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5、将上层清液转入新的eppendorf管，加等体积的氯仿，混匀 后13000rpm离心3min，除去苯酚。
6、小心吸出上清液转入新的eppendorf管，用预冷的两倍体积 的无水乙醇沉淀，放置－20℃冰箱30min，然后13000rpm离心 15min，可见白色丝状沉淀物。 7、小心吸出液体，弃上清液，用预冷的400µ l 70％乙醇洗涤2 次，室温干燥后，用50µ lTE （含20µ g/ml的Rnase）溶解DNA， －20℃冰箱放置备用。
一、实验原理
4、核酸制备的一般方法和原理
核酸酶的抑制和抑制剂 降低温度，改变pH及盐的浓度，都利于对核酸酶 活性的抑制，但均不如利用核酸酶抑制剂更有利，当 然，几个条件并用更好。 对于DNA，抑制DNase活力很容易，但防止机械 张力拉断则更重要。 对于RNA，因分子较小，不易被机械张力拉断， 但抑制RNase活力较难，故在RNA提取中设法抑制 RNase更重要。
三、操作步骤
1、1.5ml菌液（每组两管）4 ℃ 12000rpm离心30sec， 弃去上清，倒置试管于吸水纸上吸干。 2、每管加入400µ l裂解液，用移液枪枪头反复抽吸辅 助裂解，37 ℃水浴30min。 3、每管加入132µ l的5M NaCl溶液，颠倒试管，充分混 匀后，13000rpm离心15min。用粗口的枪头（用剪刀剪 去1ml枪头的尖端）小心取出上清液转倒两支新的 eppendorf管中。 4、加入等体积的饱和苯酚/氯仿，充分混匀后， 12000rpm离心3min，离心后的水层如混浊则说明仍含 有蛋白质，则需将上清液转入新的试管，重复上述步骤 直到水层透明，水层和酚层之间不再白色沉淀物为止 （约2次）。
核酸提取的一般过程 3）核酸的纯化 根据所需核酸的性质和特点除去其它核酸污 染,并除去提取过程中的系列试剂(盐、有机溶剂 等）杂质，最后得到均一的核酸样品。
4）核酸样品的保存 核酸保存的主要条件是温度和介质 温度： 4℃（5℃）最佳和最简单 -70℃是长期保存的良好温度，为一次性保存 -20℃保存 保存介质： TE缓冲溶液(最常用) 10mmol/L Tris-Cl pH8.0 1mmol/L EDTA pH8.0
1.
重新纯化DNA，去 除蛋白、多糖、多酚 等杂质
2.
对 策
2.
重新沉淀DNA，让 酒精充分挥发
增加70％乙醇洗涤 的次数（2-3次）
3.
3.
五、DNA提取常见问题
问题二：DNA降解
原 因
1. 2.
1.
3.
4. 5.
材料不新鲜或反复冻 融 未很好抑制内源核酸 酶的活性 提取过程操作过于剧 烈，DNA被机械打断 外源核酸酶污染 反复冻融
一、实验原理
2、核酸制备的一般原则
分离纯化核酸总的原则： ①应保证核酸一级结构的完整性； ②排除其它分子的污染。 核酸纯化应达到的要求： ①核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高 浓度的金属离子； ②其它生物大分子的污染应降低到最低程度； ③排除其它核酸分子的污染。
一、实验原理
3、核酸制备的一般原则
实验一 细菌基因组DNA的提取 一、实验原理
1、核酸的分类
DNA 主要存在于细胞核的染色体中。核外也有少量DNA， 如线粒体DNA（mtDNA），叶绿体DNA （cpDNA），质粒DNA。 RNA 存在于细胞质中，如mRNA, rRNA, tRNA等。 除上述DNA，RNA外，还有非细胞形式存在的病毒和 噬菌体，其或只含DNA，或只含有RNA。
• •
TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase
pH值为8.0，可防止DNA发生酸解
五、DNA提取常见问题 问题一：DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应。
原 因
1.
DNA中含有蛋白、 多糖、多酚类杂质 DNA在溶解前，有 酒精残留，酒精抑 制后续酶解反应 DNA中残留有金属 离子
四、注意事项——核酸分离、纯化
采用吸附材料吸附的方式分离DNA时，应提 供相应的缓冲体系 采用有机（酚/氯仿）抽提时应充分混匀，但 动作要轻柔 离心分离两相时，应保证一定的转速和时间 针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相 应的去杂质的方法
四、注意事项——核酸沉淀、溶解
当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀， 沉淀会更充分 沉淀时加入1/10体积的NaAc（pH5.2，3M），有利 于充分沉淀 沉淀后应用70％的乙醇洗涤，以除去盐离子等 晾干DNA，让乙醇充分挥发（不要过分干燥） 若长期储存建议使用TE缓冲液溶解
二、材料、设备及试剂
菌种 ：DBT降解菌 设备 ：eppendorf管、微量取液器(20μl,200μl,1000μl)， 台式 高速离心机， 涡旋振荡器 试剂：LB液体培养基 、裂解液（40mMTris-醋酸，20mM醋酸 钠,1mMEDTA,1%SDS,pH8.0）、5M NaCl 、Tris-饱和酚、氯仿、 RNA酶A 、无水乙醇
四、注意事项——材料准备
最好使用新鲜材料，低温保 存的样品材料不要反复冻融
提取血液基因组DNA时，要 选择有核细胞（白细胞） 组培细胞培养时间不能过长， 否则会造成DNA降解
含病毒的液体材料DNA含量 较少，提取前先富集
四、注意事项——细胞裂解
材料应适量，过多会影响裂解，导致DNA量 少，纯度低 针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式： • 植物材料－－液氮研磨 • 动物组织－－匀浆或液氮研磨 • 组培细胞－－蛋白酶K • 细菌－－溶菌酶破壁 • 酵母－－破壁酶或玻璃珠 高温温浴时，定时轻柔振荡
2.
对 策
3.
4. 5.
6.
尽量取新鲜材料，低温保存材料避 免反复冻融 液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻 前加入裂解缓冲液 在提取内源核酸酶含量丰富的材料 的DNA时，可增加裂解液中螯合剂 的含量 细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔 所有试剂用无菌水配制，耗材经高 温灭菌 将DNA分装保存于缓冲液中，避免 反复冻融
五、DNA提取常见问题 问题三：DNA提取量少
1.
原 因
1. 2. 3. 4.
2.
实验材料不佳或量少 破壁或裂解不充分 沉淀不完全
3.
对 策
4. 5. 6.
洗涤时DNA丢失
尽量选用新鲜（幼嫩）的材 料 动植物要匀浆研磨充分；G＋ 菌、酵母裂解前先用生物酶 或机械方式破壁 高温裂解时，时间适当延长 （对于动物细胞、细菌可增 加PK的用量） 低温沉淀，延长沉淀时间 加辅助物，促进沉淀 洗涤时，最好用枪头将洗涤 液吸出，勿倾倒
核酸制备中常用的蛋白质变性剂
蛋白质变性剂的作用： 1.使蛋白质变性、沉淀，从核酸提取液中分离除去，以防造 成蛋白污染。 2.使蛋白质变性，故可使核糖体解聚释放出核酸。 3.某些蛋白质变性剂也有抑制RNase活性和破裂细胞的作用。
如：苯酚、氯仿、盐酸胍、DEPC
核酸制备中常用的酶 DNase RNase 蛋白酶K 溶菌酶
核酸酶的抑制和抑制剂 DNase抑制
①加入少量金属离子螯合剂，如0.01 mol/L EDTA 或柠檬酸钠，DNase基本可以全部失活。 ②去垢剂、蛋白变性剂及DNase抑制剂也可使 DNase失活。
核酸酶的抑制和抑制剂 RNase抑制 ①操作要带手套。 ②所有器皿要严格消毒， ③试剂处理 ④低温操作 ⑤在分离过程中要加入一定的RNase抑制剂。
核酸制备时应注意的事项: ①尽量简化操作步骤，缩短提取过程。 ②减少化学因素对核酸的降解。 ③减少物理因素对核酸的降解：机械剪切力和高温 ④防止核酸的生物降解。
核酸制备II.破碎细胞或包膜－内容物释放
提取
III.核酸分离、纯化
纯化
IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质
V.核酸溶解在适量缓冲液或水中
核酸提取的一般过程 1）破碎细胞（防止核酸酶的作用） 微生物：溶菌酶、SDS裂解。 高等植物：捣碎器破碎、液氮研磨。 酶法：蛋白酶，如胰蛋白酶， 冰冻法：反复冻融或液氮冻后组织捣碎。 动物：液氮处理后用匀浆器破碎。 细胞器DNA：首先纯化细胞器。
以上处理时均要同时加入核酸酶抑制剂
核酸提取的一般过程 2）破碎抽提核酸除去杂质 1．首先使脱氧核糖核蛋白、核糖体、病毒的核蛋白与 其它成分分离 2．使核酸与蛋白质分离 3．除去脂类 4．多糖的除去
六、问题与讨论
1．简要叙述酚氯仿抽提ＤＮＡ体系后出现的 现象及其成因。
2.
沉淀ＤＮＡ时为什么要用无水乙醇？
基因工程教学网站： http://210.32.200.206/gene
核酸制备中常用的去垢剂 核酸本身带负电荷，结合带正电荷的蛋白质。用 于核酸提取的去垢剂，一般都是阴离子去垢剂， 去垢剂的作用： 1．溶解膜蛋白及脂肪，使细胞膜破裂； 2．溶解核糖体上面的蛋白质，使其解聚，将核酸 释放出来； 3．对RNase、DNase有一定的抑制作用。
如：SDS、脱氧胆酸钠、4-氨基水杨酸钠、萘-1.5-二磺酸钠、 三异丙基萘磺酸钠