抑制差减杂交技术原理及常见操作结果分析

将RsaI酶切完全的cDNA用adapter1和adapter2R两 种接头连接。通过PCR扩增检测连接效率。 PCR的引物根据RsaI位点和adapter1、adapter2R 的序列设计。这一般要求扩增的片段中不含RsaI 位点序列。在扩增后琼脂糖胶电泳检测结果中, 如果用一个基因特异性引物和一个接头引物所得 到的带亮度与两个基因特异性引物所得到的带的 亮度一致,说明连接较好;如果用一个基因特异性 引物和一个接头引物所得到的带亮度只有两个基 因特异性引物所得到的带的亮度的25%,则说明连 接效率不到25%,应检查RsaI酶切效果并重新连接。
3 抑制差减杂交技术的优缺点
3.1 与其他几种方法相比,SSH技术具有较明显的优越性: (1)通过两步消减杂交和两次抑制PCR可DDRTPCR和cDNA-RDA法中,低丰度的 mRNA一般不易被检测到,SSH方法所做的均等化和目 标片段的富集,保证了低丰度mRNA 也可被检测出。 (3)速度快,效率高。一次SSH反应可 以同时分离几十或成百个差异表 达基因。
抑制差减杂交技术原理 及常见操作结果分析
摘要
抑制差减杂交 (SuppressionSubtractiveHybridization,SSH)是一种 高效鉴定和分离克隆差异表达基因的新技术。 目前,该技术在分子生物学研究的各个领域得 到了广泛的应用作了较全面的介绍,可为研究者们 提供参考。
2.4 第一次杂交、第二次杂交和PCR扩增
将经RsaI消化的drivercDNA和分别连接有adapter1、 adapter2R的testercDNA混合进行第一次杂交。再将第一次 杂交的两个样本混合在一起,同时加入新鲜的drivercDNA, 以进一步富集差异表达序列。在两端具不同接头的差异 表达的cDNA形成新的杂交分子。
先将差异表达的cDNA杂交分子的接头缺失部 分补平,进行第一轮扩增。在第一轮扩增中,仅具 有不同接头的双链cDNA分子能指数增长。接 着通过巢式PCR可进一步降低背景,且富集差异 表达的序列,不同丰度的差异表达的转录物也得 到了平衡化。通过电泳检测第二次PCR的效率。 未克隆净,则说明有DNA、蛋白质或 多糖污染,应进一步纯化。如果亮度呈:28s<18s<5s, 则说明RNA发生了降解。RNA的纯度还可以通过 分光光度计测定在26nm和28nm下的OD值来确定。 如果在260nm和280nm下的OD值之比为1.7～2.0,说 明RNA较纯;如果比值小于1.7～2.0,说明样品中有 蛋白质或多酚污染。 在分离mRNA之前,首先测定RNA在260nm下的 OD值,计算RNA的浓度。然后按Oligotex mRNAS pin-Column试剂盒从总RNA中分离mRNA。mRNA 分离出来后,与分离剩余物同时点样,进行1×TAE 琼脂糖胶电泳,可以见到:分离的mRNA在18s和28s 之间呈较亮的smear;而剩余物则表现为18s和28s两 条亮带。2.5 差减的构建与Tester特异序列的验证
将扩增的差减cDNA插入T/A克隆载体,用NotI位点(SmaI, XmaI)在接头1和EagI位点在接头2R处作位点特异性克隆,或 用RsaI位点在析和差异筛选来 验证PCR扩增,点膜,分别用标记的Tester和DrivecDNA作探针 进行点杂交。 凡只与TestercDNA有杂交信号而 与Driverc DNA无杂交的克隆,即为含 Test0%以上。
生物的生长、发育、代谢、繁殖和死亡等生命活动 都是由不同的基因表达来控制的,一般认为某一时期的表 达基因的数量约为全部基因的1.5%,所以基因的表达具有 时空性和组织特异性。研究基因的差异表达,可探究造成 生物细胞表型差异的遗传原因,提供研究复杂生命过程的 基本信息。 研究差异表达基因的方法很多,如组织或特异时期的 同工酶谱分析、差减杂交(subtractivehybridization, SH)、 mRNA差别显示法(differentialdisplay,DD)、代表性序列差 别分析(representationaldifferenceanalysis,RDA)和抑制差减 杂交技术(suppressionsubtractivehybridization,SSH)。 近年来,抑制差减杂交技术(SSH)以其高效便捷和低假 阳性的优越性受到广大研究人员的重视,已在分子生物学 的各个领域得到了广泛的应用。
2.2 cDNA的合成
cDNA两条链的合成用Clontech PCRSelectcDNASubtractionKit(试剂盒)来完成。
2.3 RsaI消化和adapter1、adapter2R的连接
用RsaI酶切合成的cDNA可产生短的双链平末端cDNA 片段。检测酶切效果。取0.2μg未经酶切的cDNA和5μl用 RsaI消化的cDNA进行琼脂糖胶电泳(1%),前者为接近点样 孔的高分子量带,后者为0.1～2kb之间的smear。如果用RsaI 消化后的cDNA未变小或仍大于2kb,说明酶切效率不高,可 能是cDNA中不含有RsaI的酶切位点或cDNA中混有酶的抑 制剂。可以考虑选择HaeIII或AluI或其他六碱基位点的酶。 如果是杂质污染,可以用氯仿/酚抽提纯化。
2 抑制差减杂交技术流程及常见操作结果分析 2.1 RNA的抽提和mRNA的分离纯化
对植物材料而言,RNA的抽提一般有两种方法,其一是 异硫氢酸胍法,其二是酚/SDS法。提取的RNA的质量, 可通过1×TAE琼脂糖胶电泳和分光光度计检测。对于 高质量的RNA,胶电泳呈三条带:28s、18s和5s,点样孔干 净,且三条带的亮度呈:28s>同来源组织的mRNA(tester和driver),反转录成 cDNA,用4碱基识别酶(RsaI)或HaeIII酶切两种cDNA产生平端片 段;将testerc DNA分成均等的两份,分别接上dapter1和adapter2两 种接头,并与过量的经RsaI消化的driver样本变性后退火杂交。 第一次杂交后有4种产物:a是单链testercDNA;b是自身退火的 testercDNA双链;c是tester和driver的异源双链;d是drivercDNA。 根据复性动力学原理,丰度高的单链cDNA退火时产生同源杂交 速度快于丰度低的单链cDNA,因此第一次杂交使得丰度有差别 的cDNA的单链分子的相对含量趋向一致。 混合两份杂交样品,同时加入新的变性driver cDNA 进行第二 次消减杂交。杂交完全后补平末端,加入合适引物(即adapter1和 adapter2的部分特异序列)进行PCR扩增,只有含不同接头的双链 DNA分子(e)才可进行指数扩增,扩增产物即为目的片段。利用 adapter上的酶切位点可进行克隆、测序等。
抑制差减杂交技术原理及 常见操作结果分析
3 .2抑制差减杂交技术的缺点 SSH也存在一定的缺点: 所得到的差异cDNA是限制消化的c而且对于组成型表达的目的基因筛选效果不好。
抑制差减杂交技术原理及 常见操作结果分析
1 抑制差减杂交技术原理
抑制差减杂交技术(SSH)是由 Diatchenko等建立的以抑制性PCR和 DNA差减杂交方法相结合的方法。其 依 据 的 主 要 技 术 有 两 点 : (1)消减杂交; (2)抑制PCR。 经抑制差减杂交后的cDNA群体不 仅富集了差异表达基因(目的基因),而 且目的基因间丰度的差异经过均等化 作用已基本消除,使消减后的cDNA群 体为丰度一致的目的基因群体。
巢式PCR:
巢式聚合酶链反应(nested polymearse chain reaction, nPCR)也称套式PCR。在这种技术中，首 先用一对外引物进行第1轮PCR，然后再使用第1 对引物扩增的DNA序列内部的一对引物再次扩 增，所以称为巢式PCR。由于使用了两对引物并 且进行了两轮扩增反应，因此试验的敏感性和特 异性均增强。在一定情况下，这种方法对减少 PCR后扩增产物的污染问题极为有用，但它增加 了每次试验的复杂性。为了经济节约，可在第2 轮扩增时采用半巢式，设计单条引物，另一条引 物与第1轮扩增共用，效果也优于单次扩增。一 般应用于动物方面。如：病毒，梅毒螺旋体， HIV，肿瘤基因等 。