抑制差减杂交技术原理及常见操作结果分析
抑制性消减杂交(SSH)技术及其应用
抑 制 性 消 减 杂 交 技 术
（ｕｐ ｅｓｏ Ｓ ｐｒ ｓ ｉｎ
１３ 将 ｔ ｓ ｅ Ｄ Ａ分成 两组 （ 和 ２ ，分 别于其 ． ｅｔｒｃＮ １ ）
Ｓ ｂ ｒ ｃ ｉ ｅ Ｈ ｂ ｉ ｉ ａ ｉ ｎＳ Ｈ 是 Ｄ ａ ｃ ｅ ｋ ｕ ｔ ａ ｔ ｖ ｙ ｒ ｄ ｚ ｔ ｏ ，Ｓ ） ｉ ｔｈｎ ｏ
一
阳性率低 、 筛选效 率高 、 操作 简单等优 点 ， 别适用 于 特 克 隆分析造成 某种特 殊表型 的 目相 同但 在
短链 （ １ 约 ０余个核苷 酸 ） 组成 的双链 ＤＡ片 段 ， Ｎ 长
同， 内侧序 列与第二次 Ｐ Ｒ引物序列 相 同。 外 ， 而 Ｃ 此 在
［ 摘
要］ 制性消减杂交技术 （Ｓ ） 抑 Ｓ Ｈ 是一种高效检测差异表达基 因的方法 。 详细论述了抑制性消减杂交的基本原理及过程，
并简要介绍了其在工业生产菌种改 良中的应用 。 ［ 关键词］ 抑制性消减 中 ８ ［ 文献 标 识 码 ］ Ａ ［ 章编 号 ］ １ ０ — ０ ５ ２０ ） ７０ ３ － ３ 文 ０ ３ ５ ９ （０ ８ ０ － ０ １０
５ 端接上 去磷酸 化 的接 头 １ 接 头 ２ （ｄ ｐｏ ， 和 ａ ａｔｒ １
等于 １９ 依据 消减杂 交和 抑制 Ｐ Ｒ发 展起 来 的 ９６年 Ｃ
一
种 分 离差 异表 达 基 因的新 方 法 ［３该 技术 具 有假 ， ２
ａａ ｔｒ２。 ｄｐ ｏ ） 两接头分别是具有一段反向末端重复序 列 的寡核苷 酸序 列 ， 由一长链 （ ４ 约 ０余个 核苷酸 ） 和
含有 目的基 因的样 品称 为试验方 （ｅ ｔ ｒ 。 Ｔ ｓ ｅ ）
除接 头不 同外 是完 全同源 的， 然形成 ａｂＣｄ但第 仍 ，、、，
抑制性减法杂交技术
抑制性减法杂交技术1996年，L. Diatchebko在RDA的基础上建立了抑制性减法杂交（supression subtractive hybridization, SSH）技术，该技术是RDA技术的发展，能有效克服RDA或cDNA RDA技术难以解决的问题，如两者不能用于分离两组基因表达差异较小的基因，也不能用于研究存在上调表达的基因等。
(1) SSH的主要原理SSH的核心技术是抑制性PCR (suppression PCR )，它是一种将检测子cDNA单链标准化步骤和消减杂交步骤结合为一体的技术。
其中标准化步骤均等了检测子中的cDNA单链丰度，而消减杂交步骤去除了检测子和驱赶子之间的共同序列，使检测子和驱赶子之间不同的序列得到扩增。
因此SSH显著增加了获得低丰度表达差异cDNA的概率，简化了对消减文库的分析。
抑制PCR是利用链内复性优先于链间复性的原理，使非目标序列片段两端的长反向重复序列(long inverted repeats)在复性时产生“锅柄样”(panhandle-like）结构或“发夹结构”而无法与引物配对，从而选择性地抑制了非目标序列的扩增。
同时，根据杂交的二级动力学原理，丰度高的单链cDNA复性时产生同源杂交速度要快于丰度低的单链cDNA，从而使得丰度存在差异的cDNA相对含量趋于基本一致。
（2）SSH的基本过程如图所示，SSH的主要步骤包括：限制性核酸内切酶切割，产生大小适当的平头末端cDNA片段。
②将检测cDNA分成均等的两份，分别接上接头1或接头2,接头（adaptor)由一长链(40nt)和一短链(l0nt)组成的一端是平末端的双链cDNA分子。
长链3′端与cDNA5′端相连。
长链外侧序列（约20nt）与第一次PCR引物序列相同，内侧序列则与第二次PCR引物序列相同。
此外，接头上含有升启动子序列及内切酶识别位点（如Not I, Srf I, Sma I和Xba I等），为以后将该片段插入克隆载体和测序提供便利。
抑制消减杂交(SSH)技术的研究与应用
Ｈ ｉ ｎ ｊ ｎ ｎｍ ｌ ｃ ｎ ｅ ｅ ｏ ｇｉ ｇＡ ｉ ａ Ｓ ｉ ｃ ｌ ａ ｅ
ａ ｄ Ｖｅｅｉ ａｙＭｅ ｉｉｅ ｎ ｔｒ ｒ ｄｃｎ ｎ № ２ ２０ ０８
近。 由于 Ｖ Ｐ 在 立 体 结 构 上 与 天 然 病 毒 相 同或 类 Ｌｓ 似， 因此 Ｖ Ｐ Ｌ ｓ能激 发 体 液 免疫 、 细胞 免 疫 和黏 膜 免 疫， 具有 安全 、 高效 的特 点 ， 是很 有发 展前 景 的候 选疫 苗 。但 是 ， 目前 Ｖ Ｐ 主要 通 过基 因工 程 手 段从 酵母 Ｌｓ 或感染重 组杆状 病毒 的昆虫细 胞 中制备 ， 这对操 作者 有 较高 的要求 和较复杂 的试验 操作 条件 。 ３ 利用 反 向遗传 操作 技术制 备的疫 苗
随着 人类 基 因组 计 划 的完 成 及后 基 因组 计划 的 启 动 ， 异基 因表达就 成 了一 项热 门 的技 术 。由于分 差
工程疫 苗及 反 向遗 传疫苗 并存应 用 的局 面。
参 考文献 ：
［ ］ 丁壮 ， １ 金宁一 ， 王兴 龙 ， 鸡 新城疫病毒 Ｈ 等． Ｎ基因亚单 位疫苗
诱导免疫保护 的试验 研究 ［ ］ Ｊ ．动物 医学进 展 ，０ ２ ２ （ ） ２０ ，３ １ ：
４ —５ ． ９ １
清学 方法 无 法 区 别 是疫 苗 株 还 是 野 毒 株 感 染 所 致 。 因此通过 改变免疫 原蛋 白的某 些 中和表 位 ， 构建一 个 能用 合适 的血 清 学 方法 鉴 别 的疫 苗 是 十分 必 要 的 。 Ｐｅｅ ｅｔｓＢＰ等人 通过 反 向遗传 操作 构建 了 Ｎ Ｖ感 染 ｒ Ｄ
３ １ 卵内免疫 疫苗 ．
其 表达外 源基 因 ， 诱 发 对 载体 和表 达基 因的 免疫 。 来 葛金英 等人利 用反 向遗传 操作 技术 以 Ｎ Ｖ 的 ＬＳｔ Ｄ ａｏ ａ 疫 苗株 为载体 ， 入 Ｈ ＡＶ 的 Ｈ Ｎ 插 ＰＩ ５ １株 Ｈ Ａ基 因 ． 研
抑制性消减杂交技术的应用[1]
![抑制性消减杂交技术的应用[1]](https://img.taocdn.com/s3/m/a11ab97801f69e3143329423.png)
・技术与方法・生物技术通报B I O TECHNOLOGY BULL ET I N2009年第5期抑制性消减杂交技术的应用李小庆 景志忠(中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部兽医公共卫生重点实验室甘肃省动物寄生虫病重点实验室,兰州730046) 摘 要: 基因的差异表达是调控各种生命活动的核心分子机制,而分离、克隆并进一步研究差异表达基因已成为现代分子生物学研究的热点,也是功能基因组学研究的重要内容。
在研究差异表达基因的诸多项技术中,抑制性消减杂交(SSH )技术具有特异性强、假阳性率低、灵敏度高和快速简便等优点,被广泛地应用于生命科学和医学领域的基因差异表达的研究中。
近年来,抑制性消减杂交(SSH )技术得到了相应的改进和完善,而在许多研究领域,该技术在广度和深度上都有了一些新进展。
主要就抑制性消减杂交技术的产生背景、原理、技术流程、特点及其最新应用研究进展等方面作简要综述。
关键词: 抑制性消减杂交 差异表达 功能基因 DS N 均一化技术 c DNA 微阵列Suppressi on Subtracti ve Hybr i di zati on Techn i que andProgress i n the Appli cati onL i Xiaoqing Jing Zhizhong(Lanzhou Veterinary R esearch Institute CAAS,Key Laboratory of Ani m al Parasitology of Gansu P rovince,Key Laboratory of Veterinary PublicHealth of M inistry of Agriculture,S tate Key Laboratory of Veterinary E tiological B iology,Lanzhou 730046) Ab s trac t: D ifferential exp ressi on of genes is the centralmolecular mechanis m of regulating all kinds of life acti ons 1Among all thetechnol ogies of identifying differential exp ressed genes,supp ressi on subtractive hybridizati on (SSH )is considered t o be with high s peci 2ficity,l ow backgr ound,high sensitivity,convenient mani pulati on,and had been widely app lied in life science and medicine research fields 1I n this paper,the p rinci p le,method,characteristics and the research p r ogress of SSH technique were intr oduced 1Key wo rd s: Supp ressi on subtractive hybridizati on D ifferential exp ressi on Functi onal genes DS N (dup lex 2s pecific nuclease )2nor malizati on method c DNA m icr oarray收稿日期:2008211211基金项目:国家自然科学基金项目(30871884),国家高新技术“863”项目(2006AA10A203),甘肃省支撑计划项目(0804NKCA076)作者简介:李小庆(19832),男,硕士,专业方向:畜禽疫病的分子生物学与免疫学通讯作者:景志忠,博士,研究员,主要从事病原与宿主的分子生物学与免疫学研究;E 2mail:zhizhongj@yahoo 1com 1cn 上世纪90年代以来,随着分子生物学技术的快速发展以及多物种包括人类的基因组全序列测定计划的陆续完成,分子生物学的研究热点已经从结构基因组研究转向基因功能和表达调控的功能基因组研究,于是多种用于差异表达分析的基因克隆技术相继问世。
抑制性差减杂交技术_SSH_在植物学研究中的应用
抑制性差减杂交技术( SSH) 在植物学研究中的应用
阎爱华, 王冬梅
( 河北农业大学 生命科学学院, 河北 保定 071001)
摘要 : 抑制性差减杂交是一种基于转录水平的杂交技术, 能将差异表达 基因扩增 千倍后富集, 具有 高效、灵 敏、操 作简单, 假阳性率低等特点, 已经越来越多的被应用在植物学研究领域。就该 技术的原理、特点 及其在植物 学方面的 应用研究进展作一简要介绍。
DNA 微阵列技术 DNA microarray
巨克隆技术 M egaclone
将基因片段、寡聚核苷酸、cDNA 等固定 在硅质、塑料、玻 璃或尼龙膜 上, 用不 同组 织或 来源 的 mRNA 制 成探 针, 与芯片杂 交, 根 据信 号 查找 差 异 片段 并 进行 克 隆 和分 析。 cDNA 连上不 同的标签 ( tag ) , 与 带有 antitag 的 microbeads 杂交, 固定 cDNA, 并 且每 个 microbead 上 只与 一个 c。
基因差异表达分析方法
Methods of different gene expression techniques
基本原理
The basic principles of different gene expression techniques
优点 Advantage
缺点 Disadvantage
mRNA 差异显示 PCR mRNA differential display
收稿日期: 2008- 08- 11 基金项目: 国家自然科学基金资助项目( 30671244) ; 河北省应有基础研究计 划重点基础研究 项目资助( 08965505D) ; 河北省自然科 学基金
抑制性消减杂交技术介绍
M: ФX174-Hea Ⅲ消化。 1: 杂交骨骼肌肉tester二次PCR产物 2 : 未杂交的骨骼肌肉tester
18
G3PDH基因得到了极大的扣除
January 17, 2020
•
差异表达基因的富集与看家基因的扣除
以2ug/ml PHA和2ng/ml PMA处理72小时后的人类Jurkat T细胞的cDNA作 为Tester ，未处理的cDNA作为Driver。Tester cDNA、Driver cDNA及消减 后的cDNA扩增产物在1.5%的琼脂糖凝胶中进行电泳（每个孔上样量为 0.3ug）并转移到尼龙膜上，分别与已知活性的IL-2Rα基因和看家基因 G3PDH核酸探针进行杂交。
•
抑制后的应答基因 鉴定抗病毒相关基因 ......
6
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•
抑制性消减杂交实验方法
正向消减
Tester
处理组
反向消减 Driver
Driver
7
非处理组
Tester
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抑制性消减杂交
主要内容
1 抑制性差减杂交技术概 述
2 抑制性差减杂交原理
3 抑制性差减杂交流程
4
2
January 17, 2020
•
抑制差减杂交技术SSH
定义：抑制差减杂交（SSH）SSH 是一种基于抑制PCR和差减杂交 技术建立的,在转录水平上研究基 因表达的技术。
3
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12
A, B, C, D
A B C
E
末端补齐
D
EE
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•
实验流程
抑制性消减杂交技术(SSH)及其在烟草生物学研究中的应用
科学研究表明， 因的选择性差异表达决定植 基 物的生长 、发育、衰老、死亡 、对逆境 的适应等生 理过程 。分离差异表达基因对于了解和揭示植物体 的生长 、发育规律 ， 进而有针对性地对生物性状进 行改良具有重要意义。近年来随着 Ｐ Ｒ 技术 的兴 Ｃ 起， 出现了许多基于 Ｐ Ｒ的分离差别表达基因的新 Ｃ
由于速度快 、假阳性率低 、灵敏度高等优点 ，现 已 广泛应用于植物学研究 的各个领域【 ６ 】 。烟草是我 国
重要 的经济作物之一 ，面积 和总产量都 居世界第
一
。
与此 同时，它作为模式植物 ， 在植物学的研究
领域具有重要 的科研意义 ，尤其是在遗传 、繁育、
生理、 生化和转基 因等研究领域 。 笔者就 Ｓ Ｈ技术 Ｓ
Ｒｅ ｅ ｃ ｓ ａｒ ｈ
ＬＩＬｉ ｎ． ｑｉ ＬＵ ｍｉ Ｌｉ ｎｇ
（ ｒ ｎ ｍｙＣ ｌ ｇ ｆ ｉｈ ａ ｒ ｕｔｒｌ ｎ ｖ ｒ ｔ， ａ ａ ， ｉ ｕ ２ ０ ４ Ｃ ｉａ Ａｇｏ ｏ ｏｌ ｅ ｃ ｕ ｎ ｉ ｌ ａ Ｕ ｉｅｓ ｙ Ｙ ’ Ｓｃ ａ ６ ５ １ ， ｈｎ ） ｅ ｏＳ Ａｇ ｃ ｕ ｉ ｎ ｈｎ Ａｂ ｔａ ｔ Ａ ｎ ｗ ｍｅ ｏ ，ｅｍｅ ｐ ｒｓｉｎｓ ｂｒｃｉｅ ｙ ｒ ｉ ｔ ｎ（ Ｓ ， ａ ｅ ｎｄ ｖ ｌｐ ｄｂ ｓｄｐ ｍａ ｌ ｎｔｅ ｅ ｈ ｉｕ ｓ ｒ ｃ ： ｅ ｔ ｄ ｔｒ ｄｓ ｐ ｅ ｓ ｔ ｔ ｂ ｄｚ ｉ Ｓ Ｈ）ｈ ｓ ｅ ｅ ｅｏ ｅ ａ ｅ ｒ ｒ ｙｏ ｃ ｎｑ ｅ ｈ ｕ ｏ ｕ ａ ｖ ｈ ｉ ａｏ ｂ ｉ ｉ ｈ ｔ
Ｄ Ｉ ０ ９９ ．ｓ． ０—１９ ０１ ３ １ Ｏ ：１． ６￣ｉ ｎ ０７５ １． １． ． ９ ３ ｓ １ ２ ００
差减杂交的基本原理
抑制差减杂交(suppression subtractive hybridization，SSH)技术是1996 年Diatchenko 等人发明的一种快速分离两种材料中差异表达基因的强有力技术，是以抑制PCR(suppression PCR)和差减杂交技术为基础，将标准化检测子cDNA 单链步骤和差减步骤合为一体的技术。
在众多差别表达基因的筛选方法中，以较为简单，假阳性低等众多的优点脱颖而出，近年来该技术在植物，动物差异表达基因的筛选中得到了最为广泛的应用，受到越来越多的重视。
运用差减杂交的方法可以用来进行两种材料中差异表达基因的分析，用来克隆缺失或突变的基因，差减杂交尤其较适合运用在一些基因组信息较为不清楚的物种上，从而分离到一些未知功能的新基因。
因此差减杂交可以为我们进一步研究差异基因或寻找新的功能基因提供基础。
它的主要原理是首先将两个真核生物mRNA样本均转化为cDNA，我们将需要检测的物种cDNA 设为“tester”，将作为对照的物种cDNA 设定为称为“driver”，通过两轮杂交，将表达没有差异的基因消减下去，差异的基因被大量富集，然后经过两轮抑致性PCR将差异的基因扩增出来。
首先将待检测的样品(Tester)和对照样品(Driver)中的总RNA 提取出来，分离出mRNA，然后将分离出的Tester和Driver中的总的mRNA合成为cDNA。
再把由mRNA 逆转录来的检测子cDNA(Tester)和驱动子cDNA(Driver)分别用同一种识别四碱基序列的限制性内切酶RsaI 消化。
一般选用Rsa I 或HaeIII 两种限制性内切酶对cDNA进行酶切，产生大小适当的末端为平头的片段。
识别四碱基酶切位点的RsaI内切酶是最为常用的内切酶，因为RsaI 酶切识别位点在基因组中相对较少，酶切后产生的片段较大。
因而既减少了基因组cDNA的复杂性，又提高了每个基因的代表性，这样可以形成适当长度平末端的cDNA片段。
抑制差减杂交
抑制差减杂交（SSH）抑制差减杂交技术运用了杂交二级动力学原理,即高丰度的单链cDNA在退火时产生同源杂交的速度快于低丰度的单链cDNA,在试验组(tester)和驱动组(driver)的cDNA变性后再复性的过程中,原来在丰度上有差别的单链cDNA达到均一化。
同时,由于试验组的cDNA在进行杂交之前等分的两份加有不同的接头,因此杂交时将产生5种不同类型的分子a、b、c、d和e(图1),当采用与两个不同接头序列互补的引物进行PCR扩增时,只有目标序列得到有效扩增,非目标序列因两端存在反向重复序列,退火时易产生类似”锅柄”的结构,无法与引物配对,扩增受到抑制。
抑制差减杂交(SSH)技术的主要步骤有:(1)cDNA的合成与酶切;(2)试验组cDNA分成两份,并与两个不同的接头连接;(3)试验组(tester)的cDNA与过量的驱动组(driver)cDNA杂交;(4)选择性PCR扩增与接头相连的试验组cDNA分子;(5)克隆PCR产物,构建差减文库;(6)筛选文库SSH方法一般只用于两个样品的差异比较分析,样品间的差异不宜太大或太小,而对于多个样品则无能为力,这在很大程度上限制了它的应用。
提取tester RNA的时期非常关键,选择使用该方法时,首先要根据不同的研究目的确定取材的最佳时期,取材时期不当将会给试验带来意想不到的困难,或许只得到很少几个差减克隆或根本得不到克隆,或得到一些非目的克隆。
从技术本身讲,提取的tester RNA和driver RNA及从中分离的mRNA的质量、限制酶的酶切效率、接头的连接效率、第二次PCR产物的转化效率及差减克隆的筛选方法等关系着验的成败。
另外SSH所需的起始RNA量较大,一般为几微克,对于一些珍贵稀有的不易获得足够RNA的材料要慎重使用。
SSH方法在研究植物基因的差异表达方面已得到有效应用,该方法在应用范围和深度上可进一步拓宽和加深:(1)利用SSH方法研究生物(如细菌和真菌等)和非生物逆境(如干旱和寒冷等)对植物的影响及生物与寄主植物的互作时,可进一步提早取材时期(如逆境诱导后的6小时或更早)和缩短取材间隔,以获得植物差异表达基因的表达动态和进行有关转录因子等方面的研究,进而获得植物与逆境互作的关键点,更好地理解其互作机制,为从分子水平上定向培育抗旱、抗寒、抗病等作物提供更可靠的理论依据。
抑制差减杂交法_SSH_及其在植物中的应用
e)才得以指数扩增 ,而 c类因一端有接头 ,另一 端无接头 ,只能线性扩增 ,形成牢固的“锅 - 柄 ” 结构 ,不能有效扩增 。第二轮 PCR 实际上为巢 式 PCR ,极大地提高了扩增的特异性 ,使得差异 表达目的基因片段大量富集 。
3 SSH 的技术评价
3. 1 主要优点 (1)假阳性率较低 。 SSH方法采用加接头和
然后各自与过量的 D river cDNA 变性后退火杂 交 ,这时得到 4种产物 a, b, c和 d。这种不充分 杂交使单链 cDNA 分子在浓度上基本相同 ,同时 由于 Tester cDNA 与 D river cDNA 的序列相同片 段大都形成异源双链分子 c,使得差异表达基因 得到第一次富集 。然后混合两份杂交样品 ,同时 加入过量的新的变性 D river cDNA 进行第二次差 减杂交 ,这次杂交进一步富集了差异表达 cDNA , 并形成了两个 5’端分别接有不同接头的双链分 子 e。杂交完全后 ,补平末端 ,加入合适引物 (即 部分接头 1和接头 2的单链寡核苷酸片段 )进行 两轮 PCR扩增 。第一次 PCR 是基于抑制反应 , 只有两端连有不同接头的双链 cDNA 片段 (如
39
山西农业科学 2007年 35卷第 4期
玉米 、小麦 、马铃薯 、大豆 、辣椒 、胡萝卜 、大麦 、棉 花 、康乃馨 、拟南芥 、甘蔗 、甜菜 、人参 、芒果 、灌 木 、梭梭 、橡胶树等多种植物 。
目前 , SSH方法在植物上的应用主要包括两 个方面 :一方面涉及植物的生长发育及组织特异 性研 究 。如 刘 军 等 [ 6 ] 以 水 稻 茎 尖 分 生 组 织 ( SAM )为对照材料 ,幼穗分生组织 ( pb / sb)为试 验材料 ,进行抑制性差减杂交 ,分离得到了 40个 水稻幼穗分生组织中特异表达或表达增强候选 基因 ; Kim M 等 [ 7 ]通过此技术分离得到了辣椒素 的生物合成相关基因 ; Feng DR 等 [ 8 ]也对水稻茎 尖分生组织和开花分裂组织的差异表达进行了 筛选 ; Kloos DU 等 [ 9 ]对甜菜根中表达的基因进行 了分离和鉴定 ; 常青山等 [ 10 ]同样应用此技术对 矮败小麦花药中特异表达的基因进行了研究 ;罗 志勇等也进行了人参皂苷生物合成相关基因的 筛选和鉴定 [11 ] ; 张雷等应用此项技术分离了胡 萝卜体细胞胚根发育相关基因 [ 12 ]等 。
软腐病菌诱导的大白菜抑制差减杂交文库构建及分析
１１７条 长 度 大 于 １０ｂ 、 质 量较 好 的 Ｅ Ｔ 序 列 。利 用 Ｄ Ａ ｔｒ． 上 述 Ｅ Ｔ 进 行 聚 类 ，共 获取 ７ ３个非 冗余 ０ ０ ｐ Ｓｓ Ｎ ｓ ５０对 ａ Ｓｓ ５
第 ４ 卷 第 ７期 ｌ
２１ ０ ０年 ７月
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北
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Ｊ ｌ ０１ ｕｙ２ ０
软 腐 病 菌 诱ａ ｅ ｈ ｌ ｇ ｄ ｗｉ ｗｉｉ ａｒ ｔ ｖ ａ ｓ ｂ ｐ ｃ ｒ ｔ ｖ ｒ ｔ ｈ ａ ｌ ｔ ｇ ｆｓ ｆ ｏ ｉｅ ｓ ． ａ ｂ ｇｅｌ ｖ ｓｃ ａｌ ｅ ｅｎ ｅ ｔ Ｅｒ ｎａ ｃ ｏ ｏ ｏｒ ｕ ｓ ． ａ ｏ ｏ ｏ ａａ ｅ ｅ ｒ ｓ ａ ｅ ｏ ｏｔｒ ｔ ｓ ａ ｅ ｈ ｔ ｙ ｄ
关键 词 ：软 腐 病 ；抑 制 差 减 杂 交 ；表 达 序 列 标 签 ；大 白 菜 中图 分 类 号 ：￥ ３ ．；Ｑ ８ ６ ４１ ７ 文献标志码：Ａ 文 章 编 号 ： １０ — ３９ ２ １） ７ ０ ４ － ６ ０ ５ ９ ６ （０ Ｏ ０ － ０ ５ ０
Ｃｏ ｓ ｒ ｃ ｉｎ ａ ｄ ａ ａｙ ｉ ｏ ｎ ｔｕ ｔ ｎ ｎ ｌｓｓ ｆＳＳＨ ｌ ｒ ｒ ｆＣｈ ｎ ｓ ａ ｂ ｇ ｎ ｅ ｔ ｄ ｏ ｉ ａ ｙ ｏ ｉｅ ｅ ｃ ｂ ａ ｅ ｉｆ ｃ ｅ ｂ ｂ ｗｉ ｉ ａ ｏ ｏ ｏ ａ ｓ ｂ ｐ ａ ｏ ｏ ｏ ａ Ｑ ｈ ｐ ｇ ， Ａ Ｒ ｎ ｃｉ Ｃ Ｉ ｈｎ ｙ Ｅｒ ｎ ａ ｃ ｒ ｔ ｖ ｒ ｕ ｓ ．ｃ ｒ ｔ ｖ ｒ ／ ｕ Ｓ ｕｉ ’ Ｍ ｏｇ ａ ， Ｕ Ｃ ｏ ｇ ｎ一
抑制性消减杂交技术
抑制性消减杂交技术抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization, SSH)技术是一种鉴定、分离组织细胞中选择性表达基因的技术，其原理是以抑制性多聚酶链反应(PCR)反应为基础的cDNA 消减杂交技术。
通过合成两个不同的接头，连接于测试cDNA 片段的5’末端，达到选择性扩增差异性表达的cDNA 片段，抑制非目的cDNA的扩增。
该技术是Diatchenko 等1996年在抑制性PCR的基础上建立起来的cDNA消减杂交方法，它克服了DD法的假阳性较高和RDA法消减杂交轮次较多的缺点，十分适用于克隆分析造成某种特殊表型的目的基因及其功能。
抑制性消减杂交技术是一种以抑制性PCR 反应为基础，将标准化测试cDNA 单链步骤和消减杂交步骤合为一体的技术。
通过合成两个不同的接头，接于经限制性内切酶消化后的测试cDNA 片段的5’末端，将测试和驱动进行两轮杂交。
所谓抑制性PCR 是利用链内退火优于链间退火，使非目的序列片段两端的长反向重复序列在退火时产生“锅柄样”结构，无法与引物配对，从而选择性抑制非目的序列片段扩增。
抑制性消减杂交技术的基本实验过程如下。
首先，将要进行比较的两种组织或细胞来源的mRNA 样品反转录为cDNA，把含有目的基因的cDNA 称为测试(tester)，把参考cDNA 称为驱动(driver)，用同一种限制性内切酶Rsa I 切割，产生末端平头的片段，将测试cDNA 分为两份，每份连接不同的接头，即接头1(adaptor 1)和接头2(adaptor 2)。
接头为双链DNA 片段，且5’- 端均无磷酸基，这样保证只有接头中的长链可以与cDNA 的5’- 末端连接，两个接头含有可识别的序列. 接下来进行两次杂交。
第一次杂交每个测试里加入过量驱动，然后变性、退火，根据杂交动力学第二定律，即丰度越高的分子退火速度越快，因此测试cDNA与驱动cDNA相同片段大都形成异源双链分子，使得差异表达的单链分子得到富集。
抑制性消减杂交技术主要包括如下几个基本步骤
抑制性消减杂交技术主要包括如下几个基本步骤：（1）双链cDNA合成与酶切：分别提取待比较的两组细胞mRNA（实验方tester、驱赶方driver），利用随机引物反转录为双链cDNA后，用四碱基识别酶如Rsa I或HindⅢ切割成平均大小为600 bp左右的平端片段；该酶约在44=256 bp处就有一个切点，一分子而来的双链cDNA经该酶酶切后，可产生数个片段，每个片段一般＜600bp，可防止长链cDNA 片段所形成的复杂结构对有效消减杂交的干扰。
（2）两次消减杂交：将tester cDNA分为两组，分别于其5'端上接上两种不同的具有一段反向末端重复序列的寡聚核苷酸、去磷酸化接头（adaptor1, adaptor2），以利于随后的选择性扩增。
接头设计特点：①接头是由一长链（约40余个核苷酸）和一短链（约10余个核苷酸）组成的一端是平端的双链DNA片段，而且双链的5′均无磷酸基团，保证了接头以唯一方向与cDNA片段连接，即接头长链的3′端与cDNA双链5′端连接；②接头长链外侧（约20余个核苷酸）序列与第一次PCR引物序列相同，内侧序列与第二次PCR引物序列相同；③在接头上含有T7启动子序列，并且含有内切酶识别位点，为以后该片段插入克隆载体提供酶切位点。
两组tester cDNA样品分别与过量的driver cDNA进行第一次杂交，得到a、b、c、d四型分子，使原来丰度不同的单链cDNA得到大量富集，两组产物另加上新变性的drvier cDNA再次杂交，这样就产生了两个5'端有两个不同接头的e型分子，这种e型分子正是tester较driver特异表达cDNA，填平粘性末端。
第一次杂交中，将过量的driver cDNA分别加入两份tester cDNA中，变性后退火杂交。
第一次杂交后有4种产物a、b、c、d：a是单链tester cDNA；b是自身退火的tester cDNA 双链；c是tester和driver的异源双链；d是driver cDNA。
抑制消减杂交的原理及应用
人类染色体端粒DNA的荧光原位杂交
甘肃省肿瘤医院
抑制消减杂交的实验过程
1.探针的制备
探针是一段标记核酸序列，可与靶序列 互补形成杂交双链，通过检测杂交链信 号即可对靶序列DNA的存在及其分子大 小加以鉴别.
探针可以是克隆的，也可以是合成的。 用PCR扩增产物可制备探针。也可用提 纯的质粒进行标记制备探针
PCR-TOPO 载体(T载体的一种)
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抑制消减杂交的实验过程
※ TA克隆构建原理：
TA克隆系统由Invitrogen公司发展而来的商业性试剂盒，它用于PCR产 物的克隆和测序。其原理是利用Taq酶能够在PCR产物的3’末端加上一 个非模板依赖的A，而T载体是一种带有3’T突出端的载体，在连接酶 作用下，可以快速地、一步到位地把PCR产物直接插入到质粒载体的 多克隆位点（MCS）中。
大肠杆菌
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蓝白斑筛选示意图
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抑制消减杂交的实验过程
分子杂交
定义：确定单链核酸碱基序 列的技术。其基本原理是待 测单链核酸与已知序列的单 链核酸（叫做探针）间通过 碱基配对形成可检出的双螺 旋片段。这种技术可在DNA 与DNA，RNA与RNA，或 DNA与RNA之间进行，形成 DNA-DNA，RNA-RNA或 RNA-DNA等不同类型的杂 交分子。
PCR反应:杂交产物中两端连有不同接头的片段就是所寻找的差异表
达基因。经补平末端后进行巢式PCR扩增以获得所需要的差异表达基 因。
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抑制消减杂交的实验过程消减的克隆:经巢式PCR扩增得到所需要的差异表 达基因后，利用TA克隆法将 差异表达基因转化感受态大 肠杆菌，根据蓝白斑筛选原 理，筛选出转化成功的阳性 菌落。最后根据插入片段的 两端接头引物进行巢式PCR反 应对插入片段进行特异性扩 增。
黄鳝性腺抑制差减文库的构建和分析
中国水产科学 2011年1月, 18(1): 23-28 Journal of Fishery Sciences of China研究论文收稿日期: 2009-12-10; 修订日期: 2010-03-01. 基金项目: 上海市重点学科建设项目(S30701).作者简介: 曲宪成(1965–), 副教授，硕士生导师，主要从事水生动物生理研究. Tel: 021-********; E-mail: xcqu@DOI: 10.3724/SP.J.1118.2011.00023黄鳝性腺抑制差减文库的构建和分析曲宪成1, 尚晓莉1, 程翠1, 曲学伟2, 张勇1, 张开岳1, 蒋骄云11. 上海海洋大学 水产与生命学院, 上海 201306;2. 烟台市牟平区渔业技术服务中心, 山东 烟台 264100摘要: 应用抑制性差减杂交技术构建了黄鳝(Monopterus albus )IV 期卵巢和间期性腺的差减cDNA 文库。
正向差减杂交以间期性腺为试验方, IV 期卵巢为驱动方; 反向差减杂交以IV 期卵巢为试验方, 间期性腺为驱动方。
将获得的差减cDNA 片段连接质粒载体, 然后转化大肠杆菌DH5α, 最后获得的正、反向差减文库分别含461、678个重组子。
经PCR 扩增鉴定插入片段范围为200~2 000 bp 。
随机选取正、反文库共100个阳性克隆测序分析, 得到90个有效基因片段, 与GenBank 进行BLASTx 和BLASTn 同源比对。
进一步从文库中选取2个基因用于半定量RT-PCR, 对文库质量进行验证。
结果表明, 所建文库能够达到富集这两期性腺差异表达基因的目的。
黄鳝性腺差减文库的构建, 为进一步分离、鉴定黄鳝性腺发育和性逆转的相关基因奠定了基础。
[中国水产科学, 2011,18(1): 23–28] 关键词: 黄鳝; 性腺; 抑制性差减杂交; 差减cDNA 文库中图分类号: S917 文献标识码: A 文章编号: 1005–8737–(2011)01–0023–06黄鳝(Monopterus albus ), 俗称鳝鱼, 属于硬骨鱼纲、合鳃目、合鳃科、黄鳝属, 广泛存在于亚洲地区, 中国仅产1种。
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将RsaI酶切完全的cDNA用adapter1和adapter2R两 种接头连接。通过PCR扩增检测连接效率。 PCR的引物根据RsaI位点和adapter1、adapter2R 的序列设计。这一般要求扩增的片段中不含RsaI 位点序列。在扩增后琼脂糖胶电泳检测结果中, 如果用一个基因特异性引物和一个接头引物所得 到的带亮度与两个基因特异性引物所得到的带的 亮度一致,说明连接较好;如果用一个基因特异性 引物和一个接头引物所得到的带亮度只有两个基 因特异性引物所得到的带的亮度的25%,则说明连 接效率不到25%,应检查RsaI酶切效果并重新连接。
3 抑制差减杂交技术的优缺点
3.1 与其他几种方法相比,SSH技术具有较明显的优越性: (1)通过两步消减杂交和两次抑制PCR可DDRTPCR和cDNA-RDA法中,低丰度的 mRNA一般不易被检测到,SSH方法所做的均等化和目 标片段的富集,保证了低丰度mRNA 也可被检测出。 (3)速度快,效率高。一次SSH反应可 以同时分离几十或成百个差异表 达基因。
抑制差减杂交技术原理 及常见操作结果分析
摘要
抑制差减杂交 (SuppressionSubtractiveHybridization,SSH)是一种 高效鉴定和分离克隆差异表达基因的新技术。 目前,该技术在分子生物学研究的各个领域得 到了广泛的应用作了较全面的介绍,可为研究者们 提供参考。
2.4 第一次杂交、第二次杂交和PCR扩增
将经RsaI消化的drivercDNA和分别连接有adapter1、 adapter2R的testercDNA混合进行第一次杂交。再将第一次 杂交的两个样本混合在一起,同时加入新鲜的drivercDNA, 以进一步富集差异表达序列。在两端具不同接头的差异 表达的cDNA形成新的杂交分子。
先将差异表达的cDNA杂交分子的接头缺失部 分补平,进行第一轮扩增。在第一轮扩增中,仅具 有不同接头的双链cDNA分子能指数增长。接 着通过巢式PCR可进一步降低背景,且富集差异 表达的序列,不同丰度的差异表达的转录物也得 到了平衡化。通过电泳检测第二次PCR的效率。 未克隆净,则说明有DNA、蛋白质或 多糖污染,应进一步纯化。如果亮度呈:28s<18s<5s, 则说明RNA发生了降解。RNA的纯度还可以通过 分光光度计测定在26nm和28nm下的OD值来确定。 如果在260nm和280nm下的OD值之比为1.7～2.0,说 明RNA较纯;如果比值小于1.7～2.0,说明样品中有 蛋白质或多酚污染。 在分离mRNA之前,首先测定RNA在260nm下的 OD值,计算RNA的浓度。然后按Oligotex mRNAS pin-Column试剂盒从总RNA中分离mRNA。mRNA 分离出来后,与分离剩余物同时点样,进行1×TAE 琼脂糖胶电泳,可以见到:分离的mRNA在18s和28s 之间呈较亮的smear;而剩余物则表现为18s和28s两 条亮带。2.5 差减的构建与Tester特异序列的验证
将扩增的差减cDNA插入T/A克隆载体,用NotI位点(SmaI, XmaI)在接头1和EagI位点在接头2R处作位点特异性克隆,或 用RsaI位点在析和差异筛选来 验证PCR扩增,点膜,分别用标记的Tester和DrivecDNA作探针 进行点杂交。 凡只与TestercDNA有杂交信号而 与Driverc DNA无杂交的克隆,即为含 Test0%以上。
生物的生长、发育、代谢、繁殖和死亡等生命活动 都是由不同的基因表达来控制的,一般认为某一时期的表 达基因的数量约为全部基因的1.5%,所以基因的表达具有 时空性和组织特异性。研究基因的差异表达,可探究造成 生物细胞表型差异的遗传原因,提供研究复杂生命过程的 基本信息。 研究差异表达基因的方法很多,如组织或特异时期的 同工酶谱分析、差减杂交(subtractivehybridization, SH)、 mRNA差别显示法(differentialdisplay,DD)、代表性序列差 别分析(representationaldifferenceanalysis,RDA)和抑制差减 杂交技术(suppressionsubtractivehybridization,SSH)。 近年来,抑制差减杂交技术(SSH)以其高效便捷和低假 阳性的优越性受到广大研究人员的重视,已在分子生物学 的各个领域得到了广泛的应用。
2.2 cDNA的合成
cDNA两条链的合成用Clontech PCRSelectcDNASubtractionKit(试剂盒)来完成。
2.3 RsaI消化和adapter1、adapter2R的连接
用RsaI酶切合成的cDNA可产生短的双链平末端cDNA 片段。检测酶切效果。取0.2μg未经酶切的cDNA和5μl用 RsaI消化的cDNA进行琼脂糖胶电泳(1%),前者为接近点样 孔的高分子量带,后者为0.1～2kb之间的smear。如果用RsaI 消化后的cDNA未变小或仍大于2kb,说明酶切效率不高,可 能是cDNA中不含有RsaI的酶切位点或cDNA中混有酶的抑 制剂。可以考虑选择HaeIII或AluI或其他六碱基位点的酶。 如果是杂质污染,可以用氯仿/酚抽提纯化。
2 抑制差减杂交技术流程及常见操作结果分析 2.1 RNA的抽提和mRNA的分离纯化
对植物材料而言,RNA的抽提一般有两种方法,其一是 异硫氢酸胍法,其二是酚/SDS法。提取的RNA的质量, 可通过1×TAE琼脂糖胶电泳和分光光度计检测。对于 高质量的RNA,胶电泳呈三条带:28s、18s和5s,点样孔干 净,且三条带的亮度呈:28s>同来源组织的mRNA(tester和driver),反转录成 cDNA,用4碱基识别酶(RsaI)或HaeIII酶切两种cDNA产生平端片 段;将testerc DNA分成均等的两份,分别接上dapter1和adapter2两 种接头,并与过量的经RsaI消化的driver样本变性后退火杂交。 第一次杂交后有4种产物:a是单链testercDNA;b是自身退火的 testercDNA双链;c是tester和driver的异源双链;d是drivercDNA。 根据复性动力学原理,丰度高的单链cDNA退火时产生同源杂交 速度快于丰度低的单链cDNA,因此第一次杂交使得丰度有差别 的cDNA的单链分子的相对含量趋向一致。 混合两份杂交样品,同时加入新的变性driver cDNA 进行第二 次消减杂交。杂交完全后补平末端,加入合适引物(即adapter1和 adapter2的部分特异序列)进行PCR扩增,只有含不同接头的双链 DNA分子(e)才可进行指数扩增,扩增产物即为目的片段。利用 adapter上的酶切位点可进行克隆、测序等。
抑制差减杂交技术原理及 常见操作结果分析
3 .2抑制差减杂交技术的缺点 SSH也存在一定的缺点: 所得到的差异cDNA是限制消化的c而且对于组成型表达的目的基因筛选效果不好。
抑制差减杂交技术原理及 常见操作结果分析
1 抑制差减杂交技术原理
抑制差减杂交技术(SSH)是由 Diatchenko等建立的以抑制性PCR和 DNA差减杂交方法相结合的方法。其 依 据 的 主 要 技 术 有 两 点 : (1)消减杂交; (2)抑制PCR。 经抑制差减杂交后的cDNA群体不 仅富集了差异表达基因(目的基因),而 且目的基因间丰度的差异经过均等化 作用已基本消除,使消减后的cDNA群 体为丰度一致的目的基因群体。
巢式PCR:
巢式聚合酶链反应(nested polymearse chain reaction, nPCR)也称套式PCR。在这种技术中，首 先用一对外引物进行第1轮PCR，然后再使用第1 对引物扩增的DNA序列内部的一对引物再次扩 增，所以称为巢式PCR。由于使用了两对引物并 且进行了两轮扩增反应，因此试验的敏感性和特 异性均增强。在一定情况下，这种方法对减少 PCR后扩增产物的污染问题极为有用，但它增加 了每次试验的复杂性。为了经济节约，可在第2 轮扩增时采用半巢式，设计单条引物，另一条引 物与第1轮扩增共用，效果也优于单次扩增。一 般应用于动物方面。如：病毒，梅毒螺旋体， HIV，肿瘤基因等 。