细胞培养

2011年7月11日（以细胞换液为例子）

今天培养293细胞,培养前准备两个蓝盖瓶(200mL),1mL枪头一盒，并将蓝盖瓶和枪头高压灭菌后置于烘箱干燥。

取一双干净的手套专门用于细胞操作，将手套置于超净台中，并在超净台上放置蓝盖瓶、枪头、酒精棉球、移液器、垃圾存放盒。这些放入超净台后打开紫外灯照射30分钟左右，在这时可以将已经配好的培养基和PBS温浴30分钟。（买好的现成培养基可以直接在超净台中配好，在DMEM 中加入10%的血清，血清需要从-20度中取出解冻后使用，使用完毕后注意用封口膜封好血清管口，倒培养基的过程直接在超净台中进行，注意无菌操作！）

在实验室找一个塑料篮，在其中放入酒精喷壶、完全培养基、PBS液（如果细胞需要计数的话还可以带入计数板和刻度离心管）、所需规格的细胞培养皿将装好物品的塑料篮带入细胞间。

用酒精喷壶喷洒培养基和PBS瓶口处，然后放入超净台中（注意平放，防止液体与瓶口接触造成污染），并喷洒所带的手套。

取出超净台中的酒精棉球擦拭培养基、PBS瓶口，擦拭培养皿口，并擦拭超净台工作区。

从细胞培养箱中取出细胞，并在显微镜下观察细胞生长情况，然后将细胞带入工作间，注意按紧平皿。

细胞放在工作区中间位置，两只手的操作在其两侧不能在试剂瓶或者培养皿的上方活动。培养基、磷酸盐缓冲液、无菌培养皿、酒精棉球、血清管放在左手侧，细胞放在中间区域，垃圾存放盒、枪头、移液器放在右手侧。

将细胞培养皿微微背对自己打开，将枪头背对自己打开吸出其中原有的培养基，之后取一定量的磷酸盐缓冲液沿着培养皿壁打入培养皿中。注意：在取液体时枪头不要碰到试剂瓶，且移液器的其他部位也不要碰到试剂瓶，谨防试剂污染。磷酸盐缓冲液进入培养皿后缓慢转动培养皿以清洗细胞碎片和杂物，反复进行两遍或三遍。

枪头背对自己打开，吸取一定量的新鲜培养基沿着培养皿壁注入，盖好培养皿后取出，观察细胞情况后放入细胞培养箱中继续生长。

不同规格培养皿的倒液量（参考）：

10cm细胞培养皿中一般冲洗液加入2mL，培养基加入10mL

5cm细胞培养皿中一般冲洗液加入1mL，培养基加入5mL（实际操作时4毫升就可以了）2011年7月12日

今天独立地对昨天的293细胞换液,换液后细胞碎片少了,可是细胞却是扎堆在一起,可能要吹一下效果才比较好。

今天独自配制了1×PBS（8.0g氯化钠、0.2g氯化钾、0.24g磷酸二氢钾、1.44g磷酸氢二钠，加双蒸水至800毫升后调节pH值到7.2左右，再定容至1升），学习了pH计的使用方法，先校准后测量。

今天还看了马师兄配制DMEM培养基的过程，先将一袋DMEM粉倒入1000mL的烧杯中（烧杯先用洗涤剂洗，后用自来水冲刷几遍，再用单蒸水过一遍，最后用双蒸水过），然后向烧杯中称量放入3.7g碳酸氢钠，加入约900mLdd水后用浓盐酸调节pH到7.2，大约加入200uL浓盐酸，再定容至1L。配好后去已经放好手套、1L蓝盖瓶、高压过的过滤器、60mL注射器、酒精棉球、垃圾存放盒并紫外照的超净台中抽滤。烧杯进超净台之前需要用酒精棉球擦拭全身，然后放入超净台中开始抽滤，蓝盖瓶要注意防止污染。

2011年7月13日

今天上午对昨天换液的细胞(293)进行消化处理，处理前的准备和换液前的准备一样，首先取出培养基和磷酸盐缓冲液温浴，同时将移液器、枪头、手套、酒精棉球、垃圾存放盒以及从4度中取出的胰蛋白酶进行紫外照30分钟。

取一个塑料篮放入已经温浴的培养基和磷酸盐缓冲液、酒精喷壶进入超净台，进入超净台之前

注意无菌操作，进入超净台之后也要注意无菌操作。离开超净台，从二氧化碳培养箱中取出待消化的细胞，在倒置显微镜下观察细胞生长情况，细胞成纤维状，连接在一起，细胞密度较大，适合消化。

消化之前，首先移出原培养基，然后移取一定量的PBS清洗细胞，轻轻晃动接触细胞，接着移出PBS，直接冲着细胞（无需沿壁）加入1mL胰蛋白酶（无EDTA），轻轻晃动进行消化处理，当观察到细胞脱落（像头皮）说明细胞已被消化，我们也观察到这一现象，然后加入约4mL培养基终止胰蛋白酶的消化作用。培养基加入后要进行吹散处理，完全打开培养皿，注意不要在上方活动，然后画弧线吹落细胞，再在下方吹打细胞使其尽量分散开。结束后，盖上培养皿，十字混匀，观察消化效果后放回培养箱中。

细胞消化个人学习心得：

细胞消化的目的是为了使细胞分散，细胞在生长过程中会聚集在一起形成细胞间的相互作用，同时也为了使细胞暂时脱壁。

消化消化的前期准备工作都是一样的，温浴培养基和磷酸盐缓冲液，解冻胰蛋白酶；同时，相应物品紫外照射。

不同的细胞采取不同的消化方式：本实验中的293细胞属于容易消化的细胞，所以，用的胰酶是不含EDTA的，消化过程中会看到大片细胞脱落现象。取1mL胰酶直接注入培养皿中，上下晃动消化细胞，然后加入4mL完全培养基终止消化，用枪头画弧线上下左右冲刷细胞，时而在下端吹打细胞，使其分散开。消化结束后，可以将含有细胞的培养基转入一部分入新培养皿，对比两个皿中细胞的生长情况。

某些细胞难消化，需用含有EDTA的胰酶，如肝癌细胞、食管癌细胞等。对于这类细胞，取1mL胰酶（含EDTA），上下晃动，不能观察到大片细胞脱落，置于显微镜下观察，大部分没有消化，放入37度培养箱中约1min后取出观察，发现基本消化，再回到超净台中，加入约3mL培养基吹打细胞，分散细胞。后续操作如上。

细胞培养过程中，细胞如果正处于贴壁状态，在加液时注意沿壁注入；如果已经被消化或是吹散则直接注入即可。