黑曲霉的次级产物的提纯

淮北师范大学信息学院

07生物工程

实验课题：利用黑曲霉生产柠檬酸的

实验设计方案

设计成员：万纹纹王磊

陈晨夏柱宝

指导老师：高翔

利用黑曲霉生产柠檬酸的实验设计方案

实验步骤： 筛选 → 诱变 → 培养基条件 → 发酵→ 产品分离纯化 一、 菌种的筛选：

1、 土壤采样：

采样人： 万纹纹 王磊 陈晨 夏柱宝 采样时间：

采样地点： 环境条件：

用取样铲，将表层5cm 左右的浮土除去，取5～25cm 处的土样10～25g ，装入事先准备好的塑料袋内扎好。应在三处不同的地点进行采样，将采集好的样品带回实验室备用。

2、 倒平板： 将PDA 培养基加热融化，待冷却至55-60℃倒平板15皿。 PDA 培养基配方：

马铃薯 200g 蔗糖 20g 琼脂 20g 蒸馏水 1000ml PH 自然

3、 制备土壤稀释液：各称土样10g ，迅速倒入带玻璃珠的90mL 无菌水的三角瓶中(玻璃珠

用量以充满瓶底力最好)，振荡约20min ，使土样充分打散，用一支1ml 无菌吸管从中吸取1ml 土壤悬液加入盛有9ml 无菌水的大试管中充分混匀，然后在用无菌吸管从此试管中

吸取1ml 加入另一盛有9ml 无菌水的试管里，混合均匀，以此类推制成110-、210-、3

10-、410-、510-、610-不同稀释度的土壤溶液。

4、 涂布：将倒好平板的底面用记号笔标上4

10-、5

10-和6

10-三种稀释度，然后用无菌吸

管分别由4

10-、5

10-和6

10-三管土壤稀释液中各吸取0.1ml 对号放入已写好稀释度的平板中，用无菌玻璃涂棒在培养基表面轻轻地涂布均匀，室温静置5-10min ，使菌液吸附进培养基。

5、 培养： 将涂布好的平板倒置于35℃的培养箱中培养3-5d.

6、 挑菌落：黑曲霉形态特征：在固体培养基上，菌落由白色逐渐变至棕色。孢子区域为黑

色，菌落呈绒毛状，边缘不整齐，菌丝有隔膜和分枝，是多细胞的菌丝体，无色或有色，有足细胞，顶囊生成1层或2层小梗，小梗顶端产生一串串分生孢子。

用灭菌后的接种环在单个菌落上挑取少许要分离的细胞，接种到PDA 培养基的斜面上。置于35℃的培养箱中培养，待菌苔长出后观察其特征是否一致。

7、 划线分离： 用灭菌后的接种环挑取斜面培养基上的菌落在培养皿中划线。此步需要9

个培养皿。（注意：接种的过程最好在接种箱内进行。）将已划线的培养皿置于35℃的培养箱中培养3-5d 。观察菌落特征是否一致。

8、 镜检：在载玻片上加一滴乳酸石炭酸棉蓝染色液，用解剖针从霉菌菌落边缘挑取少量已

产孢子的霉菌菌丝，先置于50%乙醇中浸一下以洗去脱落的孢子，再放在载玻片上的染液中，用解剖针小心地将菌丝分散开。盖上盖玻片，置低倍镜下观察，必要时换高倍镜观察。检查是否为单一的微生物。若发现有杂菌，需要再一次进行分离、纯化，直到获得纯培养。（试剂：乳酸石炭酸棉蓝染色液；仪器用具：无菌吸管，载玻片，盖玻片，解剖针，镊子，50%乙醇及显微镜等）

9、 制备母斜面：用灭菌的接种环将三种划线平板中的纯种黑曲霉接种到斜面上，作为母斜

面，35℃培养，备用。

10、产酸能力的检测： 将培养基50ml 分装到250ml 三角瓶内，灭菌后接入斜面孢子2环，于30~33℃培养。旋转式摇床的转速为300r/min ，往复式摇床振幅6cm ，频率为120

次/min 。发酵4~6d ，取发酵液1ml ，用0.1mol/LNaOH 滴定其酸度，对产酸高者进一步纸层析或五溴丙酮法测定柠檬酸含量，将产柠檬酸高的菌株保藏下来。（要求对三个母斜面都进行检测。）

二、诱变育种：

1、菌悬液的制备

经过筛选的具有高产酸能力的斜面菌种培养3~4d 后，用生理盐水将孢子洗下，接到营养丰富的培养基中，振荡4~5h ，使孢子活化萌发，离心分离，用pH6.0的Tris 缓冲液或磷酸盐缓冲液对孢子洗涤1次。再以同样的缓冲液将孢子从离心管中洗出转到小三角瓶里，用玻璃珠振荡打散，使孢子成为单孢子，然后通过一层宣纸或脱脂棉过滤，制成单孢子悬浮液，并调整到孢子浓度为7

10个/ml 。

2、诱变处理

常用诱变剂及方法有γ射线、高温、亚硝基胍、紫外线、X 射线、快中子、亚硝基甲基脲和硫酸二乙酯等。（注意诱变剂的剂量、诱变处理的pH 、温度和时间）

将孢子悬浮液和亚硝基胍或其它诱变剂溶液按一定比例混合，在26~28℃下作用

2~3h ，分离离心，再反复用缓冲液或生理盐水洗孢子10次以上，最后用生理盐水恢复

到孢子悬浮液原体积。稀释4

10~5

10倍，取0.1ml 涂平板，按变色圈法挑选菌落。（或使用UV 照射，取5ml 孢子悬浮液置于直径6cm 的培养皿中，开盖照射，时间不少于10~20s ，也不长于10~20min ） 3、变异株的筛选

①、形态筛选：凡是小菌落、边缘整齐、孢子蕙大而稀疏、液体培养能形成菌球体、菌落颜色变浅者，极可能是高产菌株。

②、指示剂显色法：跟上述柠檬酸生产菌株的分离、筛选中的指示剂显色法相同。 ③、透明圈法：在培养剂中加3CaCO 2%，菌落形成后，产生的酸会与3CaCO 反应形成明显的透明圈，其中透明圈直径与菌落直径之比较大的菌株可能是高产菌株。 4、、产酸能力的检测： 将培养基50ml 分装到250ml 三角瓶内，灭菌后接入变异后的菌株2环，于30~33℃培养。旋转式摇床的转速为300r/min ，往复式摇床振幅6cm ，频率为120次/min 。发酵4~6d ，取发酵液1ml ，用0.1mol/LNaOH 滴定其酸度，对产酸大幅提高的变异菌种进行扩大培养。 5、突变菌株的保藏：

斜面传代法，将突变株接入斜面，在30℃下培养3~5d ，然后置于4~5℃冰箱中保藏，最长可保藏3~4个月。

三、 培养基条件：

本实验采用液体发酵培养，培养基配方如下：

土豆 200g （煮汁） 蔗糖 100g NH4NO3 2.0g KCI 0.15g