黑曲霉的次级产物的提纯
一株产酸黑曲霉的分离鉴定及其在盐碱土改良中的应用
一株产酸黑曲霉的分离鉴定及其在盐碱土改良中的应用产酸黑曲霉（Aspergillus niger）是一种常见的真菌，广泛分布于自然界中，生长在温暖潮湿的环境中，如土壤、水体、食物等。
该真菌具有很高的适应性和生物活性，在农业生产中具有重要的应用价值。
本文将介绍一种分离鉴定产酸黑曲霉的方法，并探讨其在盐碱土改良方面的应用。
一、分离鉴定产酸黑曲霉的方法1. 样品采集：选择土壤、水体、食物等环境中的样品作为分离产酸黑曲霉的原料。
在采集样品时应注意避免污染和气候条件。
样品应当尽快送到实验室进行处理。
2. 样品处理：将样品进行湿热处理，即将样品置于70℃的恒温水浴中加热30分钟，杀灭潜在的竞争菌。
3. 分离培养：将处理后的样品取少量接种于含有培养基的培养皿中，使其在恒温条件下孵育。
常用的培养基包括片状琼脂和液体培养基。
4. 筛选菌株：经过一段时间的培养后，将培养皿中生长出的真菌进行筛选。
产酸黑曲霉的特征为菌落呈黑色，有明显的酸性反应，可用酸碘溶液进行初步检测。
5. 培养条件优化：筛选出的产酸黑曲霉菌株进行后续培养、鉴定和分离，同时优化培养条件，如温度、湿度、pH值的控制，以获得最佳的生长效果。
6. 分离纯菌株：通过菌落摘取法分离得到纯菌株，并进行鉴定。
鉴定方法可通过形态学特征、生理生化特性和分子生物学等方法进行。
盐碱土壤是指土壤中盐分和碱分含量较高，pH值偏碱性的土壤。
盐碱土壤的存在会严重制约农作物的生长和发展，降低土壤肥力，影响农业生产。
而产酸黑曲霉具有分解有机物的能力和耐盐碱的特性，因此可以在盐碱土改良中发挥重要作用。
1. 有机物分解：产酸黑曲霉具有分解有机物的能力，可以促进盐碱土壤有机物的分解，提高土壤肥力和透气性。
通过将产酸黑曲霉添加到盐碱土中，分解土壤中的有机物，释放大量的二氧化碳和其他生物活性物质，改善土壤结构，提高土壤肥力。
2. 产酸黑曲霉促进矿质释放：产酸黑曲霉具有分解矿质的能力，能够分解土壤中的矿物质，释放出有益元素。
黑曲霉鉴定操作规程
黑曲霉鉴定操作规程黑曲霉（Aspergillus niger）是一种广泛存在于自然环境中的真菌，常见于土壤、植物和食物中。
它具有强大的分解能力，可以分解有机物质并产生许多有用的代谢产物。
然而，黑曲霉也是一种致病菌，特别是在患有免疫系统抑制的人群中。
因此，快速准确地进行黑曲霉的鉴定非常重要。
下面是黑曲霉鉴定的操作规程。
1. 样品准备- 从疑似受污染的土壤、食物或其他材料中采集样品，将样品放入密封的容器中。
注意避免任何可能的交叉污染。
- 将样品送至实验室进行进一步处理。
2. 样品处理- 将样品进行适当的粉碎或稀释。
对于固体样品，可以使用食品搅拌器或研钵进行粉碎。
对于液体样品，可以直接使用适当的稀释液进行稀释。
- 将样品制备成适当的稀释液，以便于后续的实验操作。
3. 培养基选择- 选择适当的培养基来培养黑曲霉。
黑曲霉常见于一般的富含碳水化合物和氮源的培养基，如马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）或麦芽提取物琼脂（MEA）。
也可以使用含有指示剂的培养基，如酚红琼脂葡萄糖培养基，以便于观察黑曲霉的生长情况。
4. 接种- 使用无菌技术将样品接种至培养基上。
可以使用无菌的棉签或针头，将样品均匀地涂抹在培养基表面上。
- 根据需要，可以在培养基上划出不同的区域，以便于对不同样品进行观察和比较。
5. 培养条件- 将培养皿或培养瓶密封并放置在适当的温度下培养。
黑曲霉通常在25-30摄氏度下生长最佳，但可以进行不同温度的培养来筛选黑曲霉菌株。
- 在培养过程中，注意观察并记录菌落形态、颜色和生长速度等特征。
6. 鉴定- 观察在培养基上生长的菌落形态，黑曲霉的菌落通常呈黑色，有时也可以呈灰色、绿色或棕色。
- 进一步进行显微镜观察，观察菌丝及分生孢子的形态和结构特征。
黑曲霉的菌丝通常呈无色，分生孢子呈黑色，形状多样，有时具有规律的排列方式。
7. 鉴定结果确认- 根据观察到的菌落特征和显微镜观察结果，结合已知的黑曲霉的形态特征进行鉴定。
黑曲霉β-甘露聚糖酶的纯化和活力测定试验指导
黑曲霉β-甘露聚糖酶的纯化和活力测定实验指导（综设实验）一．实验目的及要求1、掌握黑曲霉ASP.Niger的固体发酵工艺2、掌握粗酶浸提、硫酸铵分级沉淀的原理和操作3、掌握透析原理、脱盐及透析袋的处理方法和使用4、掌握β-甘露聚糖水解各种甘露聚糖之间β-糖苷键的机制和理论5、掌握以魔芋精粉为底物DNS光度法（3,5－二硝基水杨酸法）测定发酵制品中β-甘露聚糖酶活力的操作方法二．实验原理1、微生物的β-甘露聚糖酶都是诱导酶，只有在培养基中含有β-甘露聚糖时才进行β-甘露聚糖酶的合成，产酶最适培养基除需要一定的碳氮源，还加入一定诱导物魔芋粉。
2、硫酸铵分级沉淀（盐析）原理中性盐浓度增高到一定数值时，使水活度降低，进而导致蛋白质分子表面电荷逐渐被中和，水化层逐渐被破坏，最终引起蛋白质分子间相互聚集并从溶液中析出。
3、透析原理、脱盐：酸性β-甘露聚糖酶相对分子质量为39000和40000，选择MWCO（切割分子量或截留分子量）14000的透析袋，透过掉分子量小于10000的蛋白质；并借助分子扩散脱盐。
4、DNS光度法测定还原糖：β-甘露聚糖酶能水解含β-1，4甘露糖苷键的甘露多糖（包括甘露聚糖、半乳甘露聚糖、葡萄甘露聚糖等），以魔芋精粉为底物主要得到含还原性端基的甘露寡糖，还原性端基与DNS试剂共热后被还原生成氨基化合物。
在过量的NaOH碱性溶液中此化合物呈棕（桔）红色，在520nm波长处有最大吸收，在一定的浓度范围内，还原糖的量与光吸收值呈线性关系，利用比色法可测定样品中的含糖量，由此测定出酶的活力。
三．实验试剂和器材菌种：黑曲霉(Aspergillus niger)JXW12-1，生物工程发酵实验室保藏。
斜面培养基:马铃薯20.0%，蔗糖2.0%，琼脂 2.0%，pH自然，此培养基用于菌种保藏、斜面种子和平板分离。
二级种子培养基：250 mL三角瓶装麸皮10g，水12mL，121℃灭菌30 min；接种一菌耳斜面种子，32±1℃静置培养96h，其间翻曲2～3次。
黑曲霉液态发酵韭籽粕提取韭籽多肽工艺
关键 词 ： 韭 籽 多肽 ， 响应 面 法 ， 液态发酵 ， 抗 氧 Байду номын сангаас 活 性
Ｏｐｔ ｉ ｍｉ ｚ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｎ ｔ ｈｅ ｐ ｒ ｏ ｄｕ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ ｐｏ ｌ ｙ ｐｅ ｐ ｔ ｉ ｄ ｅ ｆ ｒ ｏ ｍ Ｃｈ ｉ ｎ ｅ ｓ ｅ ｌ ｅ ｅ ｋ ｓ ｅ ｅ ｄ ｍｅ ａ ｌ ｂ ｙ Ａｓ ｐｅ ｒ ｇ ｉ ｌ ｌ ｕ ｓ ｎ ｉ ｇｅ ｒ ｌ ｉ ｑ ｕｉ ｄ ｆ ｅ ｒ ｍｅ ｎｔ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ
在此条件 下 ， 每 毫升发酵液 中韭籽 多肽含量可达 ５ ７ ３ ． ５ ５ ｇ ／ ｍ Ｌ 。在 最佳工 艺条件下 ， 测定黑 曲霉液态发 酵制备得 到的 韭籽 多肽对 Ｄ Ｐ Ｐ Ｈ・ 的清除 能力以及 总还原力 ， 结果表 明采 用黑 曲霉液态发酵制备得到 的韭籽 多肽具有抗氧化 活性 ， 随 着韭籽 多肽浓度 的提 高 ， 抗氧化活性增强。
ｆ ｅ ｒ ｍ ｅ ｎ ｔ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｗ ｅ ｒ ｅ ｉ ｎ ｖ ｅ ｓ ｔ ｉ ｇ ａ ｔ ｅ ｄ ｕ ｓ ｉ ｎ ｇ ｔ ｈ ｅ ｒ ｅ ｓ ｐ ｏ ｎ ｓ ｅ ｓ ｕ ｒ ｆ ａ ｃ ｅ ｍｅ ｔ ｈ ｏ ｄ （ Ｒ Ｓ Ｍ） ａ ｎ ｄ ｔ ｈ ｅ ａ ｎ ｔ ｉ ｏ ｘ ｉ ｄ ａ ｎ ｔ ａ ｃ ｔ ｉ ｖ ｉ ｔ ｙ ｏ ｆ ｅ ｘ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ｗ ａ ｓ ｏ ｂ ｔ ａ ｉ ｎ ｅ ｄ
米渣黑曲霉发酵产物的分离
发酵产物的分离
超滤膜分离技术： 它能从周围含有微粒的介质中分离出10～100埃的微粒，这个尺寸范围 内的微粒，通常是指液体内的溶质。其基本原理是在常温下以一定压
力和流量，利用不对称微孔结构和半透膜介质，依靠膜两侧的压力差
作为推动力，以错流方式进行过滤，使溶剂及小分子物质通过，大分 子物质和微粒子如蛋白质、水溶性高聚物、细菌等被滤膜阻留，从而
得。从上述发酵液或培养液中分离、精制有关产品的过程称为下游加
工过程
下游加工技术流程图
发酵产物的分离
分离纯化工艺选择的依据：
1、起始物料的特点
2、物料中杂质的种类和性质 3、产物的分离特性
4、产品的质量要求
萃取；层析；电泳；离心；吸附；滤膜分离技术；……
米渣霉菌发酵
我国是稻谷的生产大国，年产量在2000亿公斤左右。我国的稻米除了供应 人们的日常粮食需求外，很大一部分低值大米被用作淀粉糖生产和工业 发酵，产生了大量的副产物。米渣是大米淀粉糖生产、有机酸发酵和味 精生产的副产物，蛋白质含量高达40%以上，是非常理想的蛋白质资源。 此外，米渣中还含有丰富的糊精和多聚糖，极有开发利用价值。这里以 米渣为原料，利用黑曲霉固态发酵，经超滤、凝胶层析和RP-HPLC进行 分离纯化，获得高抗氧化活性产物
米渣黑曲霉发酵产物的分离纯化
汇报人：伍辉祥 李 丹 付贝贝
1
发酵发酵工程概述 米渣的霉菌发酵 发酵产物的分离 膜分离技术
2
3
4
1、传统发酵工业（抗生素、乙醇、柠檬酸）中，发酵产物的分离精制部 分费用占到整个工厂投资费用的60％ 2、对重组DNA发酵、精制蛋白质的费用占整个生产费用的80~90％ 发酵产品通过微生物发酵过程、酶反应过程或动植物细胞大量培养获
黑曲霉产柠檬酸工艺条件的优化解析
生物与化学工程学院专业实验报告题目黑曲霉产柠檬酸发酵工艺条件的优化学生姓名：王一专业班级：生物工程2012010302班学号：1201815076课程名称：发酵生产技术综合实验指导教师：李信义日期：2013.6.2--2013.6.29黑曲霉发酵产柠檬酸工艺条件的优化[摘要]：柠檬酸是生物体主要代谢产物之一，在自然界中分布很广，主要存在于柠檬、柑橘、菠萝、梅、李、梨、桃、无花果等果实中，尤以未成熟者含量居多。
柠檬酸又名枸橼酸,分子式为C6H8O7,物理性质：无色透明或半透明晶体，或粒状、微粒状粉末，有强烈酸味，稍有涩味；极易溶于水，溶解度随温度的升高而增大。
化学性质：从结构上讲柠檬酸是一种三羧酸类化合物，加热至175°C时它会分解产生二氧化碳和水，剩余一些白色晶体。
柠檬酸是一种较强的有机酸，有3个H+ 可以电离；加热可以分解成多种产物，与酸、碱、甘油等发生反应。
同时柠檬酸，是重要的工业原料。
可从植物原料中提取，也可由糖进行发酵制得。
本实验研究了不同接种量、温度、PH、发酵有效体积、溶解氧对黑曲霉产柠檬酸发酵的效率，已选出最适宜黑曲霉发酵产酸的条件。
[关键词]：黑曲霉柠檬酸发酵条件优化[Abstract]：Citric acid is one of the main metabolites of the organism, is widely distributed in nature, mainly in lemon, orange, pineapple, peach, pear, plum, fig fruit, especially in the most immature content. citric acid or citric acid. Molecular formula is 786O H C ,physical properties: colorless transparent or translucent crystal, or granular, granular powder, although have strong sour, slightly astringent. Easily soluble in water, the solubility increases with the increasing of temperature. Chemical properties: citric acid from the structure is a kind of three carboxylic acid compounds, heated to 175°C it will decompose to produce carbon dioxide and water, the remaining number of white crystal. Citric acid is a strong organic acid, 3 H ionization; heating can be decomposed into a variety of products, reacts with the acid, alkali, glycerin etc..At the same time, citric acid, is an important industrial raw materials. It can be extracted from plant materials, can also be prepared by sugar fermentation. The experimental study of different inoculation quantity, temperature, PH, dissolved oxygen, fermentation volume on the efficiency of citric acid fermentation of Aspergillus niter, has to choose the most suitable fermentation conditions of Aspergillus niter.[Keywords]：Aspergillus niter Citric acid Fermentation Conditions Optimization目录1.综述 (1)2.实验仪器药品材料及分析方法 (1)2.1实验设备 (1)2.2实验试剂及材料 (1)2.3菌株 (1)2.4分析方法 (1)3.实验设计 (2)3.1培养基的制备 (2)3.2斜面种子和液体种子的制备 (2)3.3温度对柠檬酸发酵的影响 (2)3.4溶解氧对柠檬酸发酵的影响 (2)3.5接种量对产柠檬酸发酵的影响 (2)3.6发酵液有效体积对产柠檬酸发酵的影响 (3)3.7初始PH值对产柠檬酸发酵的影响 (3)3.8柠檬酸的测定 (3)4.结果与分析 (3)4.1不同初始PH的柠檬酸产率 (3)4.2不同接种量的柠檬酸产率 (4)4.3不同温度的产柠檬酸率 (5)4.4不同发酵液有效体积的产柠檬酸率 (6)4.5不同溶氧的产柠檬酸率 (7)4.6正交实验及结果 (7)5.结论与展望 (8)5.1结论 (8)5.2展望 (8)6.参考文献 (8)7.感受 (9)1.综述柠檬酸（citric acid）又名枸橼酸。
黑曲霉生产纤维素酶工艺设计
黑曲霉生产纤维素酶工艺设计1. 维素酶1.1 纤维素酶的组分纤维素酶是水解纤维素及其衍生物生成葡萄糖的一组酶的总称，是由多种水解酶组成的一个复杂酶系。
纤维素酶是起协同作用的多组分酶系，国内外多数根据纤维素酶的底物及作用的位点和释放的产物将其分为三类:（1）葡聚糖内切酶(endo-l，4-D-glueanase，EC3.2.1.4)来自真菌的简称EG，又称CMC一Na酶;来自细菌的简称Lne)。
这类酶不能水解结晶纤维素如棉花和微晶纤维素等，主要作用于纤维素内部的非结晶区和一些可溶性的底物如羧甲基纤维素和羟乙基纤维素，随机降解β-1，4糖苷键，将长链纤维素分子截短，产生大量带非还原性末端的小分子纤维素、纤维二糖和葡萄糖, 其分子量大小约23-146KD。
(2) 葡聚糖外切酶(exo-1，4-β-D-glucanase，来自真菌简称CBH;来自细菌简称Cex)。
作用于纤维素线状分子末端，分解1，4-β-D糖苷键，每次从底物的非还原端切下一个纤维二糖分子，故又称纤维二糖水解酶，可以水解无定形纤维素和微晶纤维素，对棉花有微弱的作用分子量约38-118KD。
(3)β-葡萄糖苷酶(β-D一glucosidase，简称BG)纤维素大分子首先在GE酶和CBH酶的作用下降解为纤维二糖，再由BG酶水解成二个葡萄糖分子。
其分子量约为76KD。
1.2纤维素酶的作用机制目前对纤维素酶的分子机制大致有3种假说:改进的Cl一Cx假说、顺序作用假说和竞争吸收模型。
它们都认为，纤维素酶降解纤维素时，先吸附到纤维素表面，然后其中的内切酶在葡聚糖链的随机位点水解底物产生寡聚糖，外切酶从葡聚糖链的还原或非还原端进行水解产生纤维二糖，β-葡萄糖苷酶水解纤维素二糖为葡萄糖。
在纤维素溶解糖化过程中内切酶和外切酶的比值会显著地影响纤维素溶解活力，而且在纤维素糖化过程中β-葡萄糖普酶组分的加入会使这种协同作用大大加强[1]，应该注意的是，这种协同作用不仅作用顺序不是绝对的，而且各酶的功能也不是简单、固定的。
黑曲霉菌实验报告
一、实验目的1. 学习并掌握黑曲霉菌的分离与鉴定方法；2. 了解黑曲霉菌的形态特征和生长习性；3. 掌握微生物实验的基本操作技能。
二、实验原理黑曲霉菌（Aspergillus niger）是一种广泛分布于自然界中的真菌，具有较强的发酵能力和酶活性。
本实验通过分离纯化黑曲霉菌，对其进行形态特征观察和生长条件研究，以了解其生物学特性。
三、实验材料1. 实验试剂：改良马丁培养基、葡萄糖酵母膏琼脂培养基、无菌水、无菌棉塞、无菌吸管、无菌培养皿等；2. 实验仪器：恒温培养箱、显微镜、酒精灯、接种环等；3. 实验样品：土壤、谷物、植物性产品等。
四、实验方法1. 样品处理（1）取适量样品（如土壤、谷物等）置于无菌培养皿中，加入适量无菌水，用玻璃棒充分搅拌，制成悬浮液；（2）取适量悬浮液，用无菌吸管吸取一定量的样品，涂布于改良马丁培养基上；（3）将涂布好的培养基置于恒温培养箱中，37℃培养24小时。
2. 分离纯化（1）观察培养基上生长的菌落，选取典型的黑曲霉菌菌落；（2）用接种环挑取菌落，分别接种于葡萄糖酵母膏琼脂培养基上；（3）将接种好的培养基置于恒温培养箱中，37℃培养24小时，观察菌落特征。
3. 形态观察（1）用显微镜观察菌落形态特征，包括菌丝、分生孢子梗、分生孢子等；（2）记录菌落颜色、形状、大小、菌丝特征等。
4. 生长条件研究（1）将分离得到的黑曲霉菌接种于葡萄糖酵母膏琼脂培养基上；（2）在不同温度、pH值、营养物质条件下，观察菌落生长情况；（3）记录菌落生长情况，分析生长条件对黑曲霉菌的影响。
五、实验结果与分析1. 分离纯化结果经过涂布培养和分离纯化，成功分离出黑曲霉菌。
菌落呈黑色，表面光滑，边缘整齐，具有明显的放射状沟纹。
2. 形态观察结果显微镜下观察，黑曲霉菌菌丝呈白色，具有分隔，分生孢子梗自菌丝顶端生出，呈直角或锐角，分生孢子球形，褐色。
3. 生长条件研究结果（1）温度：黑曲霉菌在25-37℃范围内生长良好，最适温度为37℃；（2）pH值：黑曲霉菌在pH值4.0-7.0范围内生长良好，最适pH值为6.0；（3）营养物质：黑曲霉菌在葡萄糖酵母膏琼脂培养基上生长良好，适宜的营养物质为葡萄糖、酵母膏。
黑曲霉的次级产物的提纯
淮北师范大学信息学院07生物工程实验课题：利用黑曲霉生产柠檬酸的实验设计方案设计成员：万纹纹王磊陈晨夏柱宝指导老师：高翔利用黑曲霉生产柠檬酸的实验设计方案实验步骤： 筛选 → 诱变 → 培养基条件 → 发酵→ 产品分离纯化 一、 菌种的筛选：1、 土壤采样：采样人： 万纹纹 王磊 陈晨 夏柱宝 采样时间：采样地点： 环境条件：用取样铲，将表层5cm 左右的浮土除去，取5～25cm 处的土样10～25g ，装入事先准备好的塑料袋内扎好。
应在三处不同的地点进行采样，将采集好的样品带回实验室备用。
2、 倒平板： 将PDA 培养基加热融化，待冷却至55-60℃倒平板15皿。
PDA 培养基配方：马铃薯 200g 蔗糖 20g 琼脂 20g 蒸馏水 1000ml PH 自然3、 制备土壤稀释液：各称土样10g ，迅速倒入带玻璃珠的90mL 无菌水的三角瓶中(玻璃珠用量以充满瓶底力最好)，振荡约20min ，使土样充分打散，用一支1ml 无菌吸管从中吸取1ml 土壤悬液加入盛有9ml 无菌水的大试管中充分混匀，然后在用无菌吸管从此试管中吸取1ml 加入另一盛有9ml 无菌水的试管里，混合均匀，以此类推制成110-、210-、310-、410-、510-、610-不同稀释度的土壤溶液。
4、 涂布：将倒好平板的底面用记号笔标上410-、510-和610-三种稀释度，然后用无菌吸管分别由410-、510-和610-三管土壤稀释液中各吸取0.1ml 对号放入已写好稀释度的平板中，用无菌玻璃涂棒在培养基表面轻轻地涂布均匀，室温静置5-10min ，使菌液吸附进培养基。
5、 培养： 将涂布好的平板倒置于35℃的培养箱中培养3-5d.6、 挑菌落：黑曲霉形态特征：在固体培养基上，菌落由白色逐渐变至棕色。
孢子区域为黑色，菌落呈绒毛状，边缘不整齐，菌丝有隔膜和分枝，是多细胞的菌丝体，无色或有色，有足细胞，顶囊生成1层或2层小梗，小梗顶端产生一串串分生孢子。
黑曲霉发酵提取柠檬酸
黑曲霉发酵提取柠檬酸实验一黑曲霉保藏菌的复苏实验目的：了解黑曲霉保藏菌的生长状况和保藏菌的活化处理过程。
实验原理：能够产生柠檬酸的微生物很多，青霉、毛霉、木霉、曲霉及葡萄孢霉中的一些菌株都能够利用淀粉质原料大量积累柠檬酸。
目前国内主要利用黑曲霉（Aspergillus niger）通过固体发酵或液体深层发酵生产柠檬酸。
发酵法生产柠檬酸的代谢途径被认为是微生物产生糖化霉首先将淀粉转变为葡萄糖，葡萄糖经过糖酵解途径（EMP）转变为丙酮酸氧化酶氧化生成乙酸和CO2，继而经乙酰磷酸形成乙酰辅酶A，然后在柠檬酸合成酶的作用下乙酰辅酶A和草酰乙酸合成为柠檬酸。
产生的柠檬酸经碳酸钙作用形成柠檬酸钙沉淀，再经稀硫酸作用释放出柠檬酸。
实验步骤：1、观察保藏菌的生长状况，记录PH2、黑曲霉复苏培养基的配制（1）、分别称取蔗糖30g，KNO3 1g, K2HPO4 1g, 麸皮10%，MgSO4.7H2O 0.5g, KCL 0.5g, FeSO4.7H2O 0.01g, 于500ml搪瓷缸中。
（2）、加蒸馏水100ml，调节pH至7.0-7.2（3）、牛皮纸包扎，灭菌3、保藏菌的活化扩增（1）配制5ºBe’麦芽琼脂培养基（2）20℃麦芽汁，糖度为5（3）加0.7%的琼脂（4）加热，使其沸腾（5）分装与试管中，每管约3ml（6）包扎灭菌，制成斜面培养基（7）在超净工作台上划菌，包扎（8）置于28~30℃培养箱中培养实验要求：分析复苏和保藏培养基的区别，原因，营养成分的差异和操作的目的和意义。
并加注参考文献。
实验二黑曲霉一级种子的制备实验目的：了解种子扩大培养的程序，比较复苏均至一级种子的生境变化。
实验原理：黑曲霉在生长过程中不仅需要有充足的营养成分，而且还需要一定的氧气环境等。
通过拌菌等增加菌种与培养基营养成分的充分接触，获得良好的生长。
实验步骤：1、观察活化的保藏菌生长状况，并记录。
2、在超净工作台上，将2-4管/组，活化的保藏菌分别加入约3mL双蒸水。
黑曲霉（AS0006）产纤维素酶的纯化研究
黑曲霉（AS0006）产纤维素酶的纯化研究张欢;曹焱鑫;蒋林;王晓明;刘齐;董晓莹;寇巍【摘要】Two endoglucanases(EG)components and a cellobiohydrolase(CBH)from Aspergillus niger AS0006 were separated and purified by(NH4)2SO4 fractional precipitation, Sephadex G-25 and Sephadex G-100 chromatography. According to cellulase activity and electrophoresis detection found that the molecular weight of two EG components were 29.63 kD and 37.49 kD, respectively, the molecular weight of CBH component was 56.51 kD. Compared to the crude enzyme, the recovery rate of EG components could reach 18.07%, the purification fold was 3.46, the recovery rate of CBH component could reach 12.96%, the purification fold was 4.14, the recovery rate ofβ-glucosidase(CB) could reach 22.37%and the purification fold was 3.58.%利用实验室中黑曲霉菌株AS0006进行粗酶发酵，对产出的纤维素酶液进行不同饱和度（NH4）2SO4的分级沉淀，经过Sephadex G-25、Sephadex G-100分离纯化后，得到两种内切酶（EG）组分、一种外切酶（CBH）组分。
黑曲霉的分离
黑曲霉的分离筛选一、实验简介黑曲霉广泛分布于世界各地的粮食、植物性产品和土壤中。
黑曲霉的最适温度为37℃，黑曲霉对营养要求较低,只要培养基中含有碳源、氮源及磷、钾、镁、硫等元素即能生长良好，实验中采用察氏培养基进行培养。
黑曲霉的菌落蔓延迅速，但生长稍局限，菌丝初为白色，后变成鲜黄色直至黑色厚绒状，背面无色或中央略带黄褐色。
顶部形成球形顶囊，其上全面覆盖一层梗基和一层小梗，小梗双层褐色，梗基较短，上长有成串褐黑色的球状分生孢子。
孢子直径2.5～4.0μm。
分生孢子头球状，直径700～800μm，褐黑色。
黑曲霉的个体形态和菌落形态都比较特殊，容易分辨，可利用平板划线法或稀释涂布法，得到单菌落，并结合显微镜检测，多步鉴定、纯化，得到的纯的菌种。
二、实验试剂与材料1、材料：黑曲霉孢子悬浮液2、溶液和试剂：硝酸钠、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钾、硫酸亚铁、蔗糖、琼脂、1mol/L氢氧化钠溶液、1mol/L氯化氢溶液、75%乙醇、乙醇乙醚混合液、溴甲酚绿、水。
3、器材和其他用品：三角瓶、试管、搪瓷杯、培养皿、接种环、酒精灯、高压蒸汽灭菌锅、试管架、载玻片、盖玻片、光学显微镜、恒温培养箱、纱布、牛皮纸、滤纸、pH试纸、擦镜纸。
三、实验步骤和过程1、无菌器材及无菌水的准备1.1 培养皿：洗净的培养皿烘干后，每组将5套培养皿叠在一起，用报纸卷成一筒，然后进行灭菌。
注意，一定要卷紧。
1.2 试管：做合适的棉塞，每组捆扎5支试管，用报纸包在一起后，用线绳扎紧，扎成活结，另一头再用皮筋扎好，然后进行灭菌。
1.3 三角瓶：在三角瓶瓶口塞一八层纱布，盖上牛皮纸，用线绳扎成活结，然后进行灭菌。
注意，装入的培养基不超过三角瓶的1/2。
上述物品均要用记号笔注明班级、组别、日期。
1.4 高压蒸汽灭菌2、查氏培养基的配制称量→熔化→定容→调pH→分装→加塞→包扎标记→灭菌→搁置斜面与倒平板→无菌检查培养基配方：硝酸钠3g 磷酸氢二钾1g 硫酸镁（MgSO4·H2O）0.5g 氯化钾0.5g硫酸亚铁0.01g 蔗糖30g 琼脂20g 蒸馏水1000ml pH5.0-6.0 2.1 称量：按照培养基配方，依次准确地称取药品，放入搪瓷杯中。
一株产酸黑曲霉的分离鉴定及其在盐碱土改良中的应用
一株产酸黑曲霉的分离鉴定及其在盐碱土改良中的应用一、引言盐碱土是指土壤中盐分过高或者碱性过强的土壤。
盐碱化是农业土壤环境中的一个严重问题，它严重影响着土壤中作物的生长和发育。
盐碱土的改良和治理一直是农业领域的一项重要任务。
而微生物在盐碱土改良中扮演着非常重要的角色。
黑曲霉是一种重要的微生物，它在盐碱土改良中有着很大的应用潜力。
二、黑曲霉的产酸特性黑曲霉（Aspergillus niger）是一种广泛分布的真菌，可以在自然界中容易地找到。
黑曲霉在生长过程中会分泌大量的有机酸，包括柠檬酸、枸橼酸和琥珀酸等。
这些有机酸可以降低土壤的pH值，减轻土壤的碱性。
黑曲霉在盐碱土改良中有着巨大的潜力。
三、分离鉴定一株产酸黑曲霉1. 样品采集从自然环境中采集土壤样品，选择盐碱土较重的地方进行采集。
2. 分离黑曲霉将土壤样品稀释后涂布在含有黑曲霉所需营养物质的琼脂培养基上，利用平板法分离黑曲霉，并进行单菌落的提取。
3. 鉴定黑曲霉通过形态学观察和生物学特性分析，对所分离得到的黑曲霉进行鉴定，确认其为产酸黑曲霉。
四、黑曲霉在盐碱土改良中的应用1. 产酸特性产酸黑曲霉可以分泌大量的有机酸，特别是柠檬酸和枸橼酸。
这些有机酸可以降低土壤的pH值，减轻土壤的碱性，从而改善盐碱土的生长条件。
柠檬酸还可以与土壤中的钙离子结合，使得土壤中的可交换性钙减少，从而减轻土壤的盐碱性。
2. 有机物质分解产酸黑曲霉可以分解土壤中的有机物质，将有机物质转化为植物可利用的养分，提高土壤的肥力。
3. 抗逆性产酸黑曲霉具有良好的抗逆性，能够在高盐或者高碱环境中生长，使得其在盐碱土改良中具有很高的适用性。
五、产酸黑曲霉在盐碱土改良中的应用案例在田间试验中，我们将产酸黑曲霉应用于盐碱土改良中，取得了良好的效果。
经过一段时间的处理，盐碱土的pH值明显下降，土壤的碱性得到了有效的改良。
土壤中的钙离子含量下降，土壤的盐碱性也得到了有效的缓解。
作物在改良后的土壤中生长良好，产量明显提高。
黑曲霉_葡萄糖甘酶的提纯与性质
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2期
宛晓春等 :黑曲霉ρ- 葡萄糖甘酶的提纯与性质
157
表 2 黑曲霉 M83 - 3325β- 葡萄糖苷酶氨基酸组成 Table 2 The Amino acid composition ofβ- glucosidases from A . niger and almond
β- 葡萄糖苷酶 ( EC. 3. 2. 1. 21) 能水解纤维二糖 ,也能水解生物体内的β- 葡萄糖苷 , 因而有重要的价值 。近年来有关水果[1～4 ] ,茶叶[5 ]中香气物质的研究表明 :香气物质 ,特 别是萜烯醇类除了游离的挥发性部分外 ,还大量以无香味非挥发性的香气物前体 ———糖 苷的形式存在 ,这些潜在的香气物质在水果 、茶叶的成熟和加工过程被β葡萄糖苷酶水解 而释放出来 。笔者筛选产β- 葡萄糖苷酶的一黑曲霉菌株 ,对该酶进行分离纯化 ,获电泳 纯酶 ,并对酶的一些性质进行了研究 。
图 2 Sephadex G - 100 凝胶色谱图 Fig. 2 Gel filtration ofβ- glucosidase on
Sephadex G - 100 - - - - - 蛋白质 Proteins ; ———β- 葡萄糖苷酶活
β- glucosidase activit y.
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1 材料和方法
1. 1 菌种 产酶菌种黑曲霉 Aspergill us niger v. Tiegh. 为实验室选育[6 ] 。 1. 2 主要化学试剂 Sephadex G - 25 , G - 100 , DEA E - Sephadex A - 50 , 均为 Pharmacia 公司产品 。三羟基氨基甲烷 ( Tris) 为 Merck 公司产品 。胃蛋白酶 、β- 葡萄糖苷酶 、过氧化氢酶及对硝基苯酚 - β- 葡萄糖苷 (pN P G) 均为 Sigma 公司产品 。低分子量标准蛋白 (用于 SDS - 凝胶电泳) 为上海生化所东风生化试剂厂产品 。 1. 3 方法 1. 3. 1 菌的发酵培养见前文[6 ] ,发酵液经离心抽滤 ,得粗酶液 ,用于酶的分离纯化 。 1. 3. 2 酶活力测定 :见前文[6 ] 。 1. 3. 3 蛋白质测定接 Lowry[7 ]的方法进行 。 1. 3. 4 盐析 :在搅拌条件下 ,缓慢地向粗酶液中加入 (N H4) 2 SO4 粉末至 35 %饱和度 ,静置过夜 ,离心分 离 (4000r/ min , 30min) ,弃去上清液 ,收集沉淀 。 1. 3. 5 脱盐 :将盐析收集的沉淀用少量 0. 05mol/ L Tris - HCl 缓冲液 (0. 1mol/ L 的 NaCl) 溶解 ,酶液上
制备黑曲霉的方法
制备黑曲霉的方法黑曲霉（Aspergillus niger）是一种广泛存在于自然环境中的真菌，常见于土壤、植物、食品和动物体内。
黑曲霉具有广泛的应用价值，可用于制备食品添加剂、生物染料和酶等。
下面将介绍制备黑曲霉的方法。
1. 选择培养基：制备黑曲霉所需的培养基主要包括碳源、氮源和微量元素。
常用的碳源有葡萄糖、麦芽糖和淀粉等；氮源可以选择硝酸盐、氨基酸或蛋白质等；微量元素可以通过添加硫酸铜、硫酸锰和硫酸锌等来满足黑曲霉的生长需求。
2. 准备培养基：按照一定比例将碳源、氮源和微量元素溶解于蒸馏水中，加热至沸腾，搅拌均匀后倒入培养瓶中。
然后对培养基进行无菌处理，可以通过高温高压灭菌或使用无菌过滤器进行过滤处理。
3. 接种黑曲霉：将培养基冷却至适宜的温度（通常为25-30摄氏度），然后将黑曲霉菌种接种于培养基上。
接种时要注意使用无菌技术，避免其他微生物的污染。
4. 培养条件控制：黑曲霉的生长需要一定的温度、湿度和光照条件。
通常情况下，将接种好的培养基置于恒温培养箱中，温度控制在25-30摄氏度，湿度保持在适宜的水分含量，光照可以选择暗培养或光照弱的条件下进行。
5. 培养时间：黑曲霉的培养时间因实验目的而异。
一般情况下，培养时间可控制在3-7天左右。
在培养过程中，可以通过观察菌丝的生长情况和菌落的颜色变化来判断黑曲霉的生长情况。
6. 收获黑曲霉：当黑曲霉菌丝覆盖整个培养基表面，并且菌落呈现出典型的黑色时，即可收获黑曲霉。
收获时要注意使用无菌操作，避免其他微生物的污染。
7. 保存黑曲霉：收获后的黑曲霉可以通过冷冻保存或制备菌种保存。
冷冻保存时，将黑曲霉菌丝切碎后置于液氮中冷冻保存；制备菌种保存时，将黑曲霉菌丝接种于琼脂平板上，培养后保存在低温条件下。
通过以上方法，我们可以成功制备黑曲霉。
制备过程中需要注意无菌操作，避免其他微生物的污染。
在培养过程中，控制好温度、湿度和光照等条件也是十分重要的。
制备好的黑曲霉可以应用于食品工业、生物工程和科研领域，具有广泛的应用前景。
c27黑曲霉培养及分离纯化
jjjjdj 黑曲霉的分离筛选一、实验简介黑曲霉广泛分布于世界各地的粮食、植物性产品和土壤中。
黑曲霉的最适温度为37℃，黑曲霉对营养要求较低,只要培养基中含有碳源、氮源及磷、钾、镁、硫等元素即能生长良好，实验中采用察氏培养基进行培养。
黑曲霉的菌落蔓延迅速，但生长稍局限，菌丝初为白色，后变成鲜黄色直至黑色厚绒状，背面无色或中央略带黄褐色。
顶部形成球形顶囊，其上全面覆盖一层梗基和一层小梗，小梗双层褐色，梗基较短，上长有成串褐黑色的球状分生孢子。
孢子直径2.5～4.0μm。
分生孢子头球状，直径700～800μm，褐黑色。
黑曲霉的个体形态和菌落形态都比较特殊，容易分辨，可利用平板划线法或稀释涂布法，得到单菌落，并结合显微镜检测，多步鉴定、纯化，得到的纯的菌种。
二、实验试剂与材料1、材料：黑曲霉孢子悬浮液2、溶液和试剂：硝酸钠、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钾、硫酸亚铁、蔗糖、琼脂、1mol/L氢氧化钠溶液、1mol/L氯化氢溶液、75%乙醇、乙醇乙醚混合液、溴甲酚绿、水。
3、器材和其他用品：三角瓶、试管、搪瓷杯、培养皿、接种环、酒精灯、高压蒸汽灭菌锅、试管架、载玻片、盖玻片、光学显微镜、恒温培养箱、纱布、牛皮纸、滤纸、pH试纸、擦镜纸。
三、实验步骤和过程1、无菌器材及无菌水的准备1.1 培养皿：洗净的培养皿烘干后，每组将5套培养皿叠在一起，用报纸卷成一筒，然后进行灭菌。
注意，一定要卷紧。
1.2 试管：做合适的棉塞，每组捆扎5支试管，用报纸包在一起后，用线绳扎紧，扎成活结，另一头再用皮筋扎好，然后进行灭菌。
1.3 三角瓶：在三角瓶瓶口塞一八层纱布，盖上牛皮纸，用线绳扎成活结，然后进行灭菌。
注意，装入的培养基不超过三角瓶的1/2。
上述物品均要用记号笔注明班级、组别、日期。
1.4 高压蒸汽灭菌2、查氏培养基的配制称量→熔化→定容→调pH→分装→加塞→包扎标记→灭菌→搁置斜面与倒平板→无菌检查培养基配方：硝酸钠 3g 磷酸氢二钾 1g 硫酸镁（MgSO4·H2O）0.5g 氯化钾 0.5g硫酸亚铁 0.01g 蔗糖 30g 琼脂 20g 蒸馏水 1000ml pH5.0-6.02.1 称量：按照培养基配方，依次准确地称取药品，放入搪瓷杯中。
黑曲霉ρ-葡萄糖甘酶的提纯与性质
黑曲霉ρ-葡萄糖甘酶的提纯与性质
宛晓春;汤坚;丁霄霖
【期刊名称】《菌物系统》
【年(卷),期】1998(17)2
【摘要】从黑曲霉Ａｓｐｅｒｇｉｌｕｓｎｉｇｅｒ发酵液中分离提纯了β－葡萄糖苷酶。
提纯步骤通过（ＮＨ４）２ＳＯ４分级沉淀，ＤＥＡＥ－ＳｅｐｈａｄｅｘＡ－５０和ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－１００等三步纯化，得到凝胶电泳均一的β－葡萄糖苷酶。
该酶的最适ｐＨ４．５，最适温度６０℃，Ｋｍ为０．４４（ＮＰＧ），并有较好的热稳定性。
【总页数】6页(P154-159)
【关键词】黑曲霉;β-葡萄糖苷酶;提纯;性质
【作者】宛晓春;汤坚;丁霄霖
【作者单位】安徽农业大学轻工业学院;无锡轻工大学
【正文语种】中文
【中图分类】Q949.327.1
【相关文献】
1.黑曲霉突变株分解生淀粉的葡萄糖淀粉酶的提纯及其… [J], 管汉成;严自正
2.黑曲霉β—葡萄糖苷酶的提纯与性质 [J], 宛晓春;汤坚
3.葡萄糖氧化酶在无孢黑曲霉中的重组表达及酶学性质 [J], 林晓彤;潘力;罗时渝;王斌
4.黑曲霉β-葡萄糖苷酶的分离纯化及酶学性质研究 [J], 郭金玲;陈程鹏;周一郎;陈红吉;吕育财;任立伟;龚大春
5.黑曲霉胞内β-葡萄糖苷酶分离提纯及其性质的研究 [J], 赵林果;夏文静;游丽金;王平;余世袁
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淮北师范大学信息学院07生物工程实验课题：利用黑曲霉生产柠檬酸的实验设计方案设计成员：万纹纹王磊陈晨夏柱宝指导老师：高翔利用黑曲霉生产柠檬酸的实验设计方案实验步骤： 筛选 → 诱变 → 培养基条件 → 发酵→ 产品分离纯化 一、 菌种的筛选：1、 土壤采样：采样人： 万纹纹 王磊 陈晨 夏柱宝 采样时间：采样地点： 环境条件：用取样铲，将表层5cm 左右的浮土除去，取5～25cm 处的土样10～25g ，装入事先准备好的塑料袋内扎好。
应在三处不同的地点进行采样，将采集好的样品带回实验室备用。
2、 倒平板： 将PDA 培养基加热融化，待冷却至55-60℃倒平板15皿。
PDA 培养基配方：马铃薯 200g 蔗糖 20g 琼脂 20g 蒸馏水 1000ml PH 自然3、 制备土壤稀释液：各称土样10g ，迅速倒入带玻璃珠的90mL 无菌水的三角瓶中(玻璃珠用量以充满瓶底力最好)，振荡约20min ，使土样充分打散，用一支1ml 无菌吸管从中吸取1ml 土壤悬液加入盛有9ml 无菌水的大试管中充分混匀，然后在用无菌吸管从此试管中吸取1ml 加入另一盛有9ml 无菌水的试管里，混合均匀，以此类推制成110-、210-、310-、410-、510-、610-不同稀释度的土壤溶液。
4、 涂布：将倒好平板的底面用记号笔标上410-、510-和610-三种稀释度，然后用无菌吸管分别由410-、510-和610-三管土壤稀释液中各吸取0.1ml 对号放入已写好稀释度的平板中，用无菌玻璃涂棒在培养基表面轻轻地涂布均匀，室温静置5-10min ，使菌液吸附进培养基。
5、 培养： 将涂布好的平板倒置于35℃的培养箱中培养3-5d.6、 挑菌落：黑曲霉形态特征：在固体培养基上，菌落由白色逐渐变至棕色。
孢子区域为黑色，菌落呈绒毛状，边缘不整齐，菌丝有隔膜和分枝，是多细胞的菌丝体，无色或有色，有足细胞，顶囊生成1层或2层小梗，小梗顶端产生一串串分生孢子。
用灭菌后的接种环在单个菌落上挑取少许要分离的细胞，接种到PDA 培养基的斜面上。
置于35℃的培养箱中培养，待菌苔长出后观察其特征是否一致。
7、 划线分离： 用灭菌后的接种环挑取斜面培养基上的菌落在培养皿中划线。
此步需要9个培养皿。
（注意：接种的过程最好在接种箱内进行。
）将已划线的培养皿置于35℃的培养箱中培养3-5d 。
观察菌落特征是否一致。
8、 镜检：在载玻片上加一滴乳酸石炭酸棉蓝染色液，用解剖针从霉菌菌落边缘挑取少量已产孢子的霉菌菌丝，先置于50%乙醇中浸一下以洗去脱落的孢子，再放在载玻片上的染液中，用解剖针小心地将菌丝分散开。
盖上盖玻片，置低倍镜下观察，必要时换高倍镜观察。
检查是否为单一的微生物。
若发现有杂菌，需要再一次进行分离、纯化，直到获得纯培养。
（试剂：乳酸石炭酸棉蓝染色液；仪器用具：无菌吸管，载玻片，盖玻片，解剖针，镊子，50%乙醇及显微镜等）9、 制备母斜面：用灭菌的接种环将三种划线平板中的纯种黑曲霉接种到斜面上，作为母斜面，35℃培养，备用。
10、产酸能力的检测： 将培养基50ml 分装到250ml 三角瓶内，灭菌后接入斜面孢子2环，于30~33℃培养。
旋转式摇床的转速为300r/min ，往复式摇床振幅6cm ，频率为120次/min 。
发酵4~6d ，取发酵液1ml ，用0.1mol/LNaOH 滴定其酸度，对产酸高者进一步纸层析或五溴丙酮法测定柠檬酸含量，将产柠檬酸高的菌株保藏下来。
（要求对三个母斜面都进行检测。
）二、诱变育种：1、菌悬液的制备经过筛选的具有高产酸能力的斜面菌种培养3~4d 后，用生理盐水将孢子洗下，接到营养丰富的培养基中，振荡4~5h ，使孢子活化萌发，离心分离，用pH6.0的Tris 缓冲液或磷酸盐缓冲液对孢子洗涤1次。
再以同样的缓冲液将孢子从离心管中洗出转到小三角瓶里，用玻璃珠振荡打散，使孢子成为单孢子，然后通过一层宣纸或脱脂棉过滤，制成单孢子悬浮液，并调整到孢子浓度为710个/ml 。
2、诱变处理常用诱变剂及方法有γ射线、高温、亚硝基胍、紫外线、X 射线、快中子、亚硝基甲基脲和硫酸二乙酯等。
（注意诱变剂的剂量、诱变处理的pH 、温度和时间）将孢子悬浮液和亚硝基胍或其它诱变剂溶液按一定比例混合，在26~28℃下作用2~3h ，分离离心，再反复用缓冲液或生理盐水洗孢子10次以上，最后用生理盐水恢复到孢子悬浮液原体积。
稀释410~510倍，取0.1ml 涂平板，按变色圈法挑选菌落。
（或使用UV 照射，取5ml 孢子悬浮液置于直径6cm 的培养皿中，开盖照射，时间不少于10~20s ，也不长于10~20min ） 3、变异株的筛选①、形态筛选：凡是小菌落、边缘整齐、孢子蕙大而稀疏、液体培养能形成菌球体、菌落颜色变浅者，极可能是高产菌株。
②、指示剂显色法：跟上述柠檬酸生产菌株的分离、筛选中的指示剂显色法相同。
③、透明圈法：在培养剂中加3CaCO 2%，菌落形成后，产生的酸会与3CaCO 反应形成明显的透明圈，其中透明圈直径与菌落直径之比较大的菌株可能是高产菌株。
4、、产酸能力的检测： 将培养基50ml 分装到250ml 三角瓶内，灭菌后接入变异后的菌株2环，于30~33℃培养。
旋转式摇床的转速为300r/min ，往复式摇床振幅6cm ，频率为120次/min 。
发酵4~6d ，取发酵液1ml ，用0.1mol/LNaOH 滴定其酸度，对产酸大幅提高的变异菌种进行扩大培养。
5、突变菌株的保藏：斜面传代法，将突变株接入斜面，在30℃下培养3~5d ，然后置于4~5℃冰箱中保藏，最长可保藏3~4个月。
三、 培养基条件：本实验采用液体发酵培养，培养基配方如下：土豆 200g （煮汁） 蔗糖 100g NH4NO3 2.0g KCI 0.15gMgSO4 0.25g水1000mlPH 5分装：每瓶100ml；棉塞或8层纱布；0.08Mpa，20min。
四、发酵：1、柠檬酸生产菌种的扩大培养方法①、第一级扩大培养，斜面培养，确认所制成的斜面无杂菌污染后，接入黑曲霉孢子悬液0.1ml，于32℃培养4~5d。
②、第二级扩大培养，有琼脂固体培养和液体表面培养两种方法，前者与斜面培养基组成相同，后者为液体培养基，固体培养时，500ml茄子瓶装80ml琼脂培养基，250ml茄子瓶装50ml琼脂培养基。
灭菌后摆成斜面，凝固后的斜面置37℃下培养2d，确认无杂菌污染即可使用；液体培养时，将液体培养基装入三角瓶中使液层深度达4~5cm，于100kPa 下湿热灭菌15min，按无菌操作，培养温度32℃。
液体表面培养需7~10d，琼脂固体培养需6~7d。
③、第三级扩大培养，琼脂固体培养基与斜面培养基相同，液体培养基与第二级扩大培养所需用液体培养基相同。
当进行液体表面培养时，可在1000ml或2000ml三角瓶中进行，液体培养在容器中的液层深度为4~5cm。
采取固体表面培养时，则将含琼脂的培养基放入广口容器中，培养层厚度达到4~5cm，用8层纱布封扎容器口，灭菌，冷却凝固后即可用来接种。
2、柠檬酸深层发酵1、操作步骤在发酵罐内装有35℃、已经液化处理过的薯干粉液化液，装液量为罐体积的85%，还原糖含量18%。
将种子罐中已培养到小球状菌丝体的三级种子液倒入发酵罐内，接种量为10%。
罐压为0.1MPa，发酵18h前的通风量为0.08~0.1m³/h，在18~30h时，通风量调整为0.12 m³/h，30h后升高到0.15m³/h。
200rpm，28℃；接种后每24h取样测定、记录发酵液pH。
发酵将近4d。
在发酵0~40h左右时，应将发酵液的pH控制在3.6~4.0，当发酵进入60h左右时，则应将发酵液pH控制在2.5以下。
当发酵液残糖在0.2~0.5%，酸度不在上升时，发酵即结束。
发酵进行到24~28h，以每毫升发酵液添加5~10g的量往发酵液中加入灭过菌的碳酸钙，，让发酵液pH维持在2.5~2.8,这对生物合成柠檬酸是十分有利的。
使用硝酸铵作为氮源，对培养基的pH几乎不产生影响。
3、酸度测定酸度—是指100ml发酵液所含柠檬酸的克数。
方法：取发酵液滤液或离心液1ml，以酚酞为指示剂，用0.1429～0.1430mol/L标准NaOH 溶液滴定至淡粉红色，所消耗的NaOH毫升数即为发酵液酸度。
4、发酵条件控制：柠檬酸的发酵因菌种、工艺、原料而异，但在发酵过程中还需要掌握一定的温度、通风量及pH值等条件。
①、温度：一般认为，黑曲霉适合在28～30℃时产酸。
温度过高会导致菌体大量繁殖，糖被大量消耗以致产酸降低，同时还生成较多的草酸和葡萄糖酸；温度过低则发酵时间延长。
②、pH要求：微生物生成柠檬酸要求低pH，最适pH为2～4，这不仅有利于生成柠檬酸，减少草酸等杂酸的形成，同时可避免杂菌的污染。
③、溶氧量：柠檬酸发酵要求较强的通风条件，有利于在发酵液中维持一定的溶解氧量。
通风和搅拌是增加培养基内溶解氧的主要方法。
随着菌体生成，发酵液中的溶解氧会逐渐降低，从而抑制了柠檬酸的合成。
采用增加空气流速及搅拌速度的方法，使培养液中溶解氧达到60％饱和度对产酸有利。
柠檬酸生成和菌体形态有密切关系，若发酵后期形成正常的菌球体，有利于降低发酵液粘度而增加溶解氧，因而产酸就高；若出现异状菌丝体，而且菌体大量繁殖，造成溶解氧降低，使产酸迅速下降。
④、其它因素：发酵液中金属离子的含量对柠檬酸的合成有非常重要的作用,过量的金属离子引起产酸率的降低, 由于铁离子能刺激乌头酸水合酶的活性，从而影响柠檬酸的积累。
柠檬酸发酵用的糖蜜原料，因含有大量金属离子，必须应用离子交换法或添加亚铁氰化钾脱铁方能使用。
然而微量的锌、铜离子又可以促进产酸。
五、产品的分离纯化：实验材料：CaCO3（或CaO）、稀硫酸、活性炭、烧杯、蒸发皿、纱布、离心机、过滤漏斗、石棉网、玻璃棒、pH试纸、）1、柠檬酸的分离a.发酵液经2～4层纱布过滤（如需要可再用滤纸过滤一次）或经离心（菌丝球很小的过滤太慢）取滤液b.加热至70℃，慢慢加入适量CaCO3（或CaO），中和至pH6.0～6.5；c.过滤得柠檬酸钙。
d.向所得的柠檬酸钙中加入稀硫酸使柠檬酸钙溶解，得到柠檬酸和硫酸钙沉淀。
进行过滤，得到柠檬酸溶液。
2、柠檬酸的纯化将稀释的柠檬酸溶液用活性炭脱色，并蒸发形成柠檬酸结晶。
通过离心回收晶体，然后干燥并包装。
附：PDA培养基的制备1、将马铃署去皮,切成约2cm2 的小块,放入1500mL 的烧杯中煮沸30min，注意用玻棒搅拌以防糊底，然后用双层布过滤，取其滤液加蔗糖，再补足至1000mL，自然pH。
调pH通常放在加琼脂之前。
应注意pH 值不要调过头，以免回调而影响培养基内各离子的浓度。