核酸的体外扩增(PCR)概述

PCR反应五要素： 引物、酶、dNTP、
模板和Mg2+
Taq DNA聚合酶
来自水生栖热菌 良好的耐热性 Mg2+依赖性 无校正功能
第十一章
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Thermusaquaticus
（二）、以mRNA为模板的反应
mRNA 5 l 5× Buffer 4 l dNTP 2 l(10mmol/L) RNasin 1 l(20u) AMV RTase 1 l(10u) Oligo(dT)12—18(或下游引物) 1 l ddH2O 6l /20 l
五、PCR反应条件的控制
（一）PCR反应的缓冲溶液
提供合适的酸碱度和某些离子
10～50mmol/L Tris-HCl缓冲液 50mmol/L KCl BSA或明胶
（二）镁离子浓度
Taq酶活性需要Mg2+ ， Mg2+浓度过高导致非特异扩增。 一般常用1.5mmol/L
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第十一章
注意的事项：
（一）防止污染
试剂小量分装 吸头及EP管一次性使用 器皿及工作区域要分开，无菌操作
（二）设立对照：
阳性对照： 阴性对照： 试剂对照：
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第十一章
阳性模板 阴性模板 除模板外的所有组分
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七、PCR技术的主要类型
㈠ ㈡ ㈢ ㈣ ㈤ 筑巢PCR 多重PCR 不对称PCR 共享引物PCR 锚定PCR ㈥ ㈦ ㈧ ㈨ ㈩ 彩色PCR 原位PCR 定量PCR 差异显示PCR 重组PCR
（self-sustained sequence replication,3SR) 3. 核酸序列的扩增（nucleic acid sequence-based amplification, NASBA）
第十一章
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一、基本原理
以RNA为模板在体外大量扩增RNA
非循环相
逆转录 转录
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PCR反应的特点
特异性强： 2. 灵敏度高：PCR产物的生成量是以指数方式 增加的，能将皮克(pg=10- 12)量级的起始待 测模板扩增到微克(g=-6)水平 3. 简便、快速：PCR反应一般在2～4 小时完 成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，不 一定要用同位素，无放射性污染、易推广。
四、PCR的基本反应
（一）、以DNA为模板的反应：
10×缓冲液 4种dNTP混合物 引物 模板DNA Taq DNA聚合酶 Mg2+ 加双或三蒸水至
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10 l 各200 mol/L 各10～100 pmol 0.1～2 g 2.5 u 1.5 mmol/L 100 l
1.
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4.对标本的纯度要求低： 不需要分离病毒或细菌及培养细胞， DNA 粗制品及总RNA均可作为扩增模板。 可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽 液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA 扩增检测。
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第二节 连接酶链反应
Ligase chain reaction LCR
第十一章
42℃水浴1小时，95 ℃水浴10分钟灭活逆转 录酶。向上述反应体系中添加如下试剂： 2018/11/1
ห้องสมุดไป่ตู้10
10× Buffer 5 l 25mmol/L Mg2+ 3l Taq酶 0.5 l（2.5u） 上游引物 1l ddH2O 20.5l /50 l
按PCR循环参数进行
RT--PCR
（三）底物浓度
dNTP浓度在20～200 mol/L 四种dNTP必须浓度相等
（四） Taq DNA聚合酶
Taq DNA聚合酶在70～80℃具有最高聚合活 性
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（五）引物
引物浓度一般为0.1～ 0.5mol/L
（六）反应温度和循环次数
1. 2. 3. 4.
第十一章
6. 3′端必须互补
第十一章
7.
5′端可游离
6
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三、模板的制备
DNA
1. 从细胞中提取DNA：血细胞、绒毛、尿 样、毛发、精斑、口腔上皮细胞 2. 固定和包埋的组织标本：脱蜡、蛋白酶K 消化
RNA
新鲜组织或细胞 所用器皿和试剂必需经高温灭菌或DEPC处 理
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第十一章
第十一章
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（三）PCR产物的积累规律
– DNA扩增过程遵循酶促动力学原理。 – 反应初期，目的DNA片段呈指数形式 （2n），随着目的DNA的积累，在引物— 模板与DNA聚合酶达到一定比例时，酶的 催化反应趋于饱和—平台期 。（25个循环）
（四）PCR反应的自动化
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一、LCR的基本原理
LCR是以DNA连接酶将某一DNA链的5′磷 酸与另一相邻链的3′羟基连接为基础的 循环反应。
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第十一章
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二、LCR产物的检测
标记引物：
– 放射性标记 – 荧光素标记 – 地高辛标记
第十一章
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第十一章
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第十一章
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二、PCR引物设计
1. 一对引物，与3′端互补 2. 长度：15～30个核苷酸
3. 碱基分布随机
4. 引物内、引物间不应有互补序列
5. 引物与非特异扩增区无同源性
三、影响LCR的重要因素
㈠ 引物
基因的突变位点 长度足够
㈡ LCR的反应条件
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第三节 RNA的体外扩增
RNA—PCR
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1. 转录依赖的扩增系统(transcript-based
amplification system, TAS)
2. 自主维持序列扩增或再生式序列复制
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变性温度和时间 95℃/30 ～60s 退火温度和时间 45～55℃/30 ～60s 延伸温度和时间 72℃ 循环次数 25～30 不超过35
六、PCR中应注意的事项
PCR反应中可能出现的问题： 假阴性，不出现扩增条带 假阳性 出现非特异扩增带
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第十一章
底物：dNTP, NTP 模板： 缓冲液：
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二 、产物的检测
三、RNA—PCR技术的特点及应用
特点：
扩增效率极高 特异性强
应用：
第十一章
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检测RNA，RNA测序，临床诊断
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医学分子生物学
盛 德 乔
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第十一章 核酸的体外扩增
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第一节 聚合酶链式反应
polymerase chain reaction PCR
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一、PCR的基本原理
PCR的基本原理 变性、复性、半保留复制 PCR三步曲 – 变性 90～97℃ – 退火 45～55℃ – 延伸 72℃左右
循环相
聚合酶链式反应
第十一章
反应体系温度均一 RNA产物以10的指数方式增加
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第十一章
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RNA—PCR反应体系的组成
酶：
逆转录酶，RNase H, T7RNA聚合酶
引物：
引物A—与RNA3′端互补，5 ′端含启动子 引物B—与cDNA第一条链3′端互补