PCR的基本步骤及注意
高三生物一轮复习PCR知识总结
高考生物PCR的过程及应用考点归纳总结一、基础考点1.名称：多聚酶链式反应2.原理：DNA双链复制（DNA的半保留复制）、DNA的热变性原理3.前提：要有一段已知目的基因的核苷酸序列4.过程：PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：会解释三个步骤①变性：当温度上升到90℃以上时，双链DNA解聚为单链②复性：当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链结合；③延伸：当温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸再耐高温的DNA 聚合酶的作用下，根据碱基互补配原则合成新的DNA链④重复：第一轮循环的产物作为第二轮的模板：重复循环变性—复性--延伸三过程。
5.PCR反应体系的成分及作用DNA模板：从样本或细胞中提取的微量总DNA原料∶dNTP（dATP、dGTP、dCTP、TTP），提供原料和能量酶∶Taq聚合酶（热稳定DNA聚合酶，从嗜热菌中分离得到）引物∶一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸（注意：引物与目的DNA片段两条母链各自的3’端序列互补）Mg2+：维持酶活性所必需PCR缓冲液∶维持pH，保护Taq酶6.DNA在体内复制的条件模板∶DNA分子的每条链酶∶解旋酶、DNA聚合酶、DNA连接酶原料、能量∶dATP、dGTP、dCTP、dTTP引物∶RNA引物，温和的反应条件7.总结：PCR与体内DNA分子复制的不同点：PCR DNA复制复制起点无有复制叉无有场所及条件体外；控制3个不同温度体内细胞核、线粒体、叶绿体；温和条件步骤变性、退火、延伸起始、延伸、终止酶Taq酶解旋酶、DNA聚合酶、DNA连接酶引物2种，一小段与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链DNA；人工合成多种RNA做引物；自行合成引物是否去除否是变性的条件90℃以上的高温解旋酶结果短时间内快速扩增目的基因片段复制完整的DNA分子特点半保留复制两条链连续合成半保留复制半不连续复制8.PCR技术在基因工程中的应用：（1）特异性、快速扩增目的基因获取目的基因（2）目的基因的检测与鉴定9.用PCR技术可以扩增mRNA吗？不可以；在逆转录酶的作用下，需以mRNA为模板按照碱基互补配对的原则合成cDNA再进行扩增10.提取mRNA扩增目的基因的过程：第一步：逆转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA链，形成RNA-DNA杂交分子第二步：核酸酶H降解RNA-DNA杂交分子中的RNA链，使之变成单链DNA；第三步：以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子第四步：以双链DNA分子为模板，经过③变性、④复性、⑤延伸，循环扩增形成目的基因产物11.cDNA中缺少真核生物基因的哪些结构：启动子、内含子、终止子12.目前在PCR反应中使用Taq酶而不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因是：Taq酶热稳定性高，而大肠杆菌DNA聚合酶在高温下会失活13.PCR产物的影响因素：模板DNA的量、脱氧核苷酸的量、引物的量、酶的数量和活性、循环次数、Mg2+的浓度14.PCR后期，反应速率下降的原因：酶的活性降低、引物和dNTP浓度降低、反应产物增多15.变性温度过低会导致双链不能充分解开；16：PCR扩增中预变性的目的：预变性破坏DNA中可能存在的较难破坏的二级结构。
pcr扩增实验注意事项
pcr扩增实验注意事项PCR扩增实验注意事项PCR（聚合酶链反应）是一种广泛应用于分子生物学研究的技术，可在短时间内迅速扩增DNA片段。
PCR实验的成功与否直接影响实验结果的准确性和可靠性。
为了确保PCR实验的顺利进行，以下是一些值得注意的事项。
实验前的准备工作在进行PCR实验之前，必须进行充分的准备工作。
这包括准备PCR试剂，如引物、模板DNA和聚合酶等，以及实验器材的消毒。
1.引物的设计与选择PCR扩增所需的引物应具有良好的特异性，能够与待扩增的目标DNA序列完全互补。
引物的设计可以借助于计算机软件进行，以确保引物的特异性和扩增效率。
此外，引物的长度应适中，通常选择15-30个核苷酸的长度。
2.模板DNA的准备与稀释模板DNA是PCR扩增的起点，它必须具有足够的纯度和浓度。
在准备模板DNA时，应注意避免DNA的降解和污染。
同时，还需要将模板DNA 稀释到适当的浓度，以确保PCR反应的最佳效果。
3.实验器材的消毒PCR实验需要在无菌条件下进行，以避免外源性DNA的污染。
在实验前，所有的器材和试剂瓶口都必须经过高温消毒，或使用酶切酶或DNase去除潜在的污染。
实验操作步骤实验操作步骤是PCR实验中最关键的部分，任何疏忽都可能导致实验失败或产生虚假结果。
以下是PCR实验中的一些重要操作步骤。
1.反应体系的配制PCR反应体系通常包括引物、模板DNA、dNTPs、聚合酶和缓冲液等组分。
根据实验需要，在计算器或试剂盒说明书的指导下，计算和配制所需的每个组分的量。
2.反应管的装填和密封将配制好的PCR反应体系分装到PCR反应管中，并在反应管盖上加上适当的密封层，如矿物油或矽胶珠。
这样可以防止反应体系的蒸发和污染。
3.反应条件的优化PCR反应需要针对性地进行优化，包括反应温度、循环数和延伸时间等参数。
通过合理调整这些参数，可以最大限度地提高PCR扩增的效率和特异性。
4.防止污染和交叉污染PCR反应对DNA污染非常敏感，因此需要特别注意防止样品之间的DNA 交叉污染。
简述PCR的基本步骤有哪些内容和步骤
简述PCR的基本步骤有哪些内容和步骤引言PCR（聚合酶链式反应）是一种在生物学实验中被广泛应用的技术，它能够在体外扩增特定的DNA片段。
PCR的基本步骤涉及到DNA的分离、引物设计、扩增、检测等多个环节。
本文将简述PCR的基本步骤和内容。
PCR的基本步骤PCR主要包含三个基本步骤：变性、退火和延伸。
下面将详细介绍每个步骤的内容和操作。
变性（Denaturation）变性是PCR的第一个步骤，它的目的是将双链DNA分离成两条单链DNA。
这个过程通常通过加热反应体系到较高的温度（通常是95°C）来实现。
在这个高温下，氢键断裂，双链DNA解偶，形成两条单链DNA。
退火（Annealing）退火是PCR的第二个步骤，它涉及引物的结合和弱的碱性条件。
在这个步骤中，温度被降低到适合引物与目标DNA序列结合的温度。
引物是两小片DNA序列，它们分别位于待扩增区域的目标DNA序列的两端。
通过结合到目标序列上，引物提供木核酸链的起始点。
延伸（Extension）延伸是PCR的第三个步骤，它在合适的温度和时间下进行。
在这个过程中，聚合酶（如Taq聚合酶）通过加入互补的核苷酸，将引物与单链DNA扩增为双链DNA。
聚合酶从引物的3’端开始合成新的DNA链，并到达引物的5’端。
一个完整的PCR循环完成后，会产生两条与目标DNA序列相同的DNA片段。
PCR的循环PCR的基本步骤在一个循环中完成一次，但为了扩增特定的DNA片段，需要进行多个PCR循环。
这些循环由PCR仪自动完成。
一般情况下，PCR的循环次数在20-40次之间。
PCR的应用PCR技术被广泛应用于多个领域，包括基因分型、基因突变检测、遗传学研究等。
通过PCR技术，可以在短时间内快速扩增目标DNA片段，为后续实验打下基础。
结论PCR是一种重要而有效的DNA扩增技术。
通过其基本步骤的反复循环，可以在体外快速扩增特定的DNA片段。
在实际应用中，我们可以利用PCR技术来进行遗传学研究、医学诊断以及其他领域的实验。
rt-pcr的步骤和注意事项
RT-PCR的步骤和注意事项RT-PCR（逆转录聚合酶链反应）是一种常用的分子生物学技术，用于检测和分析RNA的数量和表达水平。
下面是RT-PCR的基本步骤和一些需要注意的事项。
步骤1.提取RNA：RT-PCR的第一步是从样品中提取RNA。
常见的方法包括酚/氯仿提取法和商用RNA提取试剂盒。
2.逆转录：逆转录是将RNA转录成cDNA的过程。
逆转录反应需要逆转录酶和引物。
在逆转录反应中，RNA被逆转录酶逆转录为单链cDNA。
3.退火：将逆转录产生的单链cDNA进行退火，以得到双链cDNA。
退火的温度和时间应根据引物的特异性进行优化。
4.PCR扩增：将退火得到的双链cDNA作为模板进行PCR扩增。
PCR扩增需要DNA聚合酶和引物。
PCR扩增的温度和时间也应根据引物的特异性进行优化。
5.分析产物：将PCR扩增产物进行凝胶电泳分析或者实时荧光定量PCR分析，以检测和定量RNA的表达水平。
注意事项在进行RT-PCR实验时，有几个注意事项需要遵守：1.RNase污染：RNase是一种可以降解RNA的酶，极易污染实验室环境。
为了避免RNase污染，所有操作前都应使用RNase去除液对实验表面进行彻底清洁，并在操作过程中使用RNase-free的试剂和器具。
2.质控：在RT-PCR实验中应常规进行阴性对照和阳性对照。
阴性对照是用纯水代替RNA模板，而阳性对照是使用已知含有目标RNA的样品。
质控实验的结果应该符合预期，以确保实验的准确性和可靠性。
3.引物设计：引物是RT-PCR实验中非常重要的因素，合适的引物设计可以提高实验的特异性和灵敏度。
引物的选择应避免自身互补性，长度一般为18-24个碱基，GC含量在40-60%之间。
此外，引物的Tm值应相近，以确保PCR扩增的效果。
4.反应体系：RT-PCR反应体系的准备需要精确的计量。
反应的组分通常包括模板RNA，引物，逆转录酶，逆转录缓冲液，核苷酸混合液，PCR缓冲液，DNA聚合酶，dNTPs和MgCl2等。
PCR的基本步骤及注意
PCR的基本步骤及注意聚合酶链反应（PCR）是一种体外扩增特定DNA序列的技术，可以在短时间内生成大量目标DNA分子。
这项技术有助于分子生物学、基因工程、医学诊断和法医学等领域的研究。
1.临床分配试剂和试管：将PCR反应所需的试剂和试管按需求分配到不同的试管中。
要确保试剂处于适当的温度，避免暴露于高温和冷藏温度。
2.准备DNA样本：从所需样本中提取目标DNA序列。
此步骤可能需要使用DNA提取试剂和特定的样本处理方法。
3.DNA扩增：在PCR试管中，添加目标DNA序列的模板，然后加入DNA聚合酶、引物（前向和反向引物）和缓冲液。
将试管放入PCR热循环仪。
4.PCR循环条件：PCR循环通常包括三个步骤：变性、退火和延伸。
变性步骤将模板DNA变性为两条单链DNA；退火步骤允许引物与目标序列配对；延伸步骤将DNA聚合酶沿引物向目标DNA序列延伸，并在每个PCR循环中产生新的DNA分子。
5.PCR循环次数：PCR反应包含多个PCR循环，每个循环都由变性、退火和延伸步骤组成。
PCR循环次数的选择取决于所需扩增的目标DNA的数量。
6.凝胶电泳：将PCR反应产物进行凝胶电泳检测。
通过电泳可以将PCR产物分离出来，并根据其大小进行检测和分析。
PCR注意事项如下：1.PCR试剂的储存和使用：所有PCR试剂都应存储在适当的温度下，并且在使用之前应检查其有效期。
如果试剂过期，可能会对PCR反应产生不可预测的结果。
2.样本处理和DNA提取：样本处理和DNA提取步骤的准确性对PCR结果的可靠性至关重要。
应遵循标准样本处理和DNA提取的步骤，并确保使用无污染的试剂和材料。
3.引物的设计：引物是PCR反应中的重要组成部分，其设计应遵循一定的原则。
引物应具有与目标DNA序列特异性互补的序列，并且长度应适当，通常在20-30个碱基对之间。
4.反应混合物的准备：在混合PCR反应的试管中，应遵循正确的操作步骤，确保所有试剂都得到正确添加，并完成适当的混合。
目的片段扩增总结
目的片段扩增总结引言目的片段扩增（PCR）是一种常用的分子生物学技术方法，它可以通过扩增DNA片段来获得特定的目的序列。
这项技术的发展使得科学家能够在研究基因组、DNA测序、基因工程等领域中进行更加精细和准确的实验操作。
本文将介绍PCR技术的基本原理、实验步骤以及注意事项，并总结该技术的优点和应用。
PCR技术的基本原理PCR技术通过在体外进行一系列高温循环反应，以获得大量特定DNA片段的方法。
其基本原理可以归结为以下三个步骤：变性、退火和扩增。
1.变性：将PCR反应混合液中的DNA样本加热至94-98摄氏度，使其两条链解旋（变性）。
这样，DNA就会变成两个单链的模板。
2.退火：降低反应温度到50-65摄氏度，将引物（primer）与目的DNA序列的单链模板互相结合。
这两个引物是根据目的DNA序列的反向互补序列设计的，它们的结合定位PCR扩增的起始位点。
3.扩增：将反应温度升至72摄氏度，加入DNA聚合酶（常用的是Taq聚合酶）。
DNA聚合酶在DNA单链模板上逐个加入碱基，从而在每一个引物的配对位点上合成新的DNA链。
这样，每个引物会扩增出与目的序列相对应的DNA片段。
通过不断的循环这三个步骤，PCR反应可以在非常短的时间内扩增出大量的目的DNA片段。
PCR实验步骤PCR实验通常包含以下几个步骤：1.DNA样本提取：从待测样本（例如细菌、动物组织、血液等）中提取DNA。
常用的提取方法包括酚/氯仿法、盐析法等。
2.引物设计：根据目的序列的反向互补序列设计引物。
引物通常是由15-30个碱基组成的短DNA片段。
3.PCR反应条件设定：根据目的序列的长度和GC含量，优化PCR反应的退火温度、扩增时间和循环次数等参数。
4.PCR反应体系制备：根据PCR反应条件设定添加反应体系所需的试剂，包括DNA模板、引物、反应缓冲液、Mg2+、dNTPs和DNA聚合酶等。
5.PCR反应程序设定：将PCR反应体系置入热循环仪，设定变性、退火和扩增的时间和温度。
简述PCR的基本原理和步骤及步骤要点
简述PCR的基本原理和步骤及步骤要点PCR（聚合酶链式反应）是一种在分子生物学中广泛应用的技术，它能够快速而准确地扩增DNA片段。
本文将对PCR的基本原理、步骤以及步骤要点进行简述。
基本原理PCR基于DNA的复制原理，通过不断重复三个基本步骤（变性、退火和延伸）来扩增特定DNA片段。
具体而言，PCR需要以下三种主要成分：DNA模板、引物和聚合酶。
1.DNA模板：PCR需要从中复制目标DNA片段的DNA模板。
该DNA可以是从细胞中提取的总DNA、cDNA或已知序列的DNA片段。
2.引物：引物是两个短的DNA片段，其中一个与目标DNA片段的起始位置互补，另一个与目标DNA片段的末端互补。
引物的作用是提供了PCR反应的起始点。
3.聚合酶：聚合酶是PCR反应中的关键组分，它能够在退火温度下从引物的起始点开始，沿着DNA模板链合成新的DNA链。
PCR的基本原理是通过不断重复以下三个步骤来扩增目标DNA片段。
步骤及步骤要点1.变性：在PCR反应的第一步，反应混合液中的DNA模板被加热到高温（通常为94-98℃），使DNA双链解开成两条单链（变性）。
•高温变性有助于断开DNA双链的氢键，使之成为两条单链。
2.退火：在PCR反应的第二步，反应混合液被冷却到较低的温度（通常为50-65℃），使引物与目标DNA片段互补结合。
•引物与目标DNA片段的互补配对使得引物能够定位在目标DNA片段的特定位置。
3.延伸：在PCR反应的第三步，反应混合液被加热到适合聚合酶活性的温度（通常为72℃），使聚合酶从引物的起始点开始合成新的DNA链。
聚合酶能够识别引物，在引物的3’端添加互补的核苷酸，从而合成新的DNA 链。
这三个步骤组成了一次循环，形成一个PCR循环。
每个PCR循环都会使目标DNA 片段的数量成倍增加。
通常，进行20-35个PCR循环，即可扩增到足够的DNA量以进行后续分析。
需要注意的是，PCR反应需要针对具体的目标DNA片段选择合适的引物，在设定的PCR温度条件下进行。
定量PCR的实验流程及注意事项
定量PCR的实验流程及注意事项一、实验流程：1. Primer设计：为了进行定量PCR实验，需要设计一对与目标DNA 或RNA序列特异性结合的引物。
确保引物的特异性和互补性，通过使引物的浓度相等可以最大限度地提高PCR反应的扩增效率。
2.模板DNA或RNA提取：从细胞或组织中提取目标DNA或RNA。
可以使用商业化的DNA/RNA提取试剂盒或其他方法进行提取。
注意保持样品的完整性，避免污染和降解。
3.RNA逆转录（如果需要）：如果目标是RNA，则需要使用反转录酶将mRNA转换为cDNA。
通常，使用逆转录酶和随机引物进行逆转录反应。
4. qPCR反应体系：准备PCR反应体系，其中包含引物、模板DNA或cDNA、酶（如Taq DNA聚合酶、逆转录酶等）和反应缓冲溶液。
同时还可以加入SYBR Green等荧光染料或探针以实现实时监测PCR反应的进行。
5.PCR反应条件：设置合适的PCR反应条件，如温度和时间等。
通常情况下，PCR反应会进行多个循环，每个循环包括退火、延伸和变性三个步骤。
6.实时检测PCR反应：在PCR反应过程中，使用实时荧光检测系统实时监测PCR产物的积累。
根据荧光信号变化的阈值周期数（Ct值），可以推断出目标DNA或RNA的初始浓度。
7.标准曲线构建：通过使用已知浓度的目标DNA或RNA来构建标准曲线。
将标准曲线与待测样品的Ct值进行比较，可以计算出目标物浓度。
8.数据分析：根据标准曲线和待测样品的Ct值，计算出目标物的相对或绝对浓度。
可以使用专业的数据分析软件对实验结果进行统计分析和解释。
二、注意事项：1.特异性引物设计：确保引物与目标DNA或RNA的特异性结合，避免引物与非目标序列的扩增。
2.制备PCR反应的质量控制：采用无菌、无核酸污染的试剂和实验环境，避免引入杂质干扰PCR反应。
3.避免PCR反应产物的污染：使用专门用品和设备进行PCR实验，避免引入外源性DNA或RNA。
4.逆转录反应的标准化：如果进行RNA定量PCR，应尽量标准化逆转录反应的条件，以获得准确的cDNA模板。
pcr反应步骤及注意事项
实验中的一些好习惯1 加入试剂之前,把它混匀一下,以免放置时间长了浓度不均2 移液枪用完之后要归到最大计量的位置，防止久而久之弹簧失去弹性3 一定要记着关水浴箱，切记切记4 多和大家讨论，同时多关注别人讨论的经验，这几乎是最快提高的捷径了5 所有的试剂都自己配，出了问题才好找原因6 所有的PCR试剂都应小量分装，如有可能，PCR反应液应预先配制好，然后小量分装，-20℃保存备用，以减少重复加样次数，避免污染机会。
7 PCR试剂与反应液应与样品及PCR产物分开保存，不应放于同一冰盒或同一冰箱。
试验前准备，防止RNA酶污染的措施：1. 所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6h或更长时间。
2. DEPC处理（1）0.1%DEPC水：100ml超纯水加入0.1ml DEPC，充分混匀，高压灭菌。
（2）Tip头(枪头）、EP管等在提RNA过程中及做RT时接触RNA的器材（包括1ml、200μl、20μl Tip 头；EP管和PCR反应管等）；用0.1%的DEPC水（1000 ml超纯水加入1ml DEPC）37℃浸泡过夜，高压灭菌。
枪头盒插好枪头后，加入1-2ml的0.1%的DEPC水，再灭菌就行了。
3. 有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3% H2O2 室温10min，然后用0.1% DEPC水冲洗，晾干。
4. 配制的溶液应尽可能的用0.1% DEPC，在37℃处理12h以上。
然后用高压灭菌除去残留的DEPC。
不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22μm滤膜过滤除菌。
5除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。
所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。
6．试剂尽量分装，不要原瓶多次取用。
7. 操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换。
8. 设置RNA操作专用实验室，所有器械等应为专用。
标本处理区，包括扩增摸板的制备；PCR扩增区，包括反应液的配制和PCR扩增；产物分析区，凝胶电泳分析，产物拍照及重组克隆的制备。
实验室pcr的步骤和基本流程
实验室pcr的步骤和基本流程嘿，咱今儿就来讲讲实验室 PCR 那档子事儿！你知道吗，PCR 就
像是一场神奇的魔法，能让那些微小的遗传物质不断放大，变得清晰
可见。
首先呢，咱得准备好各种材料和试剂，这就好比是做饭前得把食材
都准备齐全咯。
然后就是样本处理啦，就像是给食材来个初步加工，
把需要的部分挑出来。
接下来就是PCR 反应的核心部分啦！这就好像是一场精彩的演出，每个环节都得丝丝入扣。
先是变性，这一步就像是把东西给拆散开，
让它们都露出真面目。
然后是退火，就好像给它们找到了合适的位置，让它们能好好地结合起来。
再然后是延伸，这就像是把它们一点点地
构建起来，变得越来越完整。
在这个过程中，温度可是个关键因素哦，就像是炒菜时火候的掌握
一样重要。
温度高了低了都不行，得恰到好处，才能让反应顺利进行。
你想想看，就这么小小的一个实验，里面蕴含着多少奥秘和技巧啊！每一步都得小心翼翼，不能有丝毫差错。
这可不比走钢丝容易多少呀！
而且哦，PCR 可不是随随便便就能做好的，得有耐心，有细心，还
得有扎实的专业知识。
就像盖房子一样，得一砖一瓦地用心去搭建。
做完了 PCR 反应，还得进行检测和分析呢，这就像是品尝自己做
的菜，得看看味道咋样，合不合胃口。
要是结果不如意，那还得回过
头来仔细找找问题出在哪里。
总之呢，实验室PCR 可不是一件简单的事儿，但只要咱认真对待，一步一个脚印地去做，肯定能把它玩转得妥妥当当的。
咱可不能小瞧
了这小小的实验，它说不定能为咱解开好多大谜团呢！你说是不是？。
PCR反应过程的三个基本步骤是哪三步
PCR反应过程的三个基本步骤是哪三步引言PCR（聚合酶链式反应）是一种常用的分子生物学技术，它可以从微量DNA样本中扩增目标DNA片段，以便进一步研究和分析。
PCR反应包括三个基本步骤，分别是变性、退火和延伸。
本文将详细介绍这三个步骤的原理和操作过程。
一、变性（Denaturation）变性是PCR反应的第一个步骤，通过高温将DNA双链分离为单链。
这个步骤的目的是使DNA双链变为单链，以便后续的退火和延伸步骤。
在PCR反应中，变性通常在94-98摄氏度的高温下进行，这个温度可以使DNA双链分离，其中的氢键断裂。
这样，DNA两条链之间的相互作用就被破坏，使得整个DNA分子呈现单链状态。
变性步骤通常持续30秒至1分钟，具体时间取决于样本和目标DNA的长度。
变性结束后，PCR反应管中的DNA单链就为后续的退火和延伸步骤做好了准备。
二、退火（Annealing）退火是PCR反应的第二个步骤，也是扩增特定DNA序列的关键步骤。
在退火过程中，引物（primers）与目标DNA的特定区域结合，形成DNA双链。
引物是一段短小的DNA序列，其碱基序列与目标DNA序列的两端互补。
通过引物与目标DNA序列互补配对，可以确定PCR扩增的起始点和结束点。
在PCR反应中，退火温度一般在50-65摄氏度之间，取决于引物的碱基组成和长度。
温度过高可能导致引物与目标DNA结合不牢固，温度过低则可能导致引物无法结合到目标DNA上。
退火的时间一般为20-60秒，具体时间也取决于引物和目标DNA的特性。
退火结束后，引物已经与目标DNA序列结合，为下一步的延伸提供了模板。
三、延伸（Extension）延伸是PCR反应的最后一个步骤，通过加入DNA聚合酶使引物延伸，从而合成新的DNA链。
延伸过程中，DNA聚合酶沿着目标DNA的单链模板进行扩增，合成一条与目标DNA相互补的新的DNA链。
在PCR反应中，延伸温度通常在72摄氏度左右，这个温度可以提供最佳的DNA聚合酶活性。
pcr三个步骤
pcr三个步骤聚合酶链式反应（PCR）是一种重要的分子生物学技术，它可以在短时间内扩增DNA片段。
PCR主要分为三个步骤：变性、退火、延伸。
本文将详细介绍PCR的三个步骤及其在实验室中的应用。
一、变性PCR的第一个步骤是变性。
在这个步骤中，需要将待扩增的DNA模板加热至95摄氏度。
高温的作用是使双链DNA解链成两条单链DNA。
由于高温导致氢键断裂，DNA的双链结构会转变为单链结构。
这一过程通常需要较高的温度和一定的时间，以确保DNA完全解链。
二、退火退火是PCR的第二个步骤。
在这个步骤中，温度会降低至使引物与目标DNA序列进行结合的最佳温度。
引物是一种短的DNA片段，它会与目标DNA序列的两端互补配对。
通过引物的结合，可以指导DNA聚合酶在目标DNA序列起始位置上进行复制。
退火的温度通常会根据引物的碱基序列来确定。
引物的退火温度应该比目标DNA序列中较高的GC含量的碱基对的融点高一些。
这样才能保证引物在目标DNA序列上的特异性结合，避免非特异性引物结合带来的误差。
三、延伸PCR的第三个步骤是延伸。
在这个步骤中，温度会升高至聚合酶的最适工作温度（一般为72摄氏度）。
在此温度下，DNA聚合酶会在引物的指导下，以模板DNA为模板合成新的DNA链。
DNA聚合酶能够在引物的末端开始合成，并向反方向复制整个DNA链，从而扩增目标DNA序列。
延伸的过程中需要将适当的dNTPs（脱氧核苷酸三磷酸）提供给PCR反应体系，以供DNA聚合酶进行DNA合成。
该步骤的时间会根据待扩增的DNA片段的长度来设定，确保足够的时间完成DNA的合成。
PCR三个步骤的重复进行，可以在短时间内扩增一份DNA模板，并在最终产物中得到数以万计的复制。
PCR技术的应用PCR技术在分子生物学领域有着广泛的应用。
下面列举几个PCR技术的常见应用。
1. 基因检测：PCR技术可以用于基因检测，包括遗传病的检测、疾病易感性的评估等。
通过对特定基因序列的扩增，可以分析基因突变、单核苷酸多态性等关联因素。
PCR操作有哪些注意事项
PCR操作有哪些注意事项PCR（聚合酶链式反应）是在分子生物学和遗传工程中常用的一种技术，可以扩增DNA片段。
虽然PCR操作看似简单，但是在实验过程中仍然需要注意一些重要的事项，以确保实验结果的准确性和可靠性。
1. 实验前准备在进行PCR实验之前，有几个准备工作需要提前完成： - 准备好所需的实验物质，包括DNA模板、引物、聚合酶、缓冲液等。
确保这些实验物质的质量良好，没有污染。
- 根据实验需要选择合适的PCR仪，调试好仪器参数，确保温度控制精确可靠。
- 设计合适的引物序列，确保引物能够特异性地结合到目标DNA序列上。
2. 实验操作在进行PCR操作时，需要注意以下几个关键环节： - 保持实验环境的清洁和无菌。
实验过程中，使用无菌技术操作，避免污染。
- 遵循好实验的基本原则，比如每个样本使用单独的PCR管，避免交叉污染。
- 在开始PCR反应之前，进行负对照实验，即只使用纯水或者没有模板DNA的样品作为对照，确保实验没有污染。
- 严格按照实验方案中的步骤进行操作，尽量避免实验操作的变异。
- 注意各步骤中的温度和时间控制，以确保PCR反应的有效性和效率。
3. 实验后处理实验结束后，还需要注意以下事项： - 将PCR产物进行凝胶电泳分析，验证反应结果。
如果需要定量PCR产物，可以使用荧光定量PCR技术进行分析。
- 将实验用具进行严格的清洁和消毒处理，避免实验交叉污染。
- 正确保存PCR产物，避免DNA降解。
通常可以将PCR产物保存在低温下，比如-20°C冷冻保存或制备浓缩保存。
4. 安全注意事项在进行PCR实验时，还需要注意一些实验安全措施： - 使用实验室必需的个人防护装备，比如实验手套、防护眼镜等。
- 遵循实验室中的安全操作规程，防止发生事故或暴露于有害化学物质。
- 合理储存和处理实验废液和废弃物，以保护环境和他人的安全。
综上所述，PCR操作需要注意实验前的准备、实验操作的细节、实验后的处理以及安全事项。
pcr操作步骤及注意事项
pcr操作步骤及注意事项嘿，咱今儿就来讲讲 PCR 操作步骤和那些得特别留意的事儿！PCR 啊，就像是一场微观世界里的奇妙旅程。
先来说说操作步骤吧。
第一步，就像准备一场盛大演出前的准备工作，得把各种试剂啊、样本啊都妥妥地备好。
然后呢，就是设计好反应体系，这可不能马虎，就跟搭积木一样，得把各个部分恰到好处地组合起来。
接下来，把这些东西都放进 PCR 仪这个“魔法盒子”里，设定好温度、时间这些关键参数，就像给这场旅程规划好路线。
然后呢，就等着PCR 仪发挥它的魔力啦！可别小瞧了这些步骤，每个环节都有不少讲究呢！比如说样本准备，这可得精心处理，要是样本出了岔子，那后面可就全白搭啦，这就好比盖房子根基没打好，那房子能稳吗？还有反应体系的设计，各种成分的比例得恰到好处，多一点少一点都可能影响结果，这就跟做菜似的，调料放得合适，菜才美味呀！再来说说注意事项，那也是一堆堆的呀！首先，实验室的环境得保持干净整洁，不能有任何杂质来捣乱，这就跟我们的家一样，干净整洁才能住得舒服嘛。
操作的时候，一定要小心谨慎，千万别把不该碰的碰了，不该洒的洒了，那可就麻烦大了。
而且啊，试剂的保存也特别重要，该冷藏的冷藏，该避光的避光，就像对待宝贝一样呵护着它们。
还有，使用仪器设备也要规范，不能随便乱搞，不然仪器“发脾气”了，咱可就不好办啦！PCR 操作就像是一场精细的舞蹈，每个动作都要恰到好处。
咱得时刻保持警惕，注意每一个细节，不能有丝毫的马虎。
想象一下，如果因为一点点小疏忽导致结果不准确，那多让人郁闷呀！所以呀，一定要认真对待，把每个环节都做到位。
总之呢，PCR 操作可没那么简单，但只要咱用心去做，注意好每一个步骤和事项，就一定能在这个微观世界里舞出精彩，得到准确可靠的结果！咱可不能小瞧了这些小小的实验操作，它们可是有着大大的学问呢！大家加油吧！。
pcr实验流程和注意事项
PCR实验流程如下：
试剂准备阶段：在试剂贮存和准备区的超净工作台或生物安全柜进行，用确保无污染的移液器、枪头及容器等进行分装。
所有的PCR体系都应该在-20℃保存，除了ddH2O之外，其余的试剂组份需完全融化之后再加入，以免影响浓度。
配制反应体系应在快速进行，以减少非特异性扩增。
体系配制完成之后应马上进行PCR反应。
样本制备阶段：样本制备是整个PCR反应中最为关键的环节，在接收样本时一定要确保样本的密封性以及样本编号的唯一性。
严格遵守操作规程进行加样操作，操作时候尽量少说话或者不说话。
所有操作需要在生物安全柜内进行，操作前后生物安全柜需要进行紫外灯消毒，注意生物安全柜中物品的排放。
戴手套并勤于更换，要有无核酸观念。
在样本检测的同时设立对照（阳性对照、阴性对照、阴性模板、试剂对照）。
PCR实验注意事项：
引物长度通常在18-22个碱基之间。
解链温度Tm值通常要在52-58度之间。
GC含量也是一个重要的因素。
以上信息仅供参考，具体步骤和注意事项可能会因实际情况而有所不同，建议咨询专业人士获取更准确的信息。
pcr的基本过程
pcr的基本过程
PCR的基本过程：
①准备所需试剂包括特异性引物模板DNA聚合酶dNTPs缓冲液以及镁离子等确保所有成分新鲜有效；
②将上述成分按照一定比例混合加入到微量离心管中总体积通常控制在20至50微升范围内保证反应效率；
③加入适量无核酸酶水调整总体积至所需刻度避免液体过多溢出或过少蒸发影响结果；
④将混合均匀后的样品放入热循环仪中盖紧盖子开始第一个变性步骤温度设定为94至95摄氏度持续30秒至1分钟；
⑤随后进入退火阶段温度降低至50至60摄氏度根据不同引物Tm值调整时间一般为30秒至1分钟；
⑥紧接着进行延伸反应温度升至72摄氏度此时DNA聚合酶开始工作合成新的DNA链持续时间为每千碱基秒；
⑦重复上述变性退火延伸三个步骤构成一个循环通常需要进行25至35个循环以确保目标片段充分扩增；
⑧最后一个循环结束后通常会在72摄氏度保温5至10分钟以完成所有未完全延伸的DNA链；
⑨反应结束后将样品取出置于冰上冷却防止非特异性产物形成随后可根据实验目的进行琼脂糖凝胶电泳检测；
⑩电泳时将PCR产物加入样品孔中加入指示剂如溴酚蓝后接入电源正负极开始迁移；
⑪随着时间推移DNA片段依据大小不同在凝胶中形成分离带使用紫外透射仪观察拍照记录结果；
⑫最后分析电泳图谱判断PCR反应是否成功如果目标条带清晰亮度适中则说明扩增效果良好。
pcr的实验流程及注意事项
pcr的实验流程及注意事项嘿，小伙伴们！今天咱们来唠唠PCR这个超酷的实验呀！PCR 呢，就是聚合酶链式反应，在分子生物学里那可是相当重要的一个实验呢！**一、PCR的实验流程**1. 首先是样本准备呀！哎呀呀，这个步骤可不能马虎呢。
咱们得先获取到含有目标DNA的样本，这个样本来源可就多啦，可能是血液、组织或者细胞之类的哇。
在提取样本中的DNA时，一定要小心谨慎，要确保DNA的纯度和完整性呢！如果DNA提取得不好，后面的实验可就麻烦大啦！2. 接下来就是引物设计啦！哇，这可是个技术活呢。
引物就像是一把钥匙，要能够精准地结合到咱们想要扩增的DNA片段上才行呀。
引物的长度、GC含量这些参数都得好好考虑呢！一般来说，引物长度在18 - 25个碱基左右比较合适，GC含量在40% - 60%之间是比较理想的呢。
要是引物设计得不好，可能就扩增不出咱们想要的片段，那可就白忙活一场啦！3. 然后就是反应体系的配制喽！这一步需要把各种试剂按照一定的比例混合在一起呢。
像模板DNA、引物、dNTP（脱氧核糖核苷三磷酸）、Taq酶还有缓冲液这些都是必不可少的呀。
哎呀呀，在加试剂的时候一定要准确呢，哪怕是一点点的误差都可能影响实验结果哇！比如说Taq酶加多了或者加少了，反应的速度和效率就会发生变化呢。
4. 再然后就是把配制好的反应体系放到PCR仪里面进行反应啦！这个PCR仪就像是一个神奇的小盒子，它会按照咱们设定好的程序来进行加热、冷却的循环呢。
一般来说，PCR反应会经过变性、退火和延伸这三个步骤的循环。
变性的时候温度比较高，大概在90 - 95℃左右，这个时候DNA双链会解开变成单链呢；退火的时候温度会降低，这个温度要根据引物的Tm值 解链温度）来设定，一般在50 - 65℃之间，这时候引物就会和模板DNA结合上；延伸的时候温度大概在72℃左右，Taq酶会以引物为起点，把dNTP一个一个地连接到新合成的DNA链上呢。
循环的次数也很关键，通常是25 - 35次左右，循环次数太多或者太少都可能导致实验结果不理想呢！**二、PCR的注意事项**1. 哇，实验室的环境清洁可是相当重要的呢！如果实验室里有太多的杂质或者其他DNA的污染，很容易就混到咱们的实验样本里面去啦。
PCR原理及注意事项
PCR原理及注意事项PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种在分子生物学领域中广泛使用的技术，用于扩增目标DNA片段或基因。
PCR技术通过不断重复一系列的温度循环，结合特定的引物和DNA聚合酶来实现DNA的扩增。
以下是PCR原理和注意事项的详细介绍。
PCR是一种体外的DNA扩增技术，可以从极少量的DNA样本中扩增出大量的DNA片段，从而方便进行进一步研究。
PCR反应通常涉及三个步骤：变性、退火和延伸。
1. 变性（Denaturation）：将DNA样本加热至94-98°C，以断开双链DNA，使其形成两条单链。
2. 退火（Annealing）：将反应温度降至50-65°C，使引物与目标DNA序列特异性结合。
引物是短DNA片段，可以绑定到目标DNA序列的两端。
3. 延伸（Extension）：在60-75°C条件下，DNA聚合酶（例如Taq聚合酶）在引物的引导下，在目标DNA上合成新的DNA链，形成两个新的DNA双链。
通过不断重复这个PCR循环，每个循环将目标DNA段扩增一倍，扩增的DNA量呈指数增长，最终得到大量目标DNA。
PCR注意事项：1.基本操作规范：为了防止DNA污染和混合，实施PCR反应时，需要使用无菌试剂和工作区域，并避免接触空气中的DNA。
2.设计引物：合适的引物是PCR成功的关键。
引物应具有良好的特异性，并且序列不应内部重叠或与其他非目标DNA序列互补。
引物的长度通常在18到30个碱基对之间。
3.防止污染：特别注意防止污染的问题，尤其是在引物制备和样本准备过程中。
使用无菌技术并采取防污染措施，例如使用不同的实验室器皿和耗材，避免交叉污染。
4.合适的PCR缓冲液和酶：选择适合实验需求的PCR缓冲液和酶。
不同的PCR缓冲液和酶在反应条件和扩增效率上可能有所不同。
确保合适的成分浓度和酶的稳定性。
5.DNA模板的纯度：为了提高PCR反应的效率和特异性，DNA模板的纯度至关重要。
pcr实验流程和注意事项
pcr实验流程和注意事项PCR（聚合酶链反应）是一种广泛应用于分子生物学领域的技术，用于扩增寻找的DNA片段。
它被广泛用于基因分型、疾病诊断、DNA克隆、基因组测序等领域。
下面将介绍PCR实验的流程和注意事项。
一、PCR实验流程：1. DNA样品提取：从所研究的样品中提取所需的DNA，可以是细胞、组织、血液等。
2.先导扩增：先导扩增是为了增加所需的DNA靶序列数目，用于后续的扩增反应。
通过使用特定的引物扩增产生所需的DNA靶序列。
3.扩增反应液的制备：准备PCR反应液，通常包括DNA样本、引物、酶（聚合酶、缓冲液）、dNTPs（四种脱氧核苷三磷酸）和Mg2+离子等。
4.反应条件设置：根据所使用的PCR仪和所需扩增的DNA靶序列长度等参数，设置PCR反应的温度、时间等条件。
5. PCR扩增：将反应液放入PCR仪中，按照所设定的条件进行PCR扩增。
6. PCR产物检测：使用琼脂糖凝胶电泳等方法，对PCR扩增的产物进行检测和分析。
7. PCR产物纯化：可以使用PCR产物纯化试剂盒，将扩增的DNA 片段纯化、回收。
8.测序：如果需要测序分析，可以将PCR产物进行测序。
二、PCR实验的注意事项：1.实验区分：DNA准备、引物配置和反应设置等步骤应在无污染的实验区中进行，避免产生假阳性和污染的结果。
2. DNA样品的准备：DNA样品的提取应严格按照操作规程执行，避免外源性DNA的污染。
同时，要确保样品的质量和浓度。
3.引物设计：合理的引物设计对PCR扩增的特异性和效率有重要影响。
引物的长度、GC含量、Tm值等要充分考虑。
4.酶的选择：PCR酶的选择应根据所需的PCR反应类型和条件来确定。
常见的PCR酶包括Taq聚合酶和Pfu聚合酶等。
5.反应条件设置：PCR反应的条件（包括温度、时间等）应根据实验需求和所用引物的特性来设定，避免扩增效率低或非特异性扩增。
6.防止污染：使用无核酸的试剂和耗材，并采取严格的无菌操作。
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（DNApolymerase I）最早于1955年发现，而较具有实验价值及实用性的Klenowfragment of E. Coli则是于70年代的初期由Dr. H. Klenow 所发现，但由于此酶不耐高温，高温能使之变性,因此不符合使用高温变性的聚合酶链式反应。
现今所使用的酶(简称Taq polymerase), 则是于1976年从温泉中的（Thermusaquaticus）分离出来的。
它的特性就在于能耐高温，是一个很理想的酶，但它被广泛运用则于80年代之后。
PCR最初的原始雏形概念是类似修复复制，它是于1971年由 Dr. Kjell Kleppe提出。
他发表了第一个单纯且短暂复制（类似PCR 前两个周期反应）的实验。
而现今所发展出来的PCR则于1983由 Dr. Kary B. Mullis发展出的，Dr. Mullis当年服务于PE公司，因此PE公司在PCR界有着特殊的地位。
Dr. Mullis 并于1985年与Saiki等人正式发表了第一篇相关的论文。
此后，PCR的运用一日千里，相关的论文发表质量可以说是令众多其它研究方法难望其项背。
随后PCR技术在生物科研和临床应用中得以广泛应用，成为分子生物学研究的最重要技术。
Mullis也因此获得了1993年化学奖。
PCR原理DNA的是生物进化和传代的重要途径。
双链DNA在多种酶的作用下可以变性成单链，在DNA聚合酶的参与下，根据复制成同样的两分子挎贝。
在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。
因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计，DNA 聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。
但是，DNA聚合酶在高温时会失活，因此，每次循环都得加入新的DNA聚合酶，不仅操作烦琐，而且价格昂贵，制约了PCR技术的应用和发展。
发现耐热DNA聚合酶--Taq酶对于PCR的应用有里程碑的意义，该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本，PCR技术得以大量应用，并逐步应用于临床。
PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。
每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩扩增放大几百万倍。
[PCR反应体系与反应条件]1.标准的PCR反应体系10×扩增缓冲液10μl4种dNTP混合物200μl引物10～100μl模板DNA ～2μgTaq DNA聚合酶μlMg2+ L加双或三蒸水100 μlPCR反应五要素：参加PCR反应的物质主要有五种即:引物(PCR引物为DNA片段，细胞内DNA复制的引物为一段RNA链)、酶、dNTP、模板和缓冲液（其中需要Mg2+)。
引物有多种设计方法，与PCR在实验中的目的决定。
但基本原则相同PCR所用的酶主要有两种来源：Taq和Pfu。
分别来自两种不同的噬热菌。
其中Taq扩增效率高但易发生错配。
Pfu扩增效率弱但有纠错功能。
所以实际使用时根据需要必须做不同的选择模板即扩增用的DNA，可以是任何来源，但有两个原则，第一纯度必须较高，第二浓度不能太高以免抑制缓冲液的成分最为复杂，除水外一般包括四个有效成分：缓冲体系，一般使用HEPES或MOPS 缓冲体系；一价阳离子，一般采用钾离子，但在特殊情况下也可使用铵根离子；二价阳离子，即镁离子，根据反应体系确定，除特殊情况外不需调整；辅助成分，常见的有DMSO、甘油等，主要用来保持酶的活性和帮助DNA接触缠绕结构2、PCR引物设计PCR反应中有两条引物，即5′端引物和3′引物。
设计引物时以一条DNA单链为基准（常以信息链为基准），5′端引物与位于待扩增片段5′端上游的一小段DNA序列相同；3′端引物与位于待扩增片段3′端的一小段DNA序列互补。
引物设计的基本原则①引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。
②引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带。
ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或的成串排列。
③引物内部不应出现互补序列。
④两个引物之间不应存在互补序列，尤其是避免3 ′端的互补重叠。
⑤引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70%，引物3′末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增。
⑥引物3‘端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，最佳选择是G和C。
⑦引物的5 ′端可以修饰。
如附加限制酶位点，引入突变位点，用生物素、荧光物质、地高辛标记，加入其它短序列，包括起始密码子、终止密码子等。
v 引物设计软件Primer （自动搜索）*vOligo6 （引物评价）vVector NTI SuitvDNAsisvOmigavDNAstarvPrimer3 （在线服务）3、模板的制备PCR的模板可以是DNA，也可以是RNA。
模板的取材主要依据PCR的扩增对象，可以是病原体标本如病毒、细菌、真菌等。
也可以是病理生理标本如细胞、血液、羊水细胞等。
法医学标本有血斑、精斑、毛发等。
标本处理的基本要求是除去杂质，并部分纯化标本中的核酸。
多数样品需要经过SDS和蛋白酶K处理。
难以破碎的细菌，可用溶菌酶加EDTA处理。
所得到的粗制DNA，经酚、氯仿抽提纯化，再用乙醇沉淀后用作PCR反应模板。
4、PCR反应条件的控制①PCR反应的缓冲液提供合适的酸碱度与某些离子②镁离子浓度总量应比dNTPs的浓度高，常用L③底物浓度 dNTP以等摩尔浓度配制，20～200umol/L④TaqDNA聚合酶（100ul）⑤引物浓度一般为～ L⑥反应温度和循环次数变性温度和时间 95℃，30s退火温度和时间低于引物Tm值5 ℃左右，一般在45～55℃延伸温度和时间 72℃，1min/kb（10kb内）Tm值=4(G+C) ＋2(A+T)循环次数 :一般为25 ～ 30次。
循环数决定PCR扩增的产量。
模板初始浓度低，可增加循环数以便达到有效的扩增量。
但循环数并不是可以无限增加的。
一般循环数为30个左右，循环数超过30个以后，DNA聚合酶活性逐渐达到饱和，产物的量不再随循环数的增加而增加，出现了所谓的“平台期”。
［PCR步骤］标准的PCR过程分为三步：变性（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA2.退火（25℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。
3.延伸（70℃-75℃）：在（在72℃左右，活性最佳）的作用下，以dNTP为原料，从引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补的DNA链。
每一循环经过变性、退火和延伸，DNA含量即增加一倍。
现在有些PCR因为扩增区很短，即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的时间内复制完成，因此可以改为两步法，即退火和延伸同时在60℃-65℃间进行，以减少一次升降温过程，提高了反应速度。
PCR检测PCR反应扩增出了高的拷贝数，下一步检测就成了关键。
荧光素（，）染色是最常用的检测手段。
电泳法检测特异性是不太高的，因此引物两聚体等非特异性的杂交体很容易引起误判。
但因为其简捷易行，成为了主流检测方法。
近年来以为代表的检测方法，有逐渐取代电泳法的趋势。
PCR反应特点特异性强PCR反应的特异性决定因素为：①引物与模板DNA特异正确的结合；②碱基配对原则；③Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性；④靶基因的特异性与保守性。
其中引物与模板的正确结合是关键。
引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的。
聚合酶合成反应的忠实性及TaqDNA聚合酶耐高温性，使反应中模板与引物的结合(复性)可以在较高的温度下进行，结合的特异性大大增加，被扩增的靶也就能保持很高的正确度。
再通过选择特异性和保守性高的靶基因区，其特异性程度就更高。
灵敏度高PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将(pg=10-12)量级的起始待测模板扩增到微克(μg=-6)水平。
能从100万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中，PCR的灵敏度可达3个RFU()；在细菌学中最小检出率为3个细菌。
简便、快速PCR反应用耐高温的Taq DNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在DNA扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应，一般在2～4 小时完成扩增反应。
扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广。
对标本的纯度要求低不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA 粗制品及RNA均可作为扩增模板。
可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等DNA扩增检测。
PCR的循环参数1、预变性（Initial denaturation）．模板DNA完全变性与PCR酶的完全激活对PCR能否成功至关重要，建议加热时间参考试剂说明书，一般未修饰的Taq酶激活时间为两分钟。
2、循环中的变性步骤循环中一般95℃，30秒足以使各种靶DNA序列完全变性，可能的情况下可缩短该步骤时间变性时间过长损害酶活性，过短靶序列变性不彻底，易造成扩增失败。
3、引物退火（Primer annealing）退火温度需要从多方面去决定，一般根据引物的Tm值为参考，根据扩增的长度适当下调作为退火温度。
然后在此次实验基础上做出预估。
退火温度对PCR的特异性有较大影响。
4、引物延伸引物延伸一般在72℃进行（Taq酶最适温度）。
但在扩增长度较短且退火温度较高时，本步骤可省略延伸时间随扩增片段长短而定，一般推荐在1000bp以上，含Pfu及其衍生物的衍生设定为1min/kbp。
5、循环数大多数PCR含25-40循环，过多易产生非特异扩增。
6、最后延伸在最后一个循环后，反应在72℃维持5-15分钟．使引物延伸完全，并使单链产物退火成双链。
（四）PCR中的污染和假阳性PCR中污染主要来自1、样品间交叉污染；2、先前PCR产物遗留（carry-over）。