【CN109897908A】用于定量监测山核桃干腐病侵染和传播的qLAMP方法及所用引物【专利】
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(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910201728.3
(22)申请日 2019.03.18
(71)申请人 浙江农林大学
地址 311300 浙江省杭州市临安区武肃街
666号
(72)发明人 张传清 王琼伟 刘亚慧 徐炳潮
(74)专利代理机构 杭州中成专利事务所有限公
司 33212
代理人 金祺
(51)Int.Cl.
C12Q 1/6895(2018.01)
C12Q 1/6851(2018.01)
C12Q 1/06(2006.01)
C12N 15/11(2006.01)
C12R 1/645(2006.01)
(54)发明名称
用于定量监测山核桃干腐病侵染和传播的
qLAMP方法及所用引物
(57)摘要
本发明公开了一种用于监测山核桃干腐病
病菌孢子数量动态的定量环介导等温扩增引物，
q -LAMP引物组合物由以下4条引物组成：上游外
引物(F3)、下游外引物(B3)、上游内引物(FIP)、
下游内引物(FIB)。本发明还同时提供了包含上
述q -LAMP引物组合物的定量环介导等温扩增试
剂盒，以及提供了利用该试剂盒进行的山核桃干
腐病病菌孢子数量动态的定量环介导等温扩增
方法，从而获得孢子数量、DNA浓度。采用本发明
的方法能定量监测雨水、树体和土壤等处的山核
桃干腐病菌孢子数量。
权利要求书1页 说明书11页序列表1页 附图2页CN 109897908 A 2019.06.18
C N 109897908
A
权 利 要 求 书1/1页CN 109897908 A
1.用于监测山核桃干腐病病菌孢子数量动态的定量环介导等温扩增引物，其特征在于：
q-LAMP引物组合物由以下4条引物组成：
上游外引物(F3)：5’—TGTCCATAGGTTCACCTCCA—3’；
下游外引物(B3)：5’—AGATGGTCTGCCTGTGGT—3’；
上游内引物(FIP)：5’—CAAAGTCAGCGCGATGCAGCGACCGGCCAATGCGTAAG—3’；
下游内引物(FIB)：5’—AGGGTAACCAAATCGGTGCTGCGTCGATTCGCGTTAGCGG—3’。
2.用于监测山核桃干腐病病菌孢子数量动态的定量环介导等温扩增试剂盒，其特征在于：包含如权利要求1所述的q-LAMP引物组合物。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：正/反内向引物FIP/BIP的浓度为1.6μM，正/反向外引物F3/B3的浓度为0.125μM。
4.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于：试剂盒还包含定量环介导等温扩增反应预混液，所述反应预混液包含10×ThermoPol Buffer、dNTPs、MgCl2、甜菜碱、10×SYBR Green I、Bst DNA聚合酶、ddH2O。
5.利用权利要求2～4任一所述的试剂盒进行的山核桃干腐病病菌孢子数量动态的定量环介导等温扩增方法，其特征在于：
1)、q-LAMP反应
q-LAMP反应体系：
10×ThermoPol Buffer 2.0μL、10mM的dNTPs 2.0μL、25mM的MgCl2 5.0μL、5M的甜菜碱2.4μL、10×SYBR Green I 1.2μL、8U/μL的Bst DNA聚合酶1μL，20μM的FIP引物1.6μL、20μM 的BIP引物1.6μL、10μM的F3引物0.25μL、10μM的B3引物0.25μL、DNA模板1μL，ddH2O补足至20μL；
扩增条件为恒温65.9℃，1min，进行80个循环；80℃反应10min，终止反应；
2)、获得孢子数量、DNA浓度。
6.根据权利要求5所述的定量环介导等温扩增方法，其特征在于：
孢子数量(个)计算公式为
DNA浓度计算公式为
y为C T值。
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