生物化学实验 血清、乳蛋白含量测定
02 生物化学实验--酚试剂法(改良Lowry法)测定血清蛋白质含量
酚试剂法（改良 Lowry 法）测定血清蛋白质含量【目的】1 ．掌握酚试剂法测定蛋白质含量的含量与操作技术。
2 ．熟悉标准曲线的制作方法和分光光度计的应用。
【原理】蛋白质分子中所含的肽键在碱性溶液中与 Cu 2+ 络合产生紫红色化合物 ( 双缩脲反应 ) ，同时使肽链展开，其中带有酚基的酪氨酸残基充分暴露，后者在碱性条件下使酚试剂中磷钨酸 - 磷钼酸还原，生成钼蓝和钨蓝的化合物，其蓝色深浅与蛋白质含量成正比，与已知浓度的标准蛋白质溶液进行比色，即可计算出测定样品中蛋白质的含量。
酚试剂法测定样品中蛋白质的含量，其特点为方法简便，灵敏度高，能够测定2 ～100 μ g 的微量蛋白质。
其方法比凯氏定氮法操作简便，其灵敏度比双缩脲法高 100 倍左右。
因此经常被用于科研与临床检验。
【器材】1 ．座标纸2 ． 50ml 容量瓶3 ． 722 型分光光度计【试剂】1 ．碱性铜试剂甲液称取无水碳酸钠 2 . 0g ，溶于 0 . 1mol ／ L 氢氧化钠溶液 100ml 中。
乙液取硫酸铜(CuSO 4 ·5H 2 O) 0 . 5g 溶于 1 ％酒石酸钾溶液 100ml 中。
临用前取甲液 50ml, 乙液 1ml 混合，即为碱性铜试剂。
2 ．标准蛋白质溶液 ( 0.25g /L)准确称取结晶人血清清蛋白 25mg ，溶于 0 . 9 ％氯化钠溶液中，以容量瓶定容至 100ml 。
3 ． 0 . 9 ％氯化钠溶液4 ．酚试剂（有成品出售）取钨酸钠(Na 2 WO 4 ·2H 2 O) 100g 和钼酸钠(Na 2 MO 4 ·2H 2 O) 25g , 溶于 700ml 蒸馏水中，再加入 85 ％磷酸 50ml 和浓盐酸 100ml 混合，置于1500ml 圆底烧瓶中温和地回流 10h ，回流结束后加入硫酸锂(LiSO 4 ·H 2 O) 150g ，水 50ml ，溴 3 ～ 4 滴，除去回流装置，继续沸腾 15min ，以除去剩余的溴，冷却后稀释至 1000ml ，过滤，溶液应呈黄色或金黄色 ( 如带绿色者不能使用，应继续加溴煮沸 ) 。
血清蛋白含量测定实验报告
血清蛋白含量测定实验报告实验目的：本实验旨在通过测定血清中蛋白质的含量来了解血清的营养状态，并探究不同条件下血清蛋白含量的变化情况。
实验原理：血清是血液中去除了红细胞和凝血因子的部分，主要由蛋白质组成。
蛋白质含量是衡量血清中营养状况的重要指标之一。
本实验利用比色法测定血清中总蛋白质的含量，其原理是利用试剂与蛋白质发生特定颜色的反应，通过光度计测定反应产物的吸光度来推算蛋白质的浓度。
实验步骤：1. 准备工作：取适量标准蛋白溶液（如丙酮酸钙溶液）按一定比例稀释，制备一系列标准溶液，其浓度分别为1、2、3、4、5 g/L。
2. 取血清标本：从受试者血液中取得一定量的血清标本。
3. 样本处理：将血清样本与提取试剂按照一定比例混合，待沉淀形成后，离心分离，收集上清液。
4. 加入试剂：将上述收集到的上清液分别与试剂液按照一定比例混合，充分搅拌，反应一定时间。
5. 测定吸光度：将反应溶液分别放入光度计中，设置为适当的波长，记录吸光度值。
6. 绘制标准曲线：将实验得到的吸光度值与对应的标准溶液的浓度进行配对，绘制标准曲线。
7. 测定血清样本：将血清样本与试剂按照一定比例混合，重复步骤5，测定吸光度。
8. 计算血清蛋白含量：根据标准曲线，将血清样本的吸光度值转换为蛋白质的浓度。
实验结果与讨论：根据实验步骤进行操作并记录各个标准溶液和血清样本的吸光度值。
根据标准曲线计算出血清样本中蛋白质的浓度。
讨论血清蛋白含量的变化情况，可以比较不同个体、不同年龄段或不同疾病状态下的血清蛋白含量是否存在显著差异。
并结合其它相关指标进行综合分析与判断。
结论：根据实验数据计算出的血清蛋白质含量为X g/L，证明了血清样本中存在蛋白质，并可作为评估营养状况的指标。
实验结果进一步揭示了血清蛋白质含量在不同条件下的变化情况，为疾病诊断、个体健康管理等提供了一定的参考依据。
实验一血清蛋白质测定(范玉平)
【试剂与器材】
1．6 mol/L NaOH溶液 2．双缩脲试剂 3．双缩脲空白试剂 4．60～70g/L蛋白质标准液 5．仪器 分光光度计。
19
【试剂与器材】
大试管
1ml吸管 5ml吸管 洗耳球
4支 ３支
2支 １只
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操作步骤
1.取试管4支，标明测定管（U）、标准管 （S）、标本空白管（B）、试剂空白管（ RB）。
【注意事项】
4. 实验证明，BCG不但与白蛋白呈色，而且与血 清中多种蛋白质成分呈色，其中以α1-球蛋白、 运铁蛋白、结合珠蛋白更为显著，其反应速度较 白蛋白稍慢。由于在30s内呈色对白蛋白特异， 故BCG与血清混合后，在30s读取吸光度，可明 显减少非特异性呈色反应。为了减少本法基质效 应的影响，最好用参考血清作标准。
【方法学评价】
1.本法操作简便、快速，胆红素和一般脂血对测定 无明显干扰。
【方法学评价】
2.血红蛋白和BCG产生与白蛋白相等的颜色强度， 血红蛋白在1g/L以下无明显干扰，2g/L使吸光度 增高3.2%，3g/L使吸光度增高7.4%，4g/L使吸 光度增高7.7%，5g/L使吸光度增高8.8%，所以 溶血标本不宜做BCG法白蛋白测定。
二 物理法：
又可分为紫外吸收法、折射法和重量法 等。除紫外吸收法外，其他方法现已很少 使用或被淘汰。
三 蛋白质与染料结合的方法
是比较灵敏而特异的一类方法。用的较多的染料有丽春红 、考马斯亮蓝G250和邻苯三酚红钼。丽春红蛋白结合法 测得的结果与凯氏定氮法相符，并且显色后在室温可稳 定24小时；考马斯亮蓝G250结合蛋白法灵敏度高，特异 性强，操作简便，广泛用于尿蛋白，脑脊液蛋白及各种 微量蛋白的检测，但该方法测定蛋白浓度的线性范围不 宽，与白、球蛋白反应的灵敏度不同，反应强度亦受温 度的影响，且比色杯吸附色素而干扰测定，不能用于自 动化分析仪，因此该法的应用受到了一定的限制；邻苯 三酚红钼络合显色法克服了考马斯亮蓝G250结合蛋白法 的上述缺点，且具有简便、稳定等优点，可用于自动化 分析仪。
生物化学实验2.双缩脲测定血清蛋白质含量
标准溶液
实验原理
绘制出蛋白质标准溶液的标准曲线：以吸光 度为纵坐标，蛋白质浓度（mg/mL）为横坐 标，绘制标准曲线。
在相同的实验条件下，测定未知蛋白质含量 的血清样品溶液，在540nm处的吸光度，查 标准曲线求得样品的蛋白质浓度（g/L）。
试剂和仪器
(一）试剂 1、双缩脲试剂：取3g硫酸铜，500mL蒸馏水 溶解，加9g酒石酸钾钠、5g碘化钾，加入 100mL6mol/L氢氧化钠，用蒸馏水稀释到 1000mL，贮存于塑料瓶中，避光保存。 2、0.9%（W/V)NacL溶液 3、小牛血清 4、蛋白质标准溶液
(二）仪器 恒温水浴锅、722型可见分光光度计、
刻度吸量管、微量移液器、试管、试管架
3 4 5 6
蛋白质标准液
-
（10g/l）
0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
0.9%Nacl 双缩脲
蛋白质含量
1.0 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 -
实验结果与分析
查标准曲线即可得出蛋白质的含量（g/L）。
蛋白质浓度(g/L)= 蛋白质含量(mg)×10-3 0.1ml×10-3
临床意义
正常值：60 ～ 80g/L 血浆总蛋白上升
常见于脱水导致的血浆浓缩，例如急性失 水、休克、肾上腺皮质功能不全等 血浆总蛋白下降
血浆水分增加，如水钠潴留 长期消耗性疾病，如肺结核、肿瘤等 肝功能损伤、肾功能损伤等
试剂(mL） 血清
0.9%Nacl 双缩脲
测定管 0.1 0.9 4.0
空白管 1.0 4.0
混匀后，37℃水浴中放置20分钟，以空白管调零， 测定其540nm波长处的吸光度。
722G型分 光光度计
比色皿
乳与乳制品常规理化指标检验蛋白质含量的检测
乳与乳制品常规理化指标检验蛋白质含量的检测YLNB 2.8一、凯氏定氮仪常量检测法1.原理样品中加入催化剂和浓硫酸，经加热后硫酸分解成亚硫酸酐、水和氧。
有机物被氧化为二氧化碳和水，而蛋白质的氨态氮与过量的硫酸反应转变为硫酸铵，硫酸铵在碱性溶液中进行蒸馏。
将蒸馏出来的氨用硼酸吸收，再用酸标准溶液滴定，根据酸标准溶液的用量和浓度计算出蛋白质含量。
2.试剂所有试剂，如未注明规格，均指分析纯；实验用水，如未注明其他要求，均指三级水。
2.1浓硫酸2.2硫酸钾2.3硫酸铜2.4氢氧化钠溶液：400g/L2.5硼酸溶液：30g/L2.6甲基红一澳甲酚绿混合指示剂：用体积分数为95%的乙醇，将澳甲酚绿及甲基红分别配成1g/L的乙醇溶液，使用时按1g/L澳甲酚绿：1g/L甲基红为5： 1的比例混合。
2.7硫酸标准溶液：c (H+)=0.1000±0.005mol/L2.7.1标准溶液的配制：取3ml浓硫酸加到15ml水中，冷却后洗入1000ml容量瓶中，定容。
2.7.2标准溶液的标定：（见GB/T601-2002 ）2.7 3硫酸铵：干燥后最低含量99.9%,使用前直接将硫酸铵在102±2℃干燥至少2h，在干燥器中冷却至室温。
3.仪器及器材3.1凯氏定氮仪，包括消化炉、废气排放装置、蒸馏单元及电位滴定仪3.2消化管，适用于凯氏定氮仪（3.1）3.3接收瓶：300ml三角瓶或烧杯4.方法4.1样品称取4.1.1原料奶和纯牛奶样品：称取约5g4.1.2乳饮料：称取约8g4.1.3冰淇淋：称取约5g4.1.4乳粉：称取约0.5g4.2测量4.2.1消化4.2.1.1将上述样品称入消化管中，同时称取5g硫酸钾，0.5g 硫酸铜，然后加入15-20ml浓硫酸，将消化管放入消化炉中，将温度旋钮设定在大约6档左右，连接好排气装置并打开开关，开始进行消化，消化30分钟或直到白烟消失后，将消化炉旋钮调节至9档，继续消化直到消化液透明。
乳中蛋白质含量测定(精)
实训十九 鲜牛乳中蛋白质含量测定
第8 页
三、实训内容
（二）分析步骤 3、蒸馏：向接收瓶内加入10.0mL硼酸溶液及1滴～2滴混合指示液，并使冷凝管的下端插入液面 下，根据试样中氮含量，准确吸取2.0mL～10.0mL试样处理液由小玻杯注入反应室，以10mL水洗涤 小玻杯并使之流入反应室内，随后塞紧棒状玻塞。将10.0mL氢氧化钠溶液倒入小玻杯，提起玻塞使其 缓缓流入反应室，立即将玻塞盖紧，并加水于小玻杯以防漏气。夹紧螺旋夹，开始蒸馏。蒸馏10min 后移动蒸馏液接收瓶，液面离开冷凝管下端，再蒸馏1min。然后用少量水冲洗冷凝管下端外部，取下 蒸馏液接收瓶。 4、滴定：将洗净的滴定管用滴定管夹夹住固定于滴定架台上，装好已标定的盐酸或硫酸标准溶液， 滴定接受瓶的吸收液至溶液颜色由蓝绿色变为酒红色时为终点，记录消耗的标准溶液的浓度和体积。
（五）精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。
实训十九 鲜牛乳中蛋白质含量测定
第5 页
二、实训要求
（二）仪器和设备要求
1、天平：感量为1mg。
2、全套凯氏定氮装置：如图2所示。
实训十九 鲜牛乳中蛋白质含量测定
第6 页
三、实训内容
（一）原理 牛乳中的蛋白质在催化加热条件下被分解，产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游 离，用硼酸吸收后，在用硫酸或盐酸标准滴定溶液滴定，根据酸的消耗量得到样品中的氮的含量，乘 以换算系数，即为蛋白质的含量。 （二）分析步骤 1、试样处理：称取充分混匀的牛乳试样10g～25g（约相当于30mg～40mg氮），精确至0.001g， 移入干燥的100mL、250mL或500mL定氮瓶中，加入0.2g硫酸铜、6g硫酸钾及20mL硫酸，轻摇后于 瓶口放一小漏斗，将瓶以45°角斜支于有小孔的石棉网上。小心加热，待内容物全部炭化，泡沫完全停 止后，加强火力，并保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿色并澄清透明后，再继续加热0.5h～1h。取下
动物生物化学实验教程正式
动物生物化学实验教程正式实验一血清蛋白质含量测定牛血清蛋白：BSA。
血浆：指血液的液体成分，淡黄色（因含胆红素）。
含白蛋白、球蛋白、纤维蛋白原。
血液经抗凝处理、离心沉淀后，获得的液体部分。
血清：血液凝固后，释出的液体。
不含纤维蛋白原及游离钙离子。
蛋白质定量分析是动物生物化学和其他生命科学研究中经常用到的实验项目。
蛋白质是生物体内最为重要的生物大分子之一，其种类繁多、结构多样、功能各异，而且分子量相差很大，所以很难建立一个理想而通用的蛋白质定量分析方法。
目前测定蛋白质含量的方法很多，常用的测定方法有Folin—酚法（Lowry法）、紫外吸收法、凯氏定氮法、考马斯亮蓝染料结合法等，每种方法在实践中都有其优点和局限性。
本实验采用考马斯亮蓝染料结合法（Bradford法）。
(灵敏度最高)一、实验目的1．掌握分光光度法测定的原理，分光光度计的结构和基本操作要点（光源-单色器-样品室-检测器-显示器）2．掌握考马斯亮蓝染料结合法测定蛋白质含量的原理和操作方法3．掌握微量移液器的使用方法4．了解蛋白质含量测定中标准曲线的制作方法二、实验原理染料考马斯亮蓝G-250（R250，结合后可以解离）在游离状态下呈红色，最大吸收峰为465nm。
它能与蛋白质的疏水微区结合，形成蓝色复合物，该复合物的最大吸收峰为595nm，在一定浓度范围内（为什么在一定范围内），其吸光度值与蛋白质含量成正比，故可用于蛋白质含量的测定。
三、实验操作步骤表1-1考马斯亮蓝染料结合法测定蛋白质含量试管号稀释的血清样品（mL）0.9%NaCl溶液（mL）考马斯亮蓝G-250溶液（mL）空白管-0.15样品管0.1-5室温静置5min，于波长595nm处，以空白管调“0”，测定样品管的吸光度值，查标准曲线，吸光度测定值所对应的蛋白质浓度就是稀释样品的蛋白质含量，然后乘以血清的稀释倍数（10倍），可得血清中蛋白质的含量。
四、实验试剂1．考马斯亮蓝G-250溶液（0.01%）：称取考马斯亮蓝G-250100mg，溶于50mL95%乙醇中，再加入100mL85%(W/V)浓磷酸，然后用蒸馏水定容至1000mL，置棕色瓶过夜（如有不容物，可用二层滤纸过滤）。
01 生物化学实验--凯氏(Kjeldahl)微量定氮法测定血清蛋白质含量
凯氏（ Kjeldahl ）微量定氮法测定血清蛋白质含量【目的】1 ．掌握微量凯氏定氮法的操作技术，包括未知样品的消化蒸馏、滴定及其含氮量的计算等。
2 ．熟悉微量凯氏定氮法的原理。
【原理】凯氏定氮法是蛋白质含量测定的经典方法，它是根据蛋白质分子中含氮量来测定的，各种蛋白质含氮量比较近似，平均约为 16 ％，即 1g 氮相当于 6.25g 蛋白质。
由测定出的氮量即可换算出蛋白质含量。
血清蛋白质或其它有机含氮物与浓硫酸加热进行消化 ( 氧化 ) 时，其中碳、氢、氧元素分别被氧化为二氧化碳和水，而氮原子则转变成氨，后者与硫酸结合生成硫酸铵，留在溶液中，为了加速有机物质的氧化分解，在消化时加入硫酸铜做为催化剂，加入硫酸钾以提高消化液的沸点。
硫酸铵与氢氧化钠作用，放出氨，通过水蒸气蒸馏将氨带入接收瓶中被硼酸溶液吸收，使溶液中氢离子浓度降低，指示剂颜色发生改变，用已知浓度的标准盐酸滴定，直至原来溶液中氢离子的浓度恢复，即指示剂变为原来的颜色。
根据所消耗的标准盐酸量，即可计算出样品中的总氮量。
化学反应式如下：1 ．消化含氮化合物 +H 2 SO 4 —→CO 2 ↑+H 2 O +(NH 4 ) 2 SO 4 +SO 2 ↑2 ．蒸馏(NH 4 ) 2 SO 4 + 2NaOH—→2NH 4 OH+Na 2 SO 4NH 4 OH—→NH 3 ↑+ H 2 O3NH 3 +H 3 BO 3 —→(NH 4 ) 3 BO 33 ．滴定(NH 4 ) 3 BO 3 +3HCl—→3NH 4 Cl+H 3 BO 3以上测定为样品中的总氮量，由总氮量减去非蛋白氮，即为蛋白质含氮量，再乘以 6 . 25 即为血清蛋白质含量。
【器材】1 ．电炉2 ．铁三角架3 ．酒精灯4 ．锥形瓶5 ．消化管（凯氏烧瓶）6 ．滴定管7 ．微量凯氏定氮器8 ．刻度吸量管9 ．玻璃珠10 ．漏斗11 ．血清【试剂】1 ．硫酸钾粉末2 ． 12 . 5 ％硫酸铜水溶液3 ．浓硫酸4 ． 2 ％硼酸水溶液5 ．混合指示剂取 0 . 1 ％溴甲酚绿乙醇溶液 10ml 与 0 . 1 ％甲基红乙醇溶液 4ml 混合6 ． 30 ％氢氧化钠溶液7 ． 0 . 0lmol / L 盐酸标准溶液【操作】一、消化取消化管二支，标明测定管与空白管，按下表进行操作：混匀，置于电炉上加热消化（图 3-1 ），开始有水蒸气逸出，继而溶液呈现棕色并冒出白烟 (SO 3 ) ，此时火力应减小，并在管口上盖一小漏斗，以免硫酸损失过多，再继续消化至溶液变为澄清的蓝绿色，即消化完毕 ( 此过程约需 25 分钟左右 ) ，冷却后加水 3 . 8ml ，使总量成为 5ml( 内有 1 . 2ml 硫酸 ) ，混匀，准备蒸馏。
生物化学实验 血清、乳蛋白含量测定
• 三试剂：
1.标准蛋白：1mg/ml BSA。
2.蛋白显色剂：溶解考马斯亮兰G-250 100mg于50ml 95%酒精中，再加入100ml 85%的磷酸，然后用蒸馏水稀释到1L。
3.样品液：蛋白稀释液(稀释50倍)
• 四.操作： 取4只干净试管，分别标记为
“空白、标准、样品1、 样品2”。依次加入蒸 馏水、标准蛋白、稀释的样品各50 ul，然后每 管中均加入蛋白显色剂2.5 ml，混匀，2 min后 比色，记录各管的A595nm值。
• 五.结果及分析：
• 蛋白中蛋白质含量:
• C测=0D测/0D标× C标 单位:(g/100ml)
血清、乳蛋白含量测定
• 一.目的:学会用染料结合分析法测定血清 总蛋白的含量,掌握比色分析的方法及原理。生颜色反应，最大吸收波长为595 nm。根据蛋白质溶液的A595值(吸光值)与蛋白质 浓度成线性正比的特点测定蛋白质含量。实验时 以已知浓度的牛血清白蛋白（BSA）溶液为标准。
血清总蛋白及白蛋白测定
的含量。
紫外吸收法可测定0.1-0.5mg/ml的蛋白质溶液，此操作简便，测定 迅速，不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。因此，此法在蛋白质的
制备中广泛应用。 此法的缺点是：（1）对于测定那些与标准蛋白质
中酪氨酸和色氨酸含量差异较大的蛋白质，有一定的误差；（2）若 样品中含有嘌呤，嘧啶等吸收紫外线的物质，会出现较大的干扰。
思
考
问题：如何测定血清中蛋白质的总浓度？蛋白质的 浓度测定方法？ 双缩脲法 酚试剂(Follin-酚)法测定蛋白质 紫外吸收法测定蛋白质 凯氏(Kjeldahl)微量定氮法 考马斯亮蓝G—250染色法 如何测定血清中某一种蛋白质的浓度？ 分离后再测定
Folin-酚试剂法测定蛋白质含量是双缩脲法的发民，所用
的试剂是由两部分组成的。第一部分相当于双缩脲试剂， 第二部分为Folin-酚试剂(磷钨酸和磷钼酸混合液)。因此， 反应的程序也是分两步进行的。第一步相当于双缩脲反应， 在碱性条件下蛋白质中的肽键与Cu2+作用生成络合物；
第二步是基于Folin试剂(磷钼酸和磷钨酸试剂)在碱性条件
下极不稳定，易被酚类化合物还原生成钼蓝和钨蓝混合物 (呈蓝色反应)。由于蛋白质中含有带酚羟基的酪氨酸，故
Hale Waihona Puke 时，白/球比值变小，甚至倒置。
血清总蛋白增高： （1）血液浓缩，导致总蛋白浓度相对增高：严重腹泻、呕吐、 高热时急剧失水，血清总蛋白浓度可明显升高。休克时，由于 毛细血管通透性增加，血液中水分渗出血管。血液可发生浓缩， 慢性肾上腺皮质功能减退的患者，由于丢失钠的同时伴随水的 丢失，血浆也可出现浓缩现象。 （2）血浆蛋白质合成增加：主要见于球蛋白合成增加，多发 性骨髓瘤患者。 血清总蛋白降低： （1）血液稀释，导致总蛋白浓度相对降低：如静脉注射过多 低渗溶液或因各种原因引起的钠、水潴留。 （2）摄人不足和消耗增加：食物中长期缺乏蛋白质或慢性胃 肠道疾病所引起的消化吸收不良，因患消耗性疾病，如严重结 核病，甲状腺功能亢进，恶性肿瘤等，均可造成血清蛋白浓度 降低。 （3）蛋白质丢失：严重烧伤时大量血浆渗出，大量失血，肾 病综合征时大量蛋白尿，溃疡性结肠炎时肠道长期丢失一定量 的蛋白质，这些病理改变均可使血清总蛋白浓度降低。
乳与乳制品常规理化指标检验蛋白质含量的检测
乳与乳制品常规理化指标检验蛋白质含量的检测乳与乳制品中常见的蛋白质种类包括酪蛋白、乳清蛋白和乳酸菌蛋白等。
其中，酪蛋白是乳与乳制品中最主要的蛋白质组分，占据了乳中总蛋白质的75%以上。
乳清蛋白是乳与乳制品中的另一主要蛋白质成分，它具有良好的水溶性和生物利用度。
常规理化指标检验蛋白质含量的方法主要有几种，包括Kjeldahl法、琼脂糖凝胶电泳和紫外吸收光谱法等。
Kjeldahl法是一种用于测定有机氮含量的经典方法，也是乳与乳制品中蛋白质含量检测的常用方法之一、该方法的原理是通过将样品中的蛋白质分解为氨基酸，然后将氨基酸转化为氨，并以氨的形式测定样品中的氮含量。
通过乘以适当的因子，可以计算出样品中蛋白质的含量。
琼脂糖凝胶电泳是一种常用的蛋白质分析方法，可以用于检测乳与乳制品中蛋白质的组成和含量。
该方法利用蛋白质在电场中的迁移速率与其分子量之间的关系，通过测定蛋白质在凝胶上的迁移距离，可以推断出蛋白质的分子量和含量。
紫外吸收光谱法是一种基于蛋白质在特定波长下具有吸光性的原理，通过测定吸收光谱的变化来确定样品中蛋白质的含量。
这种方法简单、快速，并且无需破坏性地处理样品，因此在乳与乳制品中蛋白质含量的检测中得到了广泛应用。
除了上述常见的方法外，还有其他一些新型的蛋白质检测方法正在不断发展中，例如质谱法、免疫测定法等。
这些方法具有高灵敏度和高选择性，能够准确地测定乳与乳制品中蛋白质的含量。
在实际的生产和质量控制中，对乳与乳制品中蛋白质含量的检测是至关重要的。
通过对产品中蛋白质含量的监测，可以及时发现和解决质量问题，确保产品的标准化和稳定性。
总之，常规理化指标检验乳与乳制品中蛋白质含量的方法多种多样，每种方法都具有其特定的优点和适用范围。
选择适当的方法，并根据实际情况进行合理的检测，对于乳与乳制品的生产和质量控制具有重要的意义。
生物化学实验(食品)
电磁炉水浴锅
电子天平
需冷藏、冷冻试剂和材料放在冰柜和冰箱
注意
生物材料及试剂在冰箱中，取完放回原处。 请勿将固体物质扔进水槽，台面上有垃圾盆。 水槽上有蒸馏水管，节约使用。 用过器皿立即用水洗净。 做完实验清理台面，将实验用具清洗后放入 洗涤柜。
实验报告
一、目的
二、原理（必须写清楚！）
三、实验材料 四、实验步骤 五、结果与分析
二、pH对酶活性的影响 作。
管号 0.5%淀粉 pH 5.0 pH pH 6.8 pH 8.2 稀释唾液（滴）
取试管5支，编号， 按下表操
1 2 2 2 2 10 10 10 2 2 3 2
现象
摇匀，37℃水浴中保温。每隔l分钟从pH 6.8的管中（2 号）取出1滴于白瓷板上，加碘液1滴，观察淀粉水解的程度。 待颜色不变时，向各管中加碘液1-3滴。观察颜色，比较水 解程度，做出解释。
2、酶促反应
试管 号 1 2 1.5%琥珀酸 1%丙二酸 蒸馏水 心脏提取 液（滴） 钠（滴） 钠（滴） （滴） 5 5（煮沸） 5 5 —— —— 25 25 0.02%甲烯 现象 蓝（滴） 2 2
3 4
5 5
5 25
5 5
20 ——
2 2
加好混匀，立即在各管中加入一层（约8滴）液体石蜡油，置 37度恒温水浴保温30分，观察各管颜色变化，分析原因。然后用力 振摇1号管，观察变化记录并解释。
沉淀
醇醚混合物洗2次
沉淀
晾干，鉴定
清液
弃掉
2、酪蛋白的性质鉴定
（1）溶解度观察
溶液
H2O 10%NaCl 0.5%Na2CO3 0.1M NaOH 0.2%HCl 饱和Ca(OH)2
动物生物化学实验全文编辑修改
对消法消除系统误差
进行两次测量，使两次读数时出现的系统误差大小相等、符号相反。两次测量值的平均值作为测量结果，以消除系统误差。 例如，由于仪器灵敏度的限制，测量仪器的旋钮由右边调近测量值与由左边调近测量值的结果往往不同。这时，可取两个读数的平均值作为测量值。
系统误差的消除很难找到一个普遍有效的方法。这是因为造成系统误差的各个因素，没有内在的联系。要克服它们，只能具体问题具体分析。
五、实验室安全知识简介
（一）实验室安全
1. 安全用电2. 水火无情3. 严防中毒
4. 避免伤害5. 生物危害6. 射线伤害
（二）实验室灭火
1. 切断室内所有电源，火源2. 报警3. 导线着火时，切断电源或使用四氯化碳灭火器，不能用水及二氧化碳灭火器，以免触电4. 可燃性液体着火时，可用湿布或沙土覆盖，隔绝空气灭火。不能用水灭火，这样会扩大燃烧面积。5. 金属钠着火时可用砂子覆盖6. 衣服着火切忌奔走，应卧地滚动灭火。
离心的基本原理
相对离心力： 离心力常用地球引力的倍数来表示，因而称为相对离心力 “ RCF ”。或者用数字乘“g”来表示。 相对离心力是指在离心场中，作用于颗粒的离心力相当于地球重力的倍数，单位是重力加速度“g” （980cm/sec2）， 相对离心力RCF可用下式计算： RCF = 1.119×10－5×(rpm)2 r ( rpm — revolutions per minute每分钟转数，r/min )
动物生物化学实验
动 物 生 物 化 学 实 验
实验一 实验室基本知识实验二 氨基酸纸层析实验三 血清蛋白含量测定实验四 影响酶活性的因素实验五 脂质的薄层层析实验六 凝胶层析法基本练习实验七 血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳实验八 动物组织中DNA提取
14 血清总蛋白、白蛋白测定
三、操作步骤
加入物（ml） B
血清
/
标准液
/
双缩脲试剂 3.0
S×2 /
0.05 3.0
U×2 0.05
/ 3.0
混匀，37℃，10分钟，540nm处 比色，1cm光径比色杯，B管调零
注： 1.非严重黄疸、脂血及高脂血 症血清不用做血清自身对照管。
2.可以用蒸馏水调零，目的是检 验各个试剂的好坏
四、结果 Au
血清总蛋白（g/L） = —— X 60 As
五、正常参考范围 60-80g/L
六、临床意义 1、 总蛋白浓度升高 （1）蛋白质合成增加：大多见于多发性
骨髓瘤患者 （2）血浆浓缩，如急性失水、外伤性休
克、慢性肾上腺皮质功能减退。
2、 总蛋白浓度降低 （1）蛋白质合成障碍：肝功能严重受
简单、试剂易得，但影响因素 太多。
血清总蛋白双缩脲测定法
一、原理：蛋白质中的肽键（-CONH-） 在碱性环境中能与铜离子作用产生紫红 色络合物。
此反应和2个尿素分子缩合后生成的 双缩脲（H2N-OC-NH-CO-NH2）在碱性 环境中与铜离子作用产生紫红色络合 物的反应相似，故称为双缩脲反应。
颜色的深浅在一定浓度范围内与 蛋白质含量成正比，经与同样处理的 蛋白标准液比较，即可求得蛋白质含 量
（三）、 酚试剂法 运用蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸
残基能还原磷钨酸-磷钼酸试剂生成钼蓝 来测定蛋白质的浓度。
改良法：在酚试剂中加入碱性铜离 子。集中了双缩脲法和酚试剂法的优点
灵敏度高，但受许多还原物质的 干扰，限制了它在临床上的应用。
（四）、 紫外分光光度法 蛋白质分子中的酪氨酸和色氨酸
残基在280nm处有一吸收峰，可用于 蛋白质含量的测定。
生物化学实验2.紫外法测定血清蛋白质含量
三、试剂和仪器
(一）试剂 1、0.9%Nacl溶液 2、小牛血清
(二）仪器
754型紫外分光光度计、刻度吸量管、微量移
液器
四、实验步骤
1、稀释血清
准确吸取0.1mL血清，置于50mL容量瓶中， 用0.9%Nacl溶液稀释至标准刻度（即500倍）。
利用吸光度值计算出蛋白质浓度。
蛋白质浓度(mg/mL) =（1.45×A280 – 0.74×A260）×500 =（1.55×A280 – 0.76×A260）×500
2、测定吸光度
检查→开机→预热（30min）→ 设置波长→放入比色皿
→校正仪器（开门调0关门调100）→测定→收整
在紫外分光光度计上，将稀释的血清 置于比色皿中，以0.9%Nacl溶液作为空白 对照，分别在260nm和280nm波长下，读取 A280和A260，带入公式计算蛋白质浓度。
五、结果与分析
紫外分光光度法测定蛋白质含量
研究对象
血清总蛋白 •正常值：60～80g/L •血浆总蛋白上升
常见于脱水导致的血浆浓缩，例如急性失水、休克、 肾上腺皮质功能不全等 •血浆总蛋白下降 血浆水分增加，如水钠潴留 长期消耗性疾病，如肺结核、肿瘤等 肝功能损伤、肾功能损伤等
一、实验目的
1、掌握紫外分光光度法测定血光度计的使用方法。
二、实验原理
含有共轭双键的色氨酸、酪氨 酸对紫外光有较强的光吸收。其 吸 收 峰 在 280nm 左 右 ， 以 色 氨 酸 吸收最强。
大多数蛋白质含有这两种氨基 酸残基，且含量比较接近，因此 可利用此性质采用紫外分光光度 法测定蛋白质的含量。
乳中蛋白质含量测定(精)
实训十九 鲜牛乳中蛋白质含量测定
第 12 页
三、实训内容
（四）说明及注意事项 1、消化时不要用强火，应保持和缓沸腾，注意不断转动凯氏烧瓶，以便利用冷凝酸液将附在瓶壁 上的物质洗下并保持消化完全。 2、样品中若含脂肪较多时，消化过程中易产生大量泡沫，为防止泡沫溢出瓶外，在开始消化时应 用小火加热，并不断摇动。 3、蒸馏装置不得漏气。 4、蒸馏完毕后，应先将冷凝管提离液面清洗管口，在蒸馏1min后关掉热源，否则可能造成吸收液 倒吸。
三、实训内容
（二）分析步骤 6、蒸馏瓶的洗涤 在进行样品溶液或空白溶液的重复测定操作之前。应先清洗的蒸馏系统。方法如下： 蒸馏步骤3 完毕后，将火源移去时，蒸馏瓶内的废液立即流到蒸馏瓶外侧夹层内，可由出水口经排水管排出。把 装有蒸馏水的烧杯置于冷凝管下方，并将冷凝管下端出口插入水的液面以下，关闭进水口、出水口和 进样口。 加热夹层的水至沸腾大约1min，移去火源，烧杯中的蒸馏水被吸入而流到蒸馏瓶内，再流至蒸馏 瓶外侧夹层，由出水口经排水管排除。按此方法重复洗涤2～3次。
放冷，小心加入20mL水。放冷后，移入100mL容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，
再加水至刻度，混匀备用。同时做试剂空白试验。
实训十九 鲜牛乳中蛋白质量测定
第7 页
三、实训内容
（二）分析步骤
2、测定：按图2装好定氮蒸馏装
置，向水蒸气发生器内装水至2/3处， 加入数粒玻璃珠，加甲基红乙醇溶 液数滴及数毫升硫酸，以保持水呈 酸性，加热煮沸水蒸气发生器内的 水并保持沸腾。
实训十九 鲜牛乳中蛋白质含量测定
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三、实训内容
（二）分析步骤 5、同时作试剂空白 按分析步骤3用空白液代替样品溶液进行蒸馏，再滴定空白吸收液。 重复样品溶液和空白液的测定操作，样品溶液和空白液所消耗用的标准酸体积都分别去其2次以上 滴定体积的平均值。
生物化学--实验三血清总蛋白的测定
实验三 血清总蛋白的测定 及其计量反应曲线的制作【目的要求】1.双缩脲法测定蛋白质含量的实验原理、关键技术和特点意义。
2.熟悉双缩脲法测定蛋白质的剂量反应曲线的制作方法与原则*3.熟悉721分光光度计的使用和常规维护【实验原理】两分子尿素加热脱氨缩合成的双缩脲（H 2N-OC-NH-CO-NH 2），因分子内含有两个邻接的肽键，在碱性溶液中可与Cu 2+发生双缩脲反应 [A]，生成紫红色络合物。
蛋白质分子含有大量彼此相连的肽键（-CO-NH-），同样能在碱性条件下与Cu 2+发生双缩脲反应[B]，生成的紫红色络合物，且在540nm 处的吸光度与蛋白质的含量在10~120g/L据此，对已知系列浓度的蛋白标准液（S1~S5）做双缩脲反应，用其浓度作横坐标，吸光度为纵坐标，即可绘出一条过原点的蛋白质双缩脲反应剂量曲线。
通过此曲线，便可查出测定管的蛋白质浓度，进而求算出标本的总蛋白浓度。
亦可通过测定管吸光度、任一标准管的吸光度和该标准管的蛋白质浓度，算出标本中的总蛋白浓度。
【实验准备】一、器材1.试管及试管架NH 2O=CNH O=C NH 2 NH 2C=O HN C=O H 2NCu 2+ 紫红色络合物［A ］C OHC R C OHC R2.0.2ml微量吸管或200μl微量加液器3.1ml、2ml、5ml刻度吸管4.721型分光光度计5.坐标纸及绘图工具二、试剂1.0.9% NaCl溶液用医用生理盐水代替或按文献自配。
2.6mol/L NaOH溶液称取AR级NaOH 240.0g，溶于约800ml新鲜制备的蒸馏水或刚煮沸冷却的去离子水中，冷却后稀释至1OOO.0ml，贮存于有盖塑料瓶中。
若用非新开瓶的NaOH，须先配成饱和溶液，静置2周左右，使碳酸盐沉淀，其上清饱和NaOH溶液经滴定后，算出准确的浓度再使用。
3.双缩脲试剂称取AR级的结晶硫酸铜（CuSO4·5H2O ）3.0g，溶于新鲜制备的蒸馏水（或刚煮沸冷却的去离子水）500ml中，加入AR级酒石酸钾钠（NaKC4H4O6·4H2O）9.0g，用以结合Cu2+，防止CuO在碱性条件下沉淀，再加入KI 5.0g，防止碱性酒石酸铜自动还原并防止Cu2O的离析。
乳蛋白素的实验报告
一、实验目的1. 掌握乳蛋白素的提取方法。
2. 了解乳蛋白素的纯化过程。
3. 分析乳蛋白素的性质。
二、实验原理乳蛋白素是一种从乳清蛋白中提取的生物活性肽，具有多种生物学功能，如抗氧化、抗炎、抗高血压等。
本实验采用酸沉法提取乳蛋白素，通过盐析、凝胶过滤、离子交换等步骤进行纯化。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：乳清蛋白、硫酸铵、盐酸、氢氧化钠、离子交换树脂、凝胶过滤柱、pH计、离心机、冰箱等。
2. 实验仪器：电子天平、烧杯、移液管、滴定管、酸度计、水浴锅、紫外-可见分光光度计等。
四、实验步骤1. 乳蛋白素的提取（1）称取一定量的乳清蛋白，加入适量的去离子水，搅拌溶解。
（2）用盐酸调节pH至4.5，在室温下静置1小时。
（3）用离心机离心，取上清液。
（4）用硫酸铵饱和溶液调节上清液至饱和，静置过夜。
（5）用离心机离心，收集沉淀。
2. 乳蛋白素的纯化（1）将沉淀溶解于去离子水中，用盐酸调节pH至7.0。
（2）将溶液通过离子交换树脂柱，用去离子水洗涤。
（3）将洗脱液通过凝胶过滤柱，收集洗脱峰。
（4）将收集到的洗脱液用盐酸调节pH至7.0，离心去除杂质。
（5）将离心后的溶液冷冻干燥，得到乳蛋白素。
五、实验结果与分析1. 乳蛋白素的提取通过酸沉法提取乳蛋白素，得到沉淀的乳蛋白素含量较高。
2. 乳蛋白素的纯化通过盐析、凝胶过滤、离子交换等步骤，将乳蛋白素纯化，纯度达到90%以上。
3. 乳蛋白素的性质（1）紫外-可见分光光度法测定乳蛋白素的含量，结果表明其含量较高。
（2）通过SDS-PAGE电泳分析，乳蛋白素呈现单一条带，表明其纯度较高。
（3）通过抗氧化实验，乳蛋白素具有良好的抗氧化活性。
六、实验结论1. 本实验成功提取了乳蛋白素，并通过纯化得到了高纯度的乳蛋白素。
2. 乳蛋白素具有良好的抗氧化活性，具有潜在的应用价值。
3. 本实验为乳蛋白素的提取与纯化提供了可行的方法，为乳蛋白素的研究与应用奠定了基础。
七、实验展望1. 进一步研究乳蛋白素的生物学功能，为乳蛋白素的应用提供理论依据。
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• 一.目的:学会用染料结合分析法测定血清 总蛋白的含量,掌握比色分析的方法及原理。
• 二.基本原理：在酸性条件下，蛋白质与考马斯
亮兰G-250产生颜色反应，最大吸收波长为595 nm。根据蛋白质溶液的A595值(吸光值)与蛋白质 浓度成线性正比的特点测定蛋白质含量。实验时 以已知浓度的牛血/ml BSA。
2.蛋白显色剂：溶解考马斯亮兰G-250 100mg于50ml 95%酒精中，再加入100ml 85%的磷酸，然后用蒸馏水稀释到1L。
3.样品液：蛋白稀释液(稀释50倍)
• 四.操作： 取4只干净试管，分别标记为
“空白、标准、样品1、 样品2”。依次加入蒸 馏水、标准蛋白、稀释的样品各50 ul，然后每 管中均加入蛋白显色剂2.5 ml，混匀，2 min后 比色，记录各管的A595nm值。
• 五.结果及分析：
• 蛋白中蛋白质含量:
• C测=0D测/0D标× C标 单位:(g/100ml)