细胞培养的污染和排除
细胞常见污染情况分析报告
细胞培养常见污染的判别及应对措施2011-01-02 10:19:04| 分类：实验| 标签：污染无菌细胞培养基灭菌|字号大中小订阅一、避免细胞培养污染的措施：污染是细胞培养中一个大敌，一旦污染，前功尽弃！决定要进行细胞培养，首先一定要有强烈的无菌意识！操作中要遵守严格的操作规程，不要怕麻烦，越细心越好！注意以下几点，大部份的污染是可以避免的：1. 每次开始实验前，先用紫外照无菌台和实验室20分，用酒精擦手，台面和不消毒的器械（如移液枪等）；实验中，如允许，尽量多过火，开起或盖盖都靠近火焰或在无菌台深处；使用无菌台后，再用酒精擦台面，紫外照20分！2. 滴管不要接触瓶口，吸取废液及加入新鲜培养基时都要注意不要滴在瓶口上等等。
3. 凡是接触瓶口后都要用酒精灯烧烧。
4. 提取组织时，往往头会距离组织很近，所以带口罩很重要！还要换无菌衣（紫外照过的白大褂）。
5. 注意配制完全培养基时不要发生污染，在使用前一定要做无菌培养，因为一般应用污染后的培养基培养细胞后，很快就会发生特别严重的污染。
6. 操作时一定按照实验室的要求，切忌粗心大意。
7. 使用完的东西尽快移出无菌台！另外无菌台上的器械，试剂摆放，也尽量遵循一定的顺序！依污染可能程度依次向外摆。
二、常见的细胞培养污染：下面是几种细胞培养过程中常见的污染：1. 支原体污染：传说中的黑焦虫，长得暴快。
24小时就满视野都是了。
污染源大多数情况下是培养用血清。
图1 支原体污染的光镜检测（圆圈所示，×10倍）图2 支原体污染的光镜检测（×20倍）图3 支原体污染的荧光检测图4 支原体污染的电镜检测（×30k，煎蛋状和其他形状）图5 支原体污染的电镜检测2. 念珠菌污染：似乎无处不在，而且顽固得很。
长得暴快（12h就能在细胞上面密布）。
培养液澄清。
低倍显微镜下像黑色的沙子铺在细胞上，高倍镜下呈树枝状或葡萄状。
图6 念珠菌污染的光镜检测（低倍镜）图7 念珠菌污染的光镜检测（高倍镜）图8 念珠菌污染的光镜检测（高倍镜）图9 念珠菌污染的检测（革兰氏染色阳性）这么大面积的污染，你可以看看是不是操作上出了问题，要不然就是培养基的问题。
细胞培养污染的途径、危害及预防措施
细胞培养污染的途径、危害及预防措施污染是细胞培养技术中面临的主要问题。
由于每一种细胞有其独特的培养体系，因此污染造成的后果也不尽相同。
某些污染的发生往往难以察觉和检测，而且污染源能长期共存于培养体系中，这类污染事实上大部分被人们忽视了。
培养的细胞作为一个生物体，会对培养环境以及环境中的污染物作出相应的反应，造成培养细胞生物学特性的改变，而对实验结果造成潜在的威胁，而且随着污染时间的延长而增加。
培养环境中的物理、化学及生物因素都可能侵入培养环境造成污染。
由于入侵的微生物在培养体系中不断增殖、代谢，因此生物性的污染对细胞的危害最大。
随着污染微生物的不断增殖，交叉污染的可能性也不断增加。
此外，微生物代谢消耗大量必需的养分，同时产生多种有毒的代谢产物，如酶、抗原及毒素等，进一步对细胞产生毒害作用。
因此，熟悉细胞培养污染的途径及其危害性，建立细胞培养规范的操作方法及规章制度，可以有效地防止污染，保证实验体系的稳定性和可靠性。
1细胞培养基本技术为了减少污染对细胞培养的影响，必须建立细胞冻存库。
细胞冻存库应该分主细胞库和工作细胞库，当需要做实验时从主细胞库中复苏细胞建立工作细胞库。
每一个冻存标本都应明确记录细胞的性质、代数及有无污染。
同时还应建立规范的检测程序进行菌检及细胞鉴定［1］。
为了保证培养细胞系的完整性，必须进行具体的实验记录，应包括以下内容：细胞系的种类及来源、有无污染、细胞代数和倍增时间、以及选择性突变。
具体的记录有利于对细胞的遗传及生理特性在常规传代培养中因突变、污染及各种原因导致的改变进行分析。
经过连续传代培养的细胞与它较早代数的冻存细胞相比，随着培养时间的延长，细胞在适应环境的过程中，其生物特性已发生了改变。
培养的细胞由若干生长速度及活力各异的亚群组成。
随着培养时间的延长，生长速度快及活力高的细胞亚群逐渐占优势，这种选择性趋势会影响整个细胞群的生物特性。
应用不同代数的细胞连续进行实验则结果会发生偏差。
细胞培养中常见的污染的处理
细胞培养中常见的污染情况总结如下:常见的污染如下：1、细菌：细菌在普通倒置显微镜下为黑色细沙状，根据感染细菌的不同，可有不同的外形，培养液一般会浑浊变黄，对细胞生长影响明显。
仔细检查一下器皿的灭菌情况，是否在高压灭菌时放气时间足够，压力足够！尤其是和储存培养液接触的移液管等物品，连续两次污染的话有可能造成储存液污染，一定要注意！下次使用前检查一下培养液是否存在浑浊的现象！可在培养液中加相应的抗生素处理2、霉菌：培养液是清亮的，倒置显微镜下无杂质，37度孵箱培养2-3天，仍清亮，但出现絮状杂质，镜下可见呈细丝状的团状漂浮物，可看到明显的菌丝，细胞仍可生长，但时间长之后，细胞的活力状态变差，用硫酸铜溶液擦拭CO2孵箱内，再把水盘里也加上饱和量的硫酸铜。
或者在培养箱的托盘加入饱和的消毒磷酸氢二钠高盐液体,可以防止霉菌污染。
CO2孵箱被霉菌污染后，可把所有细胞暂时转移，采用过氧乙酸擦洗孵箱（包括隔板，箱壁）。
并把过氧乙酸放置在孵箱内一个小时，使其蒸汽弥漫。
待过氧乙酸的气味消散后，再移入细胞。
孵箱应定期清洁（2月左右），尤其在多雨的季节。
其它培养箱清洗方法是：用84液擦洗－清水擦洗－75%酒精擦洗－紫外灯照。
预防霉菌污染，可在培养基里加3u/ml的两性霉素或制霉菌素或放线菌素D或双抗；但细胞一旦污染，很难挽救，制霉菌素或放线菌素D或双抗都于事无补，建议舍弃该污染细胞。
，将环境彻底消毒，如果所有细胞都污染，可能是系统污染，检查一下培养基和器材，如果只是个别污染，可能是操作问题，就要注意操作3、支原体：黑色的，好象多为多形，培养液一般培养液一般会浑浊，原体感染，国内血清很多都没有做支原体阴性检测，而支原体是牛血清中最常见的微生物之一。
而且它不能用过滤的办法除去。
支原体感染细胞以后，细胞病变不很明显，只是慢慢死去。
用泰乐菌素，兽用支原体病的药，但可用于细胞培养，无任何不良反应。
Sigma公司的使用时用50ug/ml Tylosin培养液培养6天或连续传两代即可清除支原体污染。
细胞培养中的常见问题解决方法
细胞培养中的常见问题解决方法细胞培养是生物医学研究和药物开发中不可或缺的重要工具。
然而，细胞培养过程中常常会遇到一些问题，例如污染、细胞凋亡、不适当的生长条件等。
本文将介绍细胞培养中的一些常见问题以及相应的解决方法。
1. 细胞污染细胞污染是细胞培养中最常见的问题之一。
它可能是由细菌、真菌、酵母、病毒等微生物引起的。
污染会导致细胞生长受阻、实验结果的不可靠以及其他严重后果。
为了解决这个问题，可以采取以下几种方法：- 严格按照无菌操作操作培养细胞。
使用无菌操作条件，包括在无菌环境下穿戴手套、使用消毒液清洗操作台面和器具、对培养皿和培养物进行灭菌处理等。
- 经常检查细胞培养物的外观。
细胞培养物应呈现透明、均匀的状态。
如果有任何可疑的异常，请及时进行检查和处理。
- 使用含有抗生素的培养基。
对于某些细胞株来说，添加适量的抗生素可以阻止细菌等污染物的生长。
2. 细胞凋亡细胞凋亡是正常细胞生命周期的一个重要阶段，但在细胞培养过程中，过量的细胞凋亡会导致细胞数量的减少，对实验结果造成不利影响。
以下是一些常见的细胞凋亡问题及其解决方法：- 减少细胞培养的过度处理。
频繁的细胞移植和传代会导致细胞凋亡增加。
适当延长传代周期，避免过多的细胞移植。
- 提供适当的细胞营养来源。
细胞需要足够的营养物质来维持正常的生长。
不合适的培养基组分或者浓度可能会导致细胞凋亡。
确保培养基中的营养物质符合细胞的需求，并根据细胞株的特点进行相应的调整。
- 坚持细胞培养的无菌操作。
如前所述，细菌或其他微生物的污染会导致细胞凋亡的增加。
通过无菌操作避免细胞污染，继而减少细胞凋亡。
3. pH值失调培养基的pH值是细胞培养中一个重要的生长条件。
pH值的不稳定性会影响细胞的代谢和生长。
以下是一些解决pH值失调的建议：- 定期检测和调整培养基的pH值。
使用pH计或试纸进行测定，及时调整pH值，保持在适宜的范围内。
- 确保培养基的配制正确。
细胞培养基的配制过程中，需要严格按照配方中所指定的浓度和比例添加各种成分。
细胞培养及避免细胞污染的方法
１３ 冷 冻 细胞 的 复 苏 ．
冷冻细胞复苏的原则为快速解冻 ，从液氮 中取 出细胞 冻存 管 之前 应 准备好 ３ ％的温 水 ，冻存 管取 ８ 出后 用 镊子 夹 住 顶端 迅 速 放 入 温 水 中不 停 搅 动 ， 使
菌 的培 养 瓶 中放入 培 养箱 中培养 ，如果 有 污染 则 肉
其迅速融化 ， 目的是使细胞快速通过受损温度 ， 其 尽 量减少对细胞活力的损害。由于冻存液中的二 甲基 亚 砜对 细胞 有 一 定毒 性 ， 因此解 冻 的细 胞应 先 离 心 ，
去 除上 清 （ 即冻 存 液 ）再 向细胞 中加入 新 鲜 的培 养 ， 液 ，吹 吸数 次混 匀细 胞 ，转入 经 ３ ℃预 温 的培养 瓶 ７ 中 。 般细胞 在 复苏后 ４ ８ 时就 可贴壁 。 胞复 苏 一 ～小 细
滤使用的滤器滤膜最好使用一次性 的，如果是反复 使 用的滤器则应在 过滤前 先将滤器和 滤膜高压灭
菌 ， 后在 无 菌操 作 台内进 行过 滤分 装 ， 收 滤液 的 而 接 容 器也 需事 先 高压 灭 菌 。培 养细 胞 过程 中使用 的所 有 实 验 用具 ， 移液 管 、 次 性 枪 头 、 次 性 塑 料离 如 一 一
冻保 存 液 ， 温 待 用 。将 待保 存 的 细胞 离 心 （ ０ 室 ３ ０ ０ 转 以下 ３ ５分 钟 ）去 除 上清 ， — ， 加入 适 量冷冻 保存 液 ，
２２ 细胞 培 养 的 试 剂 和 用品 ．
培养 液 和胰 酶 的配 制 用水 是 三蒸 水 或符 合 培养 细胞标 准 的水 。试 剂 的除菌 方法采 用过 滤除菌 法 ， 过
一
一
以减少 沉淀 。
口 卫 生 防 疫
细 胞 培 养 及 避 免 细 胞 污 染 的 方 法
细胞培养中常见的污染及处理@麦粒
常见细胞污染及其处理方法麦~粒（2012级生物化学与分子生物学专业）摘要：细胞培养是生命科学实验及生物医药产业化中的一项关键技术，细胞污染问题一直是细胞培养中的大敌。
本文综述了细胞培养中污染的类型、处理方法和预防措施等，以期为实验室细胞培养中遇到的细胞污染的解决提供参考。
关键词：细胞培养，细胞污染，支原体污染细胞培养技术是现代生命科学研究中不可缺少的一项基本实验技术，同时也是细胞工程中的核心技术之一。
细胞培养的质量好坏直接关系到实验结果的可靠性与否以及产品质量的合格与否。
在细胞培养中，最基本的原则就是无菌操作，污染是细胞培养最致命的大敌，预防和避免污染是细胞培养成功的关键之一。
特别是对于一些珍贵的细胞株，一旦污染对实验可能就是毁灭性的。
1 污染的类型细胞污染的类型可分为物理、化学、生物三类。
其中化学、生物因素最为常见，物理因素最易被忽视。
1.1物理污染物理性污染通过影响细胞培养体系中的组分，从而影响了细胞的代谢。
最为常见的是温度和辐射（紫外线照射）。
过冷或过热的温度对细胞可引起细胞生理状态的改变，如从冰箱中取出的培养液直接加至37℃培养的细胞中可能会造成细胞应激，影响某些实验现象的观察。
在生物安全柜紫外灭菌时，应当遮蔽对紫外线敏感的试剂，同时普通操作中也要注意对见光易分解的物质进行避光处理。
对于需要使用同位素标记的某些实验，应当注意细胞、试剂周围不能放同位素。
除此之外，有时操作过程中偶尔有异物落入，极易造成污染。
一些小的颗粒状异物作为是微生物污染的载体进入培养液中造成细胞污染。
另外，实验过程中酒精棉球的棉絮、移液器枪头上的某些塑料碎屑等都有可能增加染菌的概率。
1.2化学污染细胞培养中的化学污染大多是由于实验准备或实验过程中造作不当造成的。
在实验准备阶段，细胞培养室中的器皿应做到专用，避免与常用器皿混用。
此外，细胞用器皿洗刷过程中要注意洗刷彻底，不可有洗涤剂等残留。
高压灭菌时应灭菌彻底，并在灭菌后的生物安全柜中打开使用。
细胞培养中的常见问题及解决方法
细胞培养中的常见问题及解决方法细胞培养是现代生命科学研究中常用的实验技术之一，可以用于细胞增殖、分化、转染等研究。
然而，细胞培养过程中常常会出现一些问题，如细胞污染、细胞凋亡和细胞失活等。
本文将讨论细胞培养中的这些常见问题，并提出相应的解决方法。
1. 细胞污染细胞污染是细胞培养中的一大难题。
它可以由细菌、真菌或其他细胞类型的污染引起。
细胞污染会影响实验结果的准确性，并可能导致细胞系的丢失。
为了解决这个问题，我们可以采取以下措施：（1）经常检查细胞培养器具和培养基，确保其无菌；（2）使用抗生素或抗黴剂对培养基进行预处理，以减少污染的风险；（3）定期进行污染检测，例如细胞培养液和工作区的表面。
2. 细胞凋亡细胞凋亡是正常细胞生命周期的一部分，但在细胞培养中，过多的细胞凋亡会导致实验结果的误差。
为了减少细胞凋亡的发生，我们可以考虑以下措施：（1）优化培养条件，包括温度、CO2浓度和培养基配方等；（2）定期检查细胞形态和健康状况，及时处理出现凋亡现象的细胞；（3）使用细胞凋亡检测工具，如Annexin V-FITC/PI染色法，来评估细胞凋亡水平。
3. 细胞失活细胞失活现象在细胞培养中常常发生，可能是由于细胞老化、无营养补充或培养条件不佳等原因引起。
为了避免细胞失活的发生，我们可以尝试以下方法：（1）及时更换培养基，确保细胞获得充足的营养物质；（2）避免过度培养，及时传代细胞；（3）定期鉴定细胞的纯度和活力，并确保培养条件适当；（4）尝试使用细胞增殖激素或生长因子来促进细胞的增殖和存活。
细胞培养中的常见问题并不局限于上述三个，还有其他一些问题，例如细胞出现突变、细胞凝固等。
针对这些问题，我们可以进一步深入研究并寻找解决方法。
同时，注意维持实验室的清洁和规范操作也是解决这些问题的关键。
细胞培养在生命科学研究中发挥着重要作用。
了解并解决细胞培养中的常见问题，有助于提高实验结果的准确性和可重复性。
通过合理的实验设计、严谨的操作和科学的方法选择，我们可以克服这些问题，为细胞培养研究的进展做出贡献。
培育技术中常见的细胞污染处理方法
培育技术中常见的细胞污染处理方法细胞污染是培育技术过程中一个常见而严重的问题。
细胞污染指的是外源性的微生物、真菌、细菌或其他细胞种类在细胞培养中的存在。
细胞污染会对实验结果产生不可预测的影响，甚至使实验失效。
因此，对于细胞污染的处理方法和预防措施的研究非常重要。
本文将介绍一些在细胞培养中常见的细胞污染处理方法。
一、消毒剂处理消毒剂处理是最常见的细胞污染处理方法之一。
消毒剂可以有效杀灭微生物和其他细胞种类，以减少污染。
常见的消毒剂有乙醇、过氧化氢和氯化物等。
在使用消毒剂处理细胞污染时，应选择适当的浓度和处理时间，并确保消毒剂不会对目标细胞产生不良影响。
二、培养基更换培养基更换是另一种常见的细胞污染处理方法。
培养基中添加抗生素可以有效抑制污染微生物的生长。
常用的抗生素包括青霉素、链霉素和庆大霉素等。
更换含有抗生素的培养基可以杀灭或抑制细菌和真菌等微生物的生长，从而有效处理细胞污染。
三、细胞分离细胞分离是一种通过分离感染的细胞来处理细胞污染的方法。
这可以通过细胞离心、细胞分选或免疫磁珠分离等技术来实现。
通过分离感染的细胞，可以有效减少细胞污染，同时保留无污染的细胞进行后续实验。
四、细胞冻存细胞冻存是另一种有效处理细胞污染的方法。
将无污染的细胞分装入液氮等低温环境中冻存，可以有效抑制细菌、真菌和其他细胞种类的生长。
在需要时，可以从冻存样品中恢复细胞，以继续实验。
然而，细胞冻存也存在一定的风险，如细胞冻存过程中可能引起的细胞损伤等问题需要注意。
五、污染原因的分析和改进污染原因的分析和改进是细胞污染处理的重要环节。
通过分析细胞污染的原因，可以采取相应的改进措施来预防细胞污染的再次发生。
污染原因的分析可以包括对实验设备、试剂和操作流程等的检查和评估。
通过对可能存在的问题进行改进，可以有效提高细胞培养的纯度和可靠性。
细胞污染是培育技术中一个常见且严重的问题。
为了有效处理细胞污染，研究并应用适当的处理方法和预防措施是非常重要的。
细胞培养中常见的污染情况、可能原因、解决方法
细胞培养中常见的污染情况、可能原因、解决方法细胞培养中常见的污染情况总结如下:常见的污染如下：1、细菌：细菌在普通倒置显微镜下为黑色细沙状，根据感染细菌的不同，可有不同的外形，培养液一般会浑浊变黄，对细胞生长影响明显。
仔细检查一下器皿的灭菌情况，是否在高压灭菌时放气时间足够，压力足够！尤其是和储存培养液接触的移液管等物品，连续两次污染的话有可能造成储存液污染，一定要注意！下次使用前检查一下培养液是否存在浑浊的现象！可在培养液中加相应的抗生素处理2、霉菌：培养液是清亮的，倒置显微镜下无杂质，37度孵箱培养2-3天，仍清亮，但出现絮状杂质，镜下可见呈细丝状的团状漂浮物，可看到明显的菌丝，细胞仍可生长，但时间长之后，细胞的活力状态变差，用硫酸铜溶液擦拭CO2孵箱内，再把水盘里也加上饱和量的硫酸铜。
或者在培养箱的托盘加入饱和的消毒磷酸氢二钠高盐液体,可以防止霉菌污染。
CO2孵箱被霉菌污染后，可把所有细胞暂时转移，采用过氧乙酸擦洗孵箱（包括隔板，箱壁）。
并把过氧乙酸放置在孵箱内一个小时，使其蒸汽弥漫。
待过氧乙酸的气味消散后，再移入细胞。
孵箱应定期清洁（2月左右），尤其在多雨的季节。
其它培养箱清洗方法是：用84液擦洗－清水擦洗－75%酒精擦洗－紫外灯照。
预防霉菌污染，可在培养基里加3u/ml的两性霉素或制霉菌素或放线菌素D或双抗；但细胞一旦污染，很难挽救，制霉菌素或放线菌素D或双抗都于事无补，建议舍弃该污染细胞。
，将环境彻底消毒，如果所有细胞都污染，可能是系统污染，检查一下培养基和器材，如果只是个别污染，可能是操作问题，就要注意操作3、支原体：黑色的，好象多为多形，培养液一般培养液一般会浑浊，原体感染，国内血清很多都没有做支原体阴性检测，而支原体是牛血清中最常见的微生物之一。
而且它不能用过滤的办法除去。
支原体感染细胞以后，细胞病变不很明显，只是慢慢死去。
用泰乐菌素，兽用支原体病的药，但可用于细胞培养，无任何不良反应。
细胞的细菌、真菌污染及排除
细胞的细菌、真菌污染及排除Edit By Waiting.D真菌污染是细胞培养过程中最常见的一种，尤其在梅雨季节进行细胞培养更易污染。
污染培养细胞的多为烟曲霉、黑曲霉、毛霉菌、孢子霉、白念珠菌、酵母菌等。
霉菌污染后多数在培养液中形成白色或浅黄色漂浮物。
一般肉眼可见，较易被发现，短期内培养液多不混浊，倒置显微镜下可见于细胞之间纵横交错穿行的丝状、管状、及树枝状菌丝，并悬浮飘荡在培养液中。
很多菌丝在高倍镜可见到有链状排列的菌珠；念珠菌或酵母菌形态呈卵形，散在细胞周边和细胞之间生长。
镜下看时，要将培养瓶用酒精棉球擦干净，以防止与瓶外尤其瓶底外面生长的菌丝相混淆。
真菌污染后，细胞生长变慢，但最后由于营养耗尽及毒性作用而使细胞脱落死亡。
真菌污染细菌是一种原核细胞微生物，其大小以微米（μm）计。
常见的污染细菌有革兰氏阴性菌和大肠杆菌、假单胞菌等，革兰氏阴性菌中白色葡萄球菌等比较常见。
一旦发生细菌污染较易发现，多数情况下培养液短期内颜色变黄，表明有大量酸性物质产生，出现明显混浊现象；有时静置的培养液液体初看不混浊，但稍加振荡，就有很多混浊物漂起。
倒置显微镜下观察，可见培养液中有大量圆球状颗粒漂浮。
必要时可取少量培养液涂片染色检查以证实细菌种类；有的培养液改变不明显而又疑有污染，可取出少量培养液用普通肉汤接种或用未加双抗药物的培养液接种，也可取10ml细胞悬液以100rpm离心5min，沉淀中加入无抗生素的培养液2ml，置于37℃培养，24h可得结果。
污染后细胞发生病理改变，胞内颗粒增多、增粗，最后变圆脱落死亡，造成试验失败和细胞株(系)丢失。
细菌污染细菌和真菌污染多在传代、换液、加样等开放性操作之后发生，而且由于增生迅速，多再发生污染48h以内就已明显。
在实验的最初两天密切观察实验样品是否有污染发生，有利于及时采取措施予以补救或排除。
培养细胞一经污染，多数较难处理。
如果污染细胞价值不大，宜弃之；有细胞株留存的或可购置的，可在寻找原因后彻底消毒操作室和二氧化碳培养箱(若发现真菌污染，可在污染孔内加入1mol/L氢氧化钠或硫酸铜溶液处理)（具体操作方法可参考细胞培养污染的预防），复苏或重新购置细胞，再培养。
CELL-污染与排除
3.操作过程中的预防 3.操作过程中的预防
不宜过早开瓶；开瓶后瓶口不能与风向相逆，保持斜立， ① 不宜过早开瓶；开瓶后瓶口不能与风向相逆，保持斜立， 不再使用的培养液应立即封闭瓶口, 不再使用的培养液应立即封闭瓶口,不允许触及器皿的 无菌部分（瓶口及瓶塞内侧）； 无菌部分（瓶口及瓶塞内侧）； ② 开启及关闭瓶口时注意火焰烧灼及火焰附近工作； 开启及关闭瓶口时注意火焰烧灼及火焰附近工作； 应专管专用； ③ 应专管专用； 培养的细胞勿过早暴露于空气中； ④ 培养的细胞勿过早暴露于空气中； 操作时不准交谈、咳嗽； ⑤ 操作时不准交谈、咳嗽； 操作完毕应整理好工作台面，并消毒擦拭工作面， ⑥ 操作完毕应整理好工作台面，并消毒擦拭工作面，关闭超 净工作台。 净工作台。
三.操作 器材和溶液使用前未仔细检查是否污染过 ； 吸管、刀、剪沾染微生物； 瓶口封不严； 培养两种以上细胞，使用同一吸管或营养液。 四.血清 被支原体和病毒污染。
五. 组织
手术中污染； 组织本身带菌； 用碘酒后擦拭不净造成碘污染。
第二节 污染对细胞的影缓慢、分裂相减少、粗糙、轮廓增强。 停止增殖，分裂相消失， 停止增殖，分裂相消失，胞质中出现大量堆 积物，变圆或崩溃从瓶壁脱落。 积物，变圆或崩溃从瓶壁脱落。 污染物不同，对细胞的影响不同。 污染物不同，对细胞的影响不同。
真菌污染
（二）细菌污染
培养液变黄，混浊； 以内很明显; 培养液变黄，混浊；48h以内很明显 细胞很快 以内很明显 崩解死亡。 崩解死亡。 镜下可见菌体。 镜下可见菌体。 污染后细胞发生病理改变， 胞内颗粒增多、 污染后细胞发生病理改变 ， 胞内颗粒增多 、 增 最后变圆脱落死亡， 粗 ， 最后变圆脱落死亡 ， 造成试验失败和细胞 株(系)丢失。 系 丢失。 丢失
常用的细胞培养方法、污染及污染处理
常用的细胞培养方法、污染及污染处理一、本文概述细胞培养是生物学和医学领域中一种重要的实验技术，广泛应用于基础研究和实际应用。
通过模拟细胞在体内生长的环境，细胞在体外得以繁殖、分化并维持其特定功能。
本文旨在概述常用的细胞培养方法，包括培养基的选择、细胞传代、细胞冻存与复苏等，同时探讨细胞培养过程中可能出现的污染问题，包括细菌、真菌和支原体等微生物污染，以及污染的检测和处理方法。
通过本文的阐述，读者可以对细胞培养的基本流程和污染防控有更为全面的了解，为实验操作提供指导和参考。
二、常用的细胞培养方法细胞培养是生物学和医学研究中的核心技术，用于模拟体内环境，研究细胞生长、分化和功能。
以下是几种常用的细胞培养方法：贴壁培养法：这是最常见的细胞培养方法。
细胞在培养瓶或培养板的表面上贴壁生长，形成单层细胞。
这种方法适用于大多数哺乳动物细胞系。
悬浮培养法：某些细胞，如血液细胞、肿瘤细胞和某些干细胞，可以在液体培养基中悬浮生长。
这种方法不需要细胞贴壁，可以方便地扩大细胞数量。
微载体培养法：微载体是一种微小的、可以悬浮在培养基中的颗粒，通常用于大规模细胞培养。
细胞可以在微载体的表面上贴壁生长，从而增加细胞与培养基的接触面积，提高细胞生长效率。
三维培养法：这种方法模拟体内组织的三维结构，使用支架或凝胶等基质支持细胞生长。
它有助于研究细胞间的相互作用和组织的形成。
共培养法：将不同类型的细胞放在同一个培养环境中进行培养，以模拟体内细胞间的相互作用。
例如，将内皮细胞和肿瘤细胞共培养，可以研究肿瘤血管生成的过程。
在进行细胞培养时，需要选择适合细胞类型和实验目的的培养方法，同时严格控制培养条件，包括温度、湿度、pH值、营养成分等，以确保细胞的正常生长和繁殖。
三、细胞培养污染及其影响在细胞培养过程中，污染是一个常见且严重的问题，可能对细胞生长、实验结果和细胞治疗产生负面影响。
污染主要来源于微生物，包括细菌、真菌、支原体和病毒等。
细胞污染原因及处理
细胞污染概述凡混入细胞培养环境中对细胞生存有害的成分和造成细胞不纯的异物都应视为污染，细胞污染不能完全被消除，但能减少其发生的频率和后果的严重性。
细胞污染根据污染源主要可以分为物理性，化学性和生物性污染。
一、物理性污染的来源、危害及预防物理性污染常常被人们所忽视或被笼统地归为化学性污染。
物理性污染通过影响细胞培养体系中的生化成分，从而影响细胞的代谢。
培养环境中的物理因素，如温度、放射线、振动、辐射(紫外线或荧光)会对细胞产生影响。
细胞、培养液或其它培养试剂暴露于放射线、辐射或过冷过热的温度中，可以引起细胞代谢发生改变，如细胞同步化、细胞生长受抑制甚至细胞死亡。
通过实验室的合理设计及建立规范的操作规程，可以减少环境中物理因素对细胞的影响。
孵箱应放在温度较恒定的环境中，周围不能放置能引起机械振动的设备，如离心机。
培养液及培养试剂应放在固定的位置，为避免光照试剂不能放在玻璃门的冰箱中，试剂周围不能放同位素。
培养液从冰箱中取出后应在室温中放置一段时间后再进行实验，以避免过冷的温度对细胞的影响。
二、化学性污染的来源、危害及预防培养环境中许多化学物质都可以引起细胞的污染。
化学物质并不总是抑制细胞的生长，某些化学物质如激素就可促进细胞的生长。
不同细胞对化学物质污染的反应是不一样的。
未纯化的物质、试剂、水、血清、生长辅助因子及储存试剂的容器都可能成为化学性污染的来源。
细胞培养的必需养分，如氨基酸，若浓度超过了合适的范围，也会对细胞产生毒性。
同样，不同细胞系其最佳培养条件下对血清和缓冲液的要求是不一样的，在培养中应严格控制。
玻璃制品清洗过程中残留的变性剂或肥皂(通常残留在瓶盖的内表面)是最常见的化学性污染。
水是唯一一种在凝固时膨胀的化合物。
因此在选择冻存细胞的容器时应考虑到这个因素。
容器因水的膨胀而发生破裂是引起试剂污染的重要原因。
为了避免金属离子、有机分子、细胞内毒素等物质对水的污染，在配制液体，清洗容器时必须使用不含杂质的超纯水。
细胞污染的检测与去除
第二章 动物细胞培养第四节 细胞污染的检测与去除细胞培养最怕的就是细胞污染。
一旦细胞发生污染，轻的，导致实验无法正常进行，严重的，可能会导致细胞株的丢失。
细胞污染：是指细胞培养物中混入培养环境中的对细胞生存有害的成分或造成细胞不纯的异物。
细胞污染的主要途径有：1）空气因素：空气是微生物传播的最主要途径。
在超净工作台、细胞培养室工作时，不戴口罩，不带头套，面对操作间大声讲话、咳嗽等均可能造成细胞污染。
2）器材因素：主要是细胞培养用器材清洗消毒不彻底，致使污染物残留；培养箱没有定期消毒，易使细菌、霉菌孽生，形成污染。
3）操作因素：实验操作者无菌观念不强、操作不规范、甚至使用污染的器具等。
培养两种以上细胞时，交叉使用吸管或培养液瓶等导致细胞交叉污染。
4）血清或培养基：有些血清生产时已被支原体或病毒等污染，有的在培养基配制过程中已经污染，或者在培养基的存放过程中导致了污染。
5）组织样本：尤其在进行原代培养时，组织样本可能带菌，导致污染。
细胞污染的主要类型有（图1）：图1 细胞污染的主要类型第一，细菌污染：细菌是细胞培养中最常见的污染。
细菌种类繁多，形态多样，可呈球状、杆状和螺旋状。
因为细菌的繁殖速度快，被污染后，往往一天内即可通过肉眼观察发现，pH值也会突然降低，培养基的颜色也会很快变化，培养液会变浑浊。
轻微细菌污染的去除: 可使用5-10倍常用抗生素剂量的冲击法，加抗生素作用24-28 h，再换成常规培养液，有时可排除污染，但大部分细胞培养的细菌污染发现时就已经很严重了，无法挽救，最好直接丢弃，防止污染的扩大。
细胞培养细菌污染的主要检测方法有：肉眼观察法；培养检查法；显微镜观察法；PCR检测法等。
1）肉眼观察法：（图2），如图，这是正常生长细胞在不同时间的培养基的颜色，污染细胞培养基会变得浑浊，培养基会快速变黄（因大量细菌繁殖会导致pH 快速下降）。
刚传代细细胞培养中需要传代的细图2 正常生长细胞培养基的颜2）培养检查法：就是用细胞培养上清在无菌琼脂糖培养基平板上划线培养，37℃培养箱中培养过夜，看是否有细菌菌落长出（图3）。
细胞培养的污染
支原体污染：是细胞培养中最常见、不易被察觉和干扰实验结果的一种污染。是 细胞培养研究中重点预防对象。 （1）支原体生物学性状：一种介于细菌和病毒之间的目前所知能独立生活的最小 微生物。可通过除菌滤器。 多形态性，光镜下难以看清其结构。 多吸附于细胞表面或散在细胞之间。 对青霉素普遍有抗药性。
（2）对细胞的影响：多数细胞受污染后，无明显变化，或有微细变化却由于 传代和换液而被缓解。
化学性污染的来源、危害及预防
培养环境中许多化学物质都可以引起细胞的污染。化学物质并不总是抑 制细胞的生长，某些化学物质如激素就可促进细胞的生长。不同细胞对化学
物质污染的反应是不一样的。未纯化的物质、试剂、水、血清、生长辅助因 子及储存试剂的容器都可能成为化学性污染的来源。细胞培养的必需养分， 如氨基酸，若浓度超过了合适的范围，也会对细胞产生毒性。玻璃制品清洗 过程中残留的变性剂或肥皂是最常见的化学性污染。水是唯一一种在凝固时 膨胀的化合物。因此在选择冻存细胞的容器时应考虑到这个因素。容器因水 的膨胀而发生破裂是引起试剂污染的重要原因。为了避免金属离子、有机分 子、细胞内毒素等物质对水的污染，在配制液体，清洗容器时必须使用不含 杂质的超纯水。需要注意的是，超纯水放置过久其纯度会下降。在高压蒸气 灭菌及蒸馏水时水经常被污染，因为高压蒸气锅及纯水机的常规维护后可能 有少量的化学物质残留。为了保证水的纯度，我们应采取措施尽量避免化学 物质的残留。
2、从物品、用品消毒灭菌着手
细胞培养所用物品清洗、消毒要彻底，各种溶液灭菌除菌要仔细， 并在无菌试验阴性后才能使用。
3、操作室及剩余的无菌器材要定期清洁消毒灭菌。
4、 防止细胞交叉污染
在进行多种细胞培养操作时，所用器具要严格区分。
在进行换液或传代操作时，注射器和滴管不要触及细胞培养瓶瓶口，
细胞培养技术中的常见问题与解决方法参考
细胞培养技术中的常见问题与解决方法参考细胞培养是生物学和医学研究中非常重要的一项技术。
然而，在进行细胞培养过程中，我们常常会遇到一些问题。
本文将介绍几个细胞培养中常见的问题，并提供相应的解决方法参考。
1. 细胞污染问题细胞污染是细胞培养中最常见的问题之一。
它可能来源于细胞培养器皿、培养基、试剂、液体气氛等多个方面。
常见的细胞污染类型包括细菌、真菌、酵母菌、支原体、霉菌等。
遇到细胞污染问题时，可以采取以下解决方法参考：- 严格的无菌操作：所有实验应该在无菌条件下进行，使用经过验收的培养器皿和无菌试剂。
- 经常检查和更换培养器皿、培养基：经常检查培养器皿和培养基是否有异常情况，如有污染应及时更换。
- 预防细胞污染：定期进行表面消毒、培养器具灭菌和试剂消毒以预防其他污染来源。
2. 细胞生长问题细胞生长问题是细胞培养过程中常见的一个问题。
主要表现为细胞无法黏附、生长缓慢或停止生长。
解决细胞生长问题的方法参考如下：- 增加培养物中的营养物：根据细胞类型和需求，调整培养基中的蛋白质、维生素和氨基酸等营养物的浓度。
- 提供适宜的培养条件：调整温度、湿度、CO2浓度等环境参数，以提供适宜的生长条件。
- 检查细胞的健康状态：定期检查细胞的形态和健康状况，如发现异常应及时采取措施。
3. 细胞凋亡问题细胞凋亡在细胞培养中可能出现，特别是在长期培养过程中。
细胞凋亡表现为细胞收缩、核染色质浓缩、DNA断裂等特点。
以下是解决细胞凋亡问题的方法参考：- 优化培养条件：提供适宜的培养基、温度、CO2浓度、液面高度等环境因素。
- 增加细胞存活因子：添加适量的生长因子、细胞因子或激素等，以提高细胞存活率。
- 检查细胞状态和健康：及时观察细胞的形态和生长状态，发现异常情况及时处理。
4. 细胞分化问题在一些特定细胞系中，细胞分化可能成为一个问题。
细胞分化表现为细胞形态、生长速率、分泌物或细胞功能的改变。
以下是解决细胞分化问题的方法参考：- 控制培养时间：在合适的时间段内收获细胞，以避免细胞进一步分化。
细胞培养中的微生物污染预防与处理
细胞培养中的微生物污染预防与处理细胞培养作为一种重要的实验手段，在生物医学研究领域中得到广泛应用。
然而，在细胞培养的过程中，微生物污染往往成为一个严重的问题，可能对实验结果产生不良影响甚至导致实验结果的无效化。
因此，预防和处理细胞培养中的微生物污染是细胞培养实验中不可或缺的一环。
首先，预防细胞培养中的微生物污染至关重要。
以下是一些有效的预防措施：1. 严格执行无菌操作：细胞培养实验中，无菌操作是最基本也是最重要的环节。
在进行培养操作前，实验人员应该经过相关的培训和指导，了解无菌操作的正确步骤和技巧。
例如，在实验操作前经常更换手套、使用经过有效消毒的培养器具和培养基等。
2. 经常清洁和消毒实验环境：实验室环境和设备的清洁和消毒是预防微生物污染的另一个重要方面。
实验室的工作台面、实验室衣物、培养箱、孵化器等都需要经常进行清洁和消毒，以减少微生物的存在和传播。
3. 控制空气中的微生物：空气中的微生物往往是细胞培养中的污染源之一。
为了降低空气污染带来的风险，实验室应该配备高效过滤器的实验室通风设备，定期更换过滤器。
此外，实验室应该设置限制进出实验室的措施，例如，安装空气帘或者设置冲洗区域。
4. 识别和处理污染源：在细胞培养中排查和识别潜在的污染源是很重要的。
实验人员应经常检查培养器具、培养基和试剂等是否存在污染，一旦发现污染，应及时处理。
处理污染源的方法包括更换受污染的培养器具、重新配制新的培养基或试剂等。
其次，当细胞培养中发生微生物污染时，采取适当的处理方法也是至关重要的。
1. 立即停止受污染的实验：一旦发现细胞培养被污染，实验人员应立即停止受污染的实验，并将受污染的培养器具和培养基等隔离处理，以防止污染的进一步传播。
2. 进行污染源检查：在处理微生物污染的同时，必须找出污染源，并加以处理。
通过对培养器具、培养基和试剂等进行检查，可以找到导致污染的原因，进而采取相应的措施。
3. 清洁和消毒工作环境：在处理污染源的同时，必须对实验室的工作环境进行清洁和消毒。
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第十一章细胞培养的污染和排除组织培养细胞被有害物污染是组织培养工作的大敌。
应用组织培养进行研究工作，除需要好的实验设计和技术方法外，成败的关键还在于能否避免污染。
一项好的研究,或建成的满意细胞系，往往由于遭受污染而前功尽弃。
因此，一个组织培养工作者,要始终注意防止污染。
培养细胞被污染，人们最注意的是真菌、细菌和病毒等微生物。
现在看来已经不够，当前“污染”一词的概念应该是，凡混入培养环境中对细胞生存有害的成分和造成细胞不纯的异物，都应视为污染。
从这一概念考虑，组织培养污染应包括以下几个方面：微生物：真菌、细菌、支原体和病毒化学物质：影响细胞生存的非细胞所需的化学成分细胞：非同种的其它细胞当然在培养中以微生物污染最为多见，化学污染较少；但近年随细胞种类增多,不同种细胞交叉污染却屡有发生，以致在ATCC接受入库细胞中特设同工酶检测一项，目的在于证明是否有HeLa等细胞的交叉污染。
但细胞交叉污染只要工作细心，是容易防止的，而微生物污染在实际工作中却是最难防止和易发生的。
第一节污染途径各种污染主要通过以下途径和媒介发生：一.空气空气是扩散微生物的主要途径。
由于空气流动性大，在操作场地与外界隔离不严和消毒不充分的情况下，外界不洁空气很容易侵入造成污染。
因此，培养设施不宜置于通风场所。
现各实验室普遍应用净化工作台，能产生无菌的屏障气流，可防止不洁空气污染。
净化工作台使用过久，过滤层受尘埃堵塞情况下，工作时不带口罩或外界气流过强、污染空气均可进入操作野，导致污染。
又不同季节和不同地区空气内含菌数不同；炎热夏季尤其南方多雨地区空气湿度大、含菌数量多，工作应特别注意。
空气是不断流动的；虽用消毒措施也难以排出空气中所有微生物，但每立方米内含菌数不应超过1～5个。
二.清洗消毒培养器皿和容器洗刷不净残留污物、培养用液灭菌不彻底等，都可引入有害物。
三.操作实验操作马虎、动作不准确、消毒观念不强，使用的吸管、刀、剪沾染微生物等；或封瓶口时不严，都可发生污染。
同时培养两种以上细胞，操作不慎，使用同一吸管或培养用液，可能导致细胞交叉污染。
四.血清血清也是污染细胞的来源，有的市售血清制备水平低、检测不严，常已被支原体和病毒污染。
五.组织初代培养组织常有污染；有的是在手术中污染，有的本身可能是被污染的组织(如已经发生溃烂的肿瘤组织)；手术用碘酒消毒后，擦拭不净可能混入碘污染。
第二节污染对细胞的影响在细胞受有害物污染时间短、污染程度轻、并能及时排除污染物的情况下，细胞有可能恢复。
当污染物持续存在于培养环境中时，轻者细胞增殖生长缓慢、分裂相减少、细胞变得粗糙、细胞轮廓增强，重者细胞停止增殖，分裂相消失，细胞质中出现大量堆积物，细胞变圆或崩溃从瓶壁脱落。
但根据污染物的不同，对细胞的影响有别。
有的微生物如支原体，无致死毒性，可与细胞长期共存，对细胞形态和功能的影响是潜在的。
而病毒、细菌和霉菌的增殖迅速，能在短时间内在数量上压过细胞或产生有毒物杀死细胞。
化学物，如重金属或其它非培养必需化学试剂混入培养液中后,有的毒性小，被排除后，细胞仍可生存；有的烃化物如多环芳烃有致突变性，能导致细胞发生转化。
一、真菌污染在微生物污染中，以真菌污染最多，最常见的有：烟曲霉(Aspergillus Fumigatus)；黑曲霉(Aspergillus Niger)；毛霉菌(Mucor)；孢子霉(Oospora)；白念珠菌(Candida)；酵母菌(Yeast)。
真菌种类繁多，形态各异，但污染后均不难发现，大多呈白色或浅黄色小点漂浮于培养液表面，肉眼可见；有的散在生长，镜下观察呈丝状、管状或树枝状菌丝，纵横交错穿行于细胞之间。
念珠菌和酵母菌呈卵圆形态，散在于细胞周边和细胞之间生长。
二、细菌污染较常见的污染细菌有大肠杆菌、假单孢菌，白色葡萄菌等。
细菌污染后大多能改变培养液pH使培养液变混浊，也有的对培养液无肉眼可见影响，只在镜下观察发现菌体时才能感知污染。
细菌增殖迅速，能消耗营养液和产生毒素抑制细胞生长，毒性大的细菌很快导致细胞崩解死亡。
加用抗生素的培养用液一般可预防和排除个别少量细菌的污染。
一旦发生细菌污染很易发现，多数情况下培养液短期内颜色变黄，出现明显污浊现象；细菌和霉菌污染多在传代、换液、加样等开放性操作之后发生。
而且由于增生迅速，多在发生污染48h以内就已明显。
因此在实验的最初两天密切观察实验样本是否有污染发生，这样可及时采取措施予以补救或排除。
三、支原体污染支原体是细胞培养中最常见、不易被察觉和干扰实验结果的一种污染。
从1952～1972年间，有人检查了54个实验室的9700个各类培养细胞时发现，有11%的细胞受到了支原体的污染。
当前随实验室设备的改善和技术方法的改进，支原体污染率有所下降，但尚未能彻底杜绝，污染仍时有发生。
支原体污染是细胞培养研究室重点预防对象。
(一)支原体的种类支原体是一种介于细菌和病毒之间的目前所知能独立生活的最小微生物，它无细胞壁，形态呈高度多样性，最小的直径0.2微米，可通过滤菌器。
(二)支原体的生物特性和对细胞的影响支原体大小介于0.2～2微米之间，约有1%可通过滤菌器，因此往往难以发现。
1.支原体形态结构和生物学性状支原体形态多变，有圆形、丝状或梨形：光镜下难以看清其结构。
支原体多吸附于细胞表面或散在细胞之间，横断面很像细胞微绒毛的横断面。
不同支原体的生物学性状有很大差别。
所有支原体都需要固醇，部分需要精氨酸，有的需氧、葡萄糖，有的有DNA酶活性、溶血作用和凝集作用;有的缺乏或全无某一特性，因此支原体对培养细胞的影响是多方面的。
大多数支原体适于偏碱条件下生存(pH7.6～8.0)，对酸耐受性差，对热比较敏感;对青霉素普遍有抗药性；青霉素作用主要抑制细菌细胞壁的形成，支原体无细胞壁，故不受影响。
2.对细胞的影响细胞受支原体污染后，个别严重情况下，加之细胞敏感，可使细胞增殖缓慢、部分细胞变圆、从瓶壁脱落。
但多数细胞受污染后，无明显变化，或有微细变化却由于传代和换液而被缓解。
在观察不够细心和缺乏经验时，外观上往往给人以“正常”的感觉，实则污染细胞会受到多方面潜在的影响。
支原体多附着于细胞的表面，它们能产生丰富的腺苷酸环化酶(Adenosine Phosphorylase)，该酶能将无毒的6-甲基嘌呤脱氧核苷(6-Methylpurine Deoxyriboside：6-MPDR)转变为剧烈抗代谢的6-甲基嘌呤(6-Methylpurine：6-MP)和6-甲基嘌呤核苷(6-Methylpurine Riboside：6-MPR)，对哺乳动物细胞具有毒性。
需精氨酸型支原体能急速消耗培养中的精氨酸，导致细胞变形。
此外支原体尚能影响DNA 合成，引起一系列严重后果，如改变细胞染色体核型、增加染色体畸变、抑制PHA促淋巴细胞转化等。
而肺型支原体不需精氨酸，反而能促进PHA转化淋巴细胞和增加有丝分裂作用。
有DNA活性的支原体能降低DNA的合成。
另外，有的支原体还能与细胞竞争尿嘧啶，影响RNA的合成;能抑制细胞合成干扰素，降低细胞的抵抗力。
有人在做单克隆抗体骨髓瘤培养中，见到支原体不仅能抑制细胞生长，还能降低细胞融合率。
这些证明支原体对细胞的影响是非常广泛和深远的。
因此，在建立细胞系和进行各种实验研究时，首先应证明所用细胞有无支原体污染是十分重要的。
另外，从细胞本身来说，各类细胞对支原体的感受性和反应亦有差异。
一般初代培养和二倍体细胞对支原体耐受性强，染色体多的多倍体和无限细胞系较敏感；支原体对转化细胞和肿瘤细胞似有亲合力。
支原体污染细胞后，培养基可不发生混浊，细胞病理变化轻微或不显，致难以发现。
四、细胞交叉污染对细胞的影响及污染物的检测细胞培养中，细胞间交叉污染并不罕见，多是由于在培养操作过程中各种细胞同时进行，混杂使用所用器具或液体所致，这种污染能使细胞的生长特性、形态特征等发生变化，有些变化较轻微、不易察觉，有些则可能由于污染的细胞具有生长优势最终压过原来细胞而导致细胞的生长抑制，最终死亡。
常用观察细胞形态、分析生长特性和核型、检测细胞的标记物等方法检测交叉污染的细胞。
第三节污染的预防和排除一、污染的预防防止污染，预防是关键，预防措施应贯穿于整个细胞培养的始终。
1.器皿准备中的预防用于细胞培养的器皿应严格清洗，做到真正洁净；应该无菌的物品，要做到消毒严格，真正无菌；器皿在运输、贮藏过程中，要严格操作，谨防污染。
2.开始操作前的预防主要包括以下方面：应当按厂家规定，定期清洗或更换超净工作台的空气滤网，请专职人员定期检查超净工作台的空气净化标准；检查培养器皿是否有消毒标志，有条件的实验室应尽可能使用一次性无菌器皿；检查新配制的培养液，确认无菌方可应用；操作前提前半小时启动超净工作台及紫外消毒灯；操作者应消毒双手和戴口罩。
3.操作过程中的预防主要包括：在超净工作台面放置的所有培养瓶瓶口不能与超净工作台的风向相逆，不允许用手触及器皿的无菌部分，如瓶口和瓶塞内侧；在安装吸管帽、开启或封闭瓶口操作时要经过火焰烧灼，并在火焰附近工作；吸取培养液、细胞悬液等液体时，应专管专用，防止污染扩大或造成培养物之间的交叉污染；使用培养液前，不宜过早开瓶；开瓶后的培养液应保持斜位，避免直立；不再使用的培养液应立即封闭瓶口；培养的细胞在处理之前勿过早暴露于空气中；操作时不要交谈、咳嗽，以防唾沫和呼出气流引发污染；操作完毕后应将工作面整理好，并消毒擦拭工作面，关闭超净工作台。
4.其他方面的预防主要有：为了确保培养物的安全，应及早冻存有价值的培养物；购入的未灭活血清应采取56℃水浴灭活30分钟的措施以使血清中的补体和支原体灭活；为了避免诱导抗药细菌，应定期更换培养系统中的抗生素，或尽可能不用抗生素；对新引进的细胞株应加强观察，防止外来的污染源；定期清洁消毒CO2培养箱。
二、污染的排除培养的细胞一旦被微生物污染，应及时处理，防止其他细胞被污染。
通常选高压灭菌被污染的细胞，然后弃掉。
如果有价值的细胞被污染，并且污染程度比较轻，可通过及时排除污染物，挽救细胞恢复正常。
常用的排除微生物污染方法有如下几种：1．抗生素排除法抗生素是细胞培养中杀灭微生物的主要手段。
各种抗生素性质不同，对各种微生物的作用也不同，联合应用比单用效果好，预防性应用比污染后使用好；如果发生微生物污染后再使用抗生素，常难以根除。
有的抗生素对细菌仅有抑制作用，而无杀灭效应。
反复使用抗生素还能使微生物产生耐药性，且对细胞本身也有一定影响，因此有人主张尽量不用抗生素处理，当然，一些有价值的细胞被污染后，仍需用抗生素挽救，在这种情况下，可采用5～10倍于常用量的冲击法，加入高浓度抗生素后作用24～48小时，再换入常规培养液。
有时可能奏效。
抗生素的参考用量和效果列于表11-1。