ELISPOT技术应用简介
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12
具体操作流程及常见问题
◆ 操作流程演示
◆ 常见问题小结
13
第一天
第二天
1 2 3 4 5 6 7
PVDF膜酒精浸润 PBS洗涤三次 预包被可 加包被抗体过夜 以省去的 步骤 PBS洗涤三次 封闭，室温2小时 PBS洗涤三次 加入细胞和刺激物孵育过夜
无 菌 操 作
第三天
8 去除细胞，PBST4℃十分钟后洗涤三次 9 加检测抗体，室温孵育1.5小时 10 PBST洗涤三次 11 加SAP室温孵育1小时 12 PBST洗涤三次 13 加入 BCIP/NBT显色 14 计数，结果分析
1 2 3
人血分离 PBMC 方案
小鼠脾脏 淋巴细胞 分离方案
小鼠、大 鼠、兔子 血液淋巴 细胞 分离方案
40
厂家
产品编号 AS1114544 AS1114545 用途 主要成分 密度 渗透压 AS1019818
产品名称 LymphoprepTM 分离液（即 用型） （也称之为淋巴细胞分离液）
规格
MABTECH ELISpot技术 应用简介
任东 莱兹技术部
1
ELISpot原理、优势及应用
主 要 内 容
具体操作步骤 常见问题总结
技术的改进
参考文献
2
Mabtech 公司是世界首家研发和生产ELISpot 试 剂盒的公司，为广大科研和临床用户提供稳定的 高质量的产品，包括人类、非人灵长类、大鼠、 小鼠等种属的T淋巴细胞因子和B细胞分泌抗体检 测产品，其中非人灵长类试剂盒是科研人员首选 之品。
36
爱恨交加的 血清培养基
血清这一生物制品，含有 许多未知成分，以及受着 动物个体差异的影响
实验需要血清
细胞孵育离 不开血清 实验要避开 血清干扰
血清干扰ELISPOT
改进：只取血清中维持淋巴细胞生长所需要 的必须成分，去除其他杂质做成培养基
37
细胞培养基 的改进 原理即，将血清中对淋巴细胞维持所必需的成 分（包括营养代谢成分、细胞信号成分和多种生长因 子），把它们做成原料，添加到空白培养基中。然后 需要反复验证这些添加成分，保证它们能够满足以下 三个要求：
洗涤时间和次数不 够，导致背景过深。
洗涤时间和次数比较合适， 背景容易分辨斑点。
26
3
细胞和刺激物的浓度
细胞浓度通常为2～5×105cells/well，刺激物浓 度10～50ug/mL，依据实际情况摸索形成最适密度 的单细胞层分泌合适的斑点数。
27
4
包被抗体的量
包被抗体的质量和浓度与斑点的大小形态很有 关系，如下图，随着包被抗体浓度的增加斑点变得 清晰致密。
8
◆ 悬浮在ELISpot板膜上的细胞，它
分泌细胞因子是没有方向性的，均匀 地向四面八方扩散，其中路径越短， 扩散中耗散损失就越少，到达该点的 细胞因子就越多，将来显色的时候颜 色就越深。
◆不同的细胞，对不同的刺激物，不
同的细胞因子，ELISpot斑点的直径 （平均直径）也不同，如果一次实验 中有两类细胞同时受到刺激，比如T 细胞与巨噬细胞，或者一次实验中T 细胞受到两种不同的刺激物刺激，比 如蛋白抗原与内毒素（大肠杆菌表达 的蛋白很可能含有较高浓度的内毒 素），那么同一个孔中就会出现两种 不同的斑点。
价格
Axis-shield 专一型分离液
用途
主要成分 密度 渗透压
1x250 ml ￥590 4x250 ￥1,800 ml 分 离 人外 周血 单个 核细 胞 PBMC ， 250ml 可 分离 250ml全血 Sodium diatrizoate (离子碘化物) 和多聚糖（黏性 相对较高） 1.077±0.001l g/mL(20 º C) 290±15mOsm 18Tube LymphoprepTM 分离管（即 s ￥1,350 用型） x10ml 分离人外周血单个核细胞PBMC，每管可分离10ml 全血 泛影葡胺钠(Sodium diatrizoate) 和多聚糖（黏性 相对较高） 1.077±0.001l g/mL(20 º C) 290±15mOsm
0.2ug/well
0.5ug/well
1.0ug/well
28
5
细胞、刺激物加样
要领为：先加刺激物（悬空滴加），然后悬在
孔的正上方，逐滴滴加细胞悬液(自然滴下)，此过 程中要避免产生气泡以及剧烈晃动培养板。这样细 胞就能依靠扩散的原理，均匀的分布在孔板内，避 免了贴壁细胞产生。
注意：一定不要拍击板子来 让细胞混匀，那样会适得其 反。
9
ELISPOT的优势
高通量检 测 灵敏度高 功能性检测 单细胞 水平
只要阳性细胞频率大于 4 个/60 万细胞，就可 以被ELISpot检测出来。 这算出来的实际灵敏度 为十五万分之一。
直观， 可信度高
10
ELISpot 技术的应用领域
移植中排斥反应的预测和监测。 疫苗研发和机制研究。 Th1/Th2极化的分析和研究。 自身免疫病研究。 肿瘤致病机制和治疗药物的研究和开发。 变态反应性疾病等自身免疫病研究。 感染性疾病的治疗和研究。
19
离心之后的 PBMC沉淀
PBMC计数
20
准备5%CO2 37℃培养箱培养
＊适当浓度的抗原
（10-50μg/ml）
＊适当浓度的细胞悬
液（2～5×105/孔）
21
BCIP/NBT底物
细胞因子单克隆抗 体
生物素化检 测Ab
抗生物素ALP
22
室温下显色2-10分钟
室温避光过 夜晾干之后，读 板，或者晾干避 光保存。
厂家
产品编号 AS1114542 用途
产品名称
规格
价格
主要成分 密度 渗透压 AS1106865 用途 Axis-shield 全能型分离液 主要成分 密度 渗透压 AS1002424 用途
主要成分
OptiPrepTM 分离液（即用型） 1x250ml ￥1,240 最新型全能型分离液：可多种细胞，如分离人/哺乳 动物 PBMC ，也可分离单核细胞，多型核细胞、 DC 、 肝星状细胞、精子等；也可分离亚细胞器，如线粒 体、核糖体、溶酶体、核等；也可分离生物大分子， 如脂蛋白、蛋白、质粒DNA以及微生物等。 Iodixanol（非离子碘化物、低渗、低黏性、无毒） 1.320±0.001g/mL(20 º C) 170±15mOsm NycoPrepTM Universal 分离液 1x300ml ￥1,425 （即用型） 全能型分离液：可多种细胞，如分离人 / 哺乳动物 PBMC ，也可分离单核细胞，多型核细胞、 DC 、肝 星状细胞等；也可分离亚细胞器，如线粒体、核糖 体、溶酶体、核等；也可分离生物大分子，如脂蛋 白、蛋白、质粒DNA以及微生物等。 Nycodenz （ 非 离 子 碘 化 物 、 无 毒 ， 密 度 高 于 1.26g/ml时轻微高渗） 1.310±0.001g/mL(20 º C) 580±15 mOsm 1x500g ￥3,580 Nycodenz 粉剂 全能型分离液：可多种细胞，如分离人 / 哺乳动物 PBMC ，也可分离单核细胞，多型核细胞、 DC 、肝 星状细胞等；也可分离亚细胞器，如线粒体、核糖 体、溶酶体、核等；也可分离生物大分子，如脂蛋 白、蛋白、质粒DNA以及微生物等。 Nycodenz （ 非 离 子 碘 化 物 、 无 毒 ， 密 度 高 42于 1.26g/ml时轻微高渗）
ICE Peptide Pool 2x105 hu-PBMC indirect
tetanus 105 hu-PBMC indirect
ConA 2.5x104 hu-PBMC indirect
35
培养基的改进
淋巴细胞 分离技术
ELISPOT 技术改进
淋巴细胞
冻存、复
苏技术
的改进
的改进
Reader的改进
29
拍击后细胞的贴壁实例
30
6
细胞的培养
1
2
培养过程中避免培养板的剧烈震动，以免形 成“拖尾”现象（图1）。但是如果大部分斑点 形态正常，只有少数有此现象时多数是因为DC 31 趋化所致（图2）。
7
斑点的出现空斑
主要原因：粒细 胞分泌或分解所致的
酶解现象。
可以通过采用多
价刺激物，以及提高
PBMC的分离质量来改 善。
3
原理
酶联免疫斑点检测（Enzyme-Linked ImmunoSpot Assay, ELISpot），从字面
上来说，可以分解成两部分：“酶联免疫” 与 “斑点”。
4
ELISA
ELISPOT
抗体捕获的抗原来自于样品细 胞在检测的当时新鲜分泌的抗原 分子
酶 联 免 疫 斑 点
抗体捕获的抗原来自样品 溶液中的已经存在的、均匀 分布的抗原分子
32
CDC的采集的一个实例： （透明板，PBMC，乙肝核心抗原蛋白）
33
8
显色时机的把握 显色时间一般控制在2～
10分钟，要依斑点的形成情
况适时终止显色。
显色反应和温度有很大的
关系，如果室温很低（如冬
季），可以适当延长显色的时
间。
34
技术的改进
PMA/ionomycin 2.5x104 hu-PBMC indirect
抗原决定簇图谱分析。
化合物和药物免疫学反应的筛选等。
11
中国药品生物制品检定所： 2003年 《预防用DNA疫苗临 床前研究技术指导原则》《预防用以病毒为载体的活疫苗 制剂的技术指标原则》“使用ELISPOT方法检测淋巴细胞 分泌γ干扰素功能，应该作为检测和评价疫苗的细胞免疫的 有效方法” WHO：WHO-UNAIDS-sponsored training workshop 2003年 在艾滋病(HIV)疫苗的研究中，推荐使用ELISPOT 检测淋巴细胞分泌γ干扰素功能。 卫生部文件（【2012】6号）：增补结核感染T细胞检测 （免疫斑点法）等临床检验项目。
AS1002380
用途
NycoPrepTM 1.077A 分 离 液 1x100m l （即用型）
￥245
主要成分 密度 渗透压
分 离 大 鼠 / 兔 子 血 中 单 个 核 细 胞 ， 100ml 可 分 离 100ml 全血；也可分离小鼠 / 大鼠脾脏淋巴细胞， 100ml可分离100ml细胞悬液 Nycodenz （ 非 离 子 碘 化 物 、 无 毒 ， 密 度 高 于 1.26g/ml时轻微高渗） 41 1.077±0.001g/mL(20 º C) 265±15 mOsm
23
操作流程及常见的问题
◆ 操作流程演示
◆ 常见问题小结
24
1
酒精预湿时要恰当
PVDF膜由于其疏 水性，需要酒精预湿润， 但是预湿的时间太长和 太短都不合适。
一般情况下，预湿
的时间控制在30秒。
25
2
洗涤PVDF膜次数和时间 每孔加入 200μl 洗涤液，洗涤 5 次以上，
每次浸泡时间约30秒。
D.加入酶标记的检测抗体，检测抗体和“影像”上的细
胞因子结合，形成“抗体-抗原-抗体”夹心结构； E.加入显色底物，在酶的催化分解下，生成不可溶的色素，就
近沉淀在局部的膜上形成斑点；
结果分析。
7
F.斑点计数（可人工计数，也可用自动读板仪计数），数据处理，
斑点的特征
圆型，有晕 核结构
大小不均一， 成正态分布
左：进口胎牛血清与Lympho-Spot™ Primate 无血清ELISPOT 检测结果统计。 人PBMC，CEF 多肽刺激。无血清的斑 点频率更高，R2 值更高，线形更好。 线性好说明实验的重复性高，可信度高。 39
38
淋巴细胞分离技术的改进
以往的淋巴细胞分离有着许多的缺点，如: 分离 液有毒，操作复杂，洗涤繁琐，脾脏分离淋巴细胞效果 差等等。Axis Shield公司提供适用多种属淋巴细胞分离 液，并附有各种组织细胞提取方案，能够成功得到各种 PBMC。
无 须 无 菌 操 作14 Nhomakorabeax
操作流程及易出现的问题
◆ 操作流程演示
◆
常见问题小结
15
第一天，包 被抗体
16
第二天，分离 PBMC，培 养
2000 rpm, 10min 离心分 离血清，保存备 用。
17
加淋巴细胞分离 液后，最多可加 两倍体积的全血。
18
旋转的手法提取
吸取PBMC层细胞放 入新的离心管中， 加入2倍体积的PBS 洗涤两次。
显色出来的是或深或浅的 有色溶液
显色出来的是沉积在固体基板 上或多或少的有色斑点
一言以蔽之，ELISA 检测的是无生命的溶液中抗原分 子的浓度，ELISpot 检测的是有生物活性的活细胞分泌抗原 的功能。
5
工作原理
6
A.特异性单抗包被在培养孔底部； B.加入细胞及刺激物培养，阳性细胞开始分泌细胞因子，细胞 因子就近被包被抗体捕获； C.移出细胞，板底留下自胞因子的潜在“影像”；
������ ★ 维持淋巴细胞存活，保持细胞活力和免疫功能状态；
★ 不会额外刺激阴性细胞产生任何一种额外细胞因子；
★ 不会抑制阳性细胞分泌待检测的细胞因子。
38
左上：人PBMC,1 万细胞/孔,PHA 刺 激。血清对斑点的形成有明显的抑制作 用。 右上：人PBMC,40 万细胞/孔,不加任 何刺激物。血清明显加重ELISPOT 检测 的图像背景，并且出现杂斑点。
具体操作流程及常见问题
◆ 操作流程演示
◆ 常见问题小结
13
第一天
第二天
1 2 3 4 5 6 7
PVDF膜酒精浸润 PBS洗涤三次 预包被可 加包被抗体过夜 以省去的 步骤 PBS洗涤三次 封闭，室温2小时 PBS洗涤三次 加入细胞和刺激物孵育过夜
无 菌 操 作
第三天
8 去除细胞，PBST4℃十分钟后洗涤三次 9 加检测抗体，室温孵育1.5小时 10 PBST洗涤三次 11 加SAP室温孵育1小时 12 PBST洗涤三次 13 加入 BCIP/NBT显色 14 计数，结果分析
1 2 3
人血分离 PBMC 方案
小鼠脾脏 淋巴细胞 分离方案
小鼠、大 鼠、兔子 血液淋巴 细胞 分离方案
40
厂家
产品编号 AS1114544 AS1114545 用途 主要成分 密度 渗透压 AS1019818
产品名称 LymphoprepTM 分离液（即 用型） （也称之为淋巴细胞分离液）
规格
MABTECH ELISpot技术 应用简介
任东 莱兹技术部
1
ELISpot原理、优势及应用
主 要 内 容
具体操作步骤 常见问题总结
技术的改进
参考文献
2
Mabtech 公司是世界首家研发和生产ELISpot 试 剂盒的公司，为广大科研和临床用户提供稳定的 高质量的产品，包括人类、非人灵长类、大鼠、 小鼠等种属的T淋巴细胞因子和B细胞分泌抗体检 测产品，其中非人灵长类试剂盒是科研人员首选 之品。
36
爱恨交加的 血清培养基
血清这一生物制品，含有 许多未知成分，以及受着 动物个体差异的影响
实验需要血清
细胞孵育离 不开血清 实验要避开 血清干扰
血清干扰ELISPOT
改进：只取血清中维持淋巴细胞生长所需要 的必须成分，去除其他杂质做成培养基
37
细胞培养基 的改进 原理即，将血清中对淋巴细胞维持所必需的成 分（包括营养代谢成分、细胞信号成分和多种生长因 子），把它们做成原料，添加到空白培养基中。然后 需要反复验证这些添加成分，保证它们能够满足以下 三个要求：
洗涤时间和次数不 够，导致背景过深。
洗涤时间和次数比较合适， 背景容易分辨斑点。
26
3
细胞和刺激物的浓度
细胞浓度通常为2～5×105cells/well，刺激物浓 度10～50ug/mL，依据实际情况摸索形成最适密度 的单细胞层分泌合适的斑点数。
27
4
包被抗体的量
包被抗体的质量和浓度与斑点的大小形态很有 关系，如下图，随着包被抗体浓度的增加斑点变得 清晰致密。
8
◆ 悬浮在ELISpot板膜上的细胞，它
分泌细胞因子是没有方向性的，均匀 地向四面八方扩散，其中路径越短， 扩散中耗散损失就越少，到达该点的 细胞因子就越多，将来显色的时候颜 色就越深。
◆不同的细胞，对不同的刺激物，不
同的细胞因子，ELISpot斑点的直径 （平均直径）也不同，如果一次实验 中有两类细胞同时受到刺激，比如T 细胞与巨噬细胞，或者一次实验中T 细胞受到两种不同的刺激物刺激，比 如蛋白抗原与内毒素（大肠杆菌表达 的蛋白很可能含有较高浓度的内毒 素），那么同一个孔中就会出现两种 不同的斑点。
价格
Axis-shield 专一型分离液
用途
主要成分 密度 渗透压
1x250 ml ￥590 4x250 ￥1,800 ml 分 离 人外 周血 单个 核细 胞 PBMC ， 250ml 可 分离 250ml全血 Sodium diatrizoate (离子碘化物) 和多聚糖（黏性 相对较高） 1.077±0.001l g/mL(20 º C) 290±15mOsm 18Tube LymphoprepTM 分离管（即 s ￥1,350 用型） x10ml 分离人外周血单个核细胞PBMC，每管可分离10ml 全血 泛影葡胺钠(Sodium diatrizoate) 和多聚糖（黏性 相对较高） 1.077±0.001l g/mL(20 º C) 290±15mOsm
0.2ug/well
0.5ug/well
1.0ug/well
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5
细胞、刺激物加样
要领为：先加刺激物（悬空滴加），然后悬在
孔的正上方，逐滴滴加细胞悬液(自然滴下)，此过 程中要避免产生气泡以及剧烈晃动培养板。这样细 胞就能依靠扩散的原理，均匀的分布在孔板内，避 免了贴壁细胞产生。
注意：一定不要拍击板子来 让细胞混匀，那样会适得其 反。
9
ELISPOT的优势
高通量检 测 灵敏度高 功能性检测 单细胞 水平
只要阳性细胞频率大于 4 个/60 万细胞，就可 以被ELISpot检测出来。 这算出来的实际灵敏度 为十五万分之一。
直观， 可信度高
10
ELISpot 技术的应用领域
移植中排斥反应的预测和监测。 疫苗研发和机制研究。 Th1/Th2极化的分析和研究。 自身免疫病研究。 肿瘤致病机制和治疗药物的研究和开发。 变态反应性疾病等自身免疫病研究。 感染性疾病的治疗和研究。
19
离心之后的 PBMC沉淀
PBMC计数
20
准备5%CO2 37℃培养箱培养
＊适当浓度的抗原
（10-50μg/ml）
＊适当浓度的细胞悬
液（2～5×105/孔）
21
BCIP/NBT底物
细胞因子单克隆抗 体
生物素化检 测Ab
抗生物素ALP
22
室温下显色2-10分钟
室温避光过 夜晾干之后，读 板，或者晾干避 光保存。
厂家
产品编号 AS1114542 用途
产品名称
规格
价格
主要成分 密度 渗透压 AS1106865 用途 Axis-shield 全能型分离液 主要成分 密度 渗透压 AS1002424 用途
主要成分
OptiPrepTM 分离液（即用型） 1x250ml ￥1,240 最新型全能型分离液：可多种细胞，如分离人/哺乳 动物 PBMC ，也可分离单核细胞，多型核细胞、 DC 、 肝星状细胞、精子等；也可分离亚细胞器，如线粒 体、核糖体、溶酶体、核等；也可分离生物大分子， 如脂蛋白、蛋白、质粒DNA以及微生物等。 Iodixanol（非离子碘化物、低渗、低黏性、无毒） 1.320±0.001g/mL(20 º C) 170±15mOsm NycoPrepTM Universal 分离液 1x300ml ￥1,425 （即用型） 全能型分离液：可多种细胞，如分离人 / 哺乳动物 PBMC ，也可分离单核细胞，多型核细胞、 DC 、肝 星状细胞等；也可分离亚细胞器，如线粒体、核糖 体、溶酶体、核等；也可分离生物大分子，如脂蛋 白、蛋白、质粒DNA以及微生物等。 Nycodenz （ 非 离 子 碘 化 物 、 无 毒 ， 密 度 高 于 1.26g/ml时轻微高渗） 1.310±0.001g/mL(20 º C) 580±15 mOsm 1x500g ￥3,580 Nycodenz 粉剂 全能型分离液：可多种细胞，如分离人 / 哺乳动物 PBMC ，也可分离单核细胞，多型核细胞、 DC 、肝 星状细胞等；也可分离亚细胞器，如线粒体、核糖 体、溶酶体、核等；也可分离生物大分子，如脂蛋 白、蛋白、质粒DNA以及微生物等。 Nycodenz （ 非 离 子 碘 化 物 、 无 毒 ， 密 度 高 42于 1.26g/ml时轻微高渗）
ICE Peptide Pool 2x105 hu-PBMC indirect
tetanus 105 hu-PBMC indirect
ConA 2.5x104 hu-PBMC indirect
35
培养基的改进
淋巴细胞 分离技术
ELISPOT 技术改进
淋巴细胞
冻存、复
苏技术
的改进
的改进
Reader的改进
29
拍击后细胞的贴壁实例
30
6
细胞的培养
1
2
培养过程中避免培养板的剧烈震动，以免形 成“拖尾”现象（图1）。但是如果大部分斑点 形态正常，只有少数有此现象时多数是因为DC 31 趋化所致（图2）。
7
斑点的出现空斑
主要原因：粒细 胞分泌或分解所致的
酶解现象。
可以通过采用多
价刺激物，以及提高
PBMC的分离质量来改 善。
3
原理
酶联免疫斑点检测（Enzyme-Linked ImmunoSpot Assay, ELISpot），从字面
上来说，可以分解成两部分：“酶联免疫” 与 “斑点”。
4
ELISA
ELISPOT
抗体捕获的抗原来自于样品细 胞在检测的当时新鲜分泌的抗原 分子
酶 联 免 疫 斑 点
抗体捕获的抗原来自样品 溶液中的已经存在的、均匀 分布的抗原分子
32
CDC的采集的一个实例： （透明板，PBMC，乙肝核心抗原蛋白）
33
8
显色时机的把握 显色时间一般控制在2～
10分钟，要依斑点的形成情
况适时终止显色。
显色反应和温度有很大的
关系，如果室温很低（如冬
季），可以适当延长显色的时
间。
34
技术的改进
PMA/ionomycin 2.5x104 hu-PBMC indirect
抗原决定簇图谱分析。
化合物和药物免疫学反应的筛选等。
11
中国药品生物制品检定所： 2003年 《预防用DNA疫苗临 床前研究技术指导原则》《预防用以病毒为载体的活疫苗 制剂的技术指标原则》“使用ELISPOT方法检测淋巴细胞 分泌γ干扰素功能，应该作为检测和评价疫苗的细胞免疫的 有效方法” WHO：WHO-UNAIDS-sponsored training workshop 2003年 在艾滋病(HIV)疫苗的研究中，推荐使用ELISPOT 检测淋巴细胞分泌γ干扰素功能。 卫生部文件（【2012】6号）：增补结核感染T细胞检测 （免疫斑点法）等临床检验项目。
AS1002380
用途
NycoPrepTM 1.077A 分 离 液 1x100m l （即用型）
￥245
主要成分 密度 渗透压
分 离 大 鼠 / 兔 子 血 中 单 个 核 细 胞 ， 100ml 可 分 离 100ml 全血；也可分离小鼠 / 大鼠脾脏淋巴细胞， 100ml可分离100ml细胞悬液 Nycodenz （ 非 离 子 碘 化 物 、 无 毒 ， 密 度 高 于 1.26g/ml时轻微高渗） 41 1.077±0.001g/mL(20 º C) 265±15 mOsm
23
操作流程及常见的问题
◆ 操作流程演示
◆ 常见问题小结
24
1
酒精预湿时要恰当
PVDF膜由于其疏 水性，需要酒精预湿润， 但是预湿的时间太长和 太短都不合适。
一般情况下，预湿
的时间控制在30秒。
25
2
洗涤PVDF膜次数和时间 每孔加入 200μl 洗涤液，洗涤 5 次以上，
每次浸泡时间约30秒。
D.加入酶标记的检测抗体，检测抗体和“影像”上的细
胞因子结合，形成“抗体-抗原-抗体”夹心结构； E.加入显色底物，在酶的催化分解下，生成不可溶的色素，就
近沉淀在局部的膜上形成斑点；
结果分析。
7
F.斑点计数（可人工计数，也可用自动读板仪计数），数据处理，
斑点的特征
圆型，有晕 核结构
大小不均一， 成正态分布
左：进口胎牛血清与Lympho-Spot™ Primate 无血清ELISPOT 检测结果统计。 人PBMC，CEF 多肽刺激。无血清的斑 点频率更高，R2 值更高，线形更好。 线性好说明实验的重复性高，可信度高。 39
38
淋巴细胞分离技术的改进
以往的淋巴细胞分离有着许多的缺点，如: 分离 液有毒，操作复杂，洗涤繁琐，脾脏分离淋巴细胞效果 差等等。Axis Shield公司提供适用多种属淋巴细胞分离 液，并附有各种组织细胞提取方案，能够成功得到各种 PBMC。
无 须 无 菌 操 作14 Nhomakorabeax
操作流程及易出现的问题
◆ 操作流程演示
◆
常见问题小结
15
第一天，包 被抗体
16
第二天，分离 PBMC，培 养
2000 rpm, 10min 离心分 离血清，保存备 用。
17
加淋巴细胞分离 液后，最多可加 两倍体积的全血。
18
旋转的手法提取
吸取PBMC层细胞放 入新的离心管中， 加入2倍体积的PBS 洗涤两次。
显色出来的是或深或浅的 有色溶液
显色出来的是沉积在固体基板 上或多或少的有色斑点
一言以蔽之，ELISA 检测的是无生命的溶液中抗原分 子的浓度，ELISpot 检测的是有生物活性的活细胞分泌抗原 的功能。
5
工作原理
6
A.特异性单抗包被在培养孔底部； B.加入细胞及刺激物培养，阳性细胞开始分泌细胞因子，细胞 因子就近被包被抗体捕获； C.移出细胞，板底留下自胞因子的潜在“影像”；
������ ★ 维持淋巴细胞存活，保持细胞活力和免疫功能状态；
★ 不会额外刺激阴性细胞产生任何一种额外细胞因子；
★ 不会抑制阳性细胞分泌待检测的细胞因子。
38
左上：人PBMC,1 万细胞/孔,PHA 刺 激。血清对斑点的形成有明显的抑制作 用。 右上：人PBMC,40 万细胞/孔,不加任 何刺激物。血清明显加重ELISPOT 检测 的图像背景，并且出现杂斑点。