ELISPOT技术应用简介
elispot的原理及应用
Elispot的原理及应用1. Elispot是什么Elispot（enzyme-linked immune spot assay）是一种用于测定单个细胞的分泌功能的实验技术。
它通过检测分泌细胞在特定条件下产生的细胞因子或细胞分泌物的分泌量，来评估细胞的免疫反应。
Elispot被广泛应用于免疫学、肿瘤学、感染病学等领域的研究和诊断。
2. Elispot的原理Elispot基于细胞分泌物的分泌原理进行测定。
其原理主要包括以下几个步骤：1.准备ELISPOT板：将特定抗体或刺激物涂覆在固相支持体上，形成抗原或刺激物捕获层。
常用固相支持体有多孔膜、96孔板等。
2.加样细胞：将待测细胞或其他产生细胞分泌物的细胞加入到ELISPOT板中，使其与抗原或刺激物接触。
3.细胞刺激：经过一定的培养条件和时间，刺激细胞产生分泌物。
4.分泌物检测：将细胞移除，用特异性抗体标记待测细胞分泌物中的目标分子，形成复合物。
5.免疫反应可见化：通过酶标法或荧光法，使复合物与ELISPOT板上的底物发生反应，产生可观察的斑点。
3. Elispot的应用Elispot技术广泛应用于以下领域：3.1 免疫学研究Elispot可以用于研究多种细胞因子的产生情况，如干扰素γ（IFN-γ）、白介素-2（IL-2）、肿瘤坏死因子（TNF-α）等。
它可以检测单个细胞的分泌情况，并通过对不同细胞类型进行比较，揭示免疫细胞的功能和相互作用。
3.2 肿瘤学研究Elispot可以评估肿瘤特异性T细胞的活性和功能。
通过使用与肿瘤相关的抗原刺激细胞，可以检测肿瘤特异性T细胞的分泌情况，进而评估免疫治疗的效果和抗肿瘤免疫应答的强度。
3.3 感染病学研究Elispot在感染病学研究中起到重要作用。
通过检测特定感染病原体的抗原刺激下，细胞分泌物的产生情况，可以评估免疫应答的强度和类型，并且可以用于疫苗开发和新药筛选等领域。
3.4 自身免疫性疾病研究Elispot可以用于评估自身免疫性疾病（如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮等）患者的自身免疫反应。
酶联免疫斑点试验检测技术(Elispot)在诊断结核性脑膜炎中的应用
提供 ， 脑脊液 Ｔ — Ｎ Ｐ Ｒ） 平 ≥５０ ｃｐｅ／ ｌ 断 为 阳 ＢＤ Ａ（ Ｃ 水 ０ ｏ ｉ ｍ 判 ｓ
性 ， ５ ０ｃｐｅ ｍ 判 断 为 阴 性 。 检 测 结 果 使 用 Ｐｉ ５０软 ＜ ０ ｏｉ ／ ｌ ｓ ｒｍ ． ｓ
件包进行数据统计和统计学分析。两组 间率 的比较采用卡方
特 异 性 ｒ 扰 素 （Ｆ —） 平 可 以 用 于 结 核 分 枝 杆 菌 感 染 的 干 ＩＮ ｒ 水
断为 阳性 ， 抗 原 检 测 结 果 为 阴性 ， 果 判 断 为 阴 性 ； 有 ３种 结 所 脑 膜 脑 炎 病 例 均 常 规 行 脑 脊 液 Ａ Ａ、 脊 液 Ｔ — Ｎ Ｐ Ｒ） Ｄ 脑 Ｂ Ｄ Ａ（ Ｃ
检测 。脑脊 液 Ａ Ａ使 用 酶 标 法 进 行 检 测 ， 据 国 内 同行 Ｄ 根 ２０ ０４年对脑脊 液 Ａ Ａ在结 核性脑 膜脑 炎 中研 究 的标准 Ｊ Ｄ ， 脑脊液 Ａ Ａ１８Ｕ Ｌ判断为 阳性 ， ８Ｕ Ｌ判断为阴性 ； Ｄ ＞ ／ ＜ ／ 脑脊
液 Ｔ —Ｎ Ｂ Ｄ Ａ荧 光 定 量 聚 合 酶 链 反 应 试剂 由达 安 基 因有 限 公 司
选 非 结 核 性 脑 膜 脑 炎 病 例 均 通过 临床 治 疗 转 归 及 实 验室 检 查 最终确诊 。
方 法
所 有 病 例 均抽 取 乙 二 胺 四 乙 酸 （ Ｄ Ａ） 凝 血 ５ｍ ， ＥＴ 抗 ｌ送
实 验 室 行 Ｅｉ ｏ检 测 。检 测 结 果 根 据 斑 点 数 量 设 定 ， 一 反 ｌｐ ｔ ｓ 每
术 在 结 核 性 脑 膜脑 炎 中 的应 用 价 值 。
临 床 资 料
、
果
在 ７ 例 结 核 性 脑 膜 脑 炎 的 诊 断 中 ，ｌｐ ｔ 性 者 ４ ３ Ｅｉ ｏ 阳 ｓ ５
免疫过氧化物酶单层细胞实验技术原理
探究细胞免疫过氧化物酶的单层实验技术原
理
免疫过氧化物酶单层细胞实验技术（简称ELISPOT技术）是一种
用于植物、动物和人体细胞免疫功能研究的先进技术。
使用这种技术
可以检测特定单个细胞所产生的蛋白质，尤其是细胞因子。
下面我们
来详细了解一下这个技术的原理：
首先，我们需要准备两个特定抗体：用于先后标记目标抗原的一
级抗体和用于探测一级抗体的二级抗体。
一级抗体绑定特定的细胞刺
激分子，二级抗体则结合一级抗体，使可见的单层反应产物形成。
接下来，将一定数量的细胞孵育在含体积固定的高浓度一级抗体
盘中。
细胞在该盘中沉淀形成单层，随后将其孵育。
在孵育的过程中，给细胞补充适当的物质用以刺激细胞因子的释放。
一级抗体可以捕捉
这些细胞因子，从而实现实验的目的。
接着，在单层的细胞上加入一定量的二级抗体。
由于二级抗体已
经标记了特殊的酶，可以很容易地鉴定单层上的细胞因子或抗原。
之后，显色液位盖在反应孔上，反应时间15至20分钟。
接着去除显色
液并使用稀释液洗涤，洗涤后观察条带或点，如果呈现出灰白或深蓝色，则代表着该点或条带中存在该抗原的细胞因子。
除了上述方法之外，ELISPOT还能够用于测定体内特定腺病毒对T
细胞的免疫刺激反应，以及对单核细胞亚群和调节细胞的分析研究等。
总结起来，免疫过氧化物酶单层细胞实验技术可以通过检测每个单个的细胞所分泌的细胞因子进行准确的结果测定。
该技术对研究免疫学和感染性疾病等领域都有着重要的应用价值。
通过不断优化实验流程和研发新的检测方法，相信该技术将在未来得到更广泛的应用。
ELIspot技术检测结核分枝杆菌感染检测原理
ELIspot技术检测结核分枝杆菌感染检测原理检测原理是：机体感染结核分枝杆菌后，存在于血液中的特异性效应T淋巴细胞会在再次接触结核分枝杆菌特异抗原时，产生和分泌IFN-γ，通过检测能够释放IFN-γ的T淋巴细胞数量，用于结核分枝杆菌感染及结核病的辅助诊断。
该检测方法相对于结核菌素试验，具有更高的特异性。
由于结核菌素试验中用的结核菌素是从结核分枝杆菌中提取的非种属特异的性分子，因此存在与卡介苗（BCG）的交叉，接种过BCG的人群即使没有感染结核也可能会出现结核菌素试验阳性。
而ELIspot检测所用的结核分枝杆菌特异抗原与BCG抗原无交叉，不受BCG接种的影响，未接种BCG和接种BCG的人群均可用该法进行结核病感染的筛查和结核病的辅助诊断。
目前应用的ELIspot检测试剂盒是由英国Oxford Immunotec公司生产的T-SPOT®TB试剂盒。
其检测方法如下：1.抗体包被将适量人IFN-γ抗体预先包被于96孔ELIspot板上。
2.标本采集及准备采集8小时内的肝素抗凝血，用Ficol离心分离外周血单核细胞（PBMC），用细胞培养液洗涤2次后，重悬于细胞培养液中。
3.细胞计数及稀释用台盼蓝染色计数法对PBMC细胞悬液计数，将细胞悬液浓度调整至2.5×105个细胞/100μl。
4.抗原刺激及孵育每个待检样本均需设阳性对照孔、阴性对照孔和检测孔。
阳性对照孔加入植物血凝素（PHA）作为阳性刺激抗原，阴性对照孔不加任何抗原刺激，检测孔加入结核特异性抗原。
若有几个特异性抗原进行分别刺激，检测孔可根据需要设置多个孔。
向阳性、阴性对照孔及检测孔内各加入100μl的PBMC细胞悬液，将ELIspot板置于37℃5%CO2培养箱内静置孵育16～20小时。
孵育期间不能移动ELIspot板，必须保证板静置不动。
5.斑点显色及计数弃除板内的细胞培养液，每孔加入200μl的PBS缓冲液洗涤3～5次，弃净板内的液体，向每孔加入100μl稀释好的生物素标记抗体，37℃孵育1小时。
酶联免疫斑点试验
酶联免疫斑点试验
酶联免疫斑点试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，简称ELISPOT）是一种高灵敏度的免疫学检测技术，可用于检测单个细胞
的分泌物，如细胞因子、抗体、酶等。
该技术广泛应用于疾病诊断、
药物筛选、疫苗研究等领域。
ELISPOT的原理是利用特定的抗体捕获分泌物，然后使用酶标记的二
抗或底物来检测捕获的分泌物。
具体步骤如下：
1. 准备试板：将多孔板涂上特定的抗体，使其能够捕获分泌物。
2. 细胞处理：将待检测的细胞加入试板中，使其与涂有抗体的孔相互
作用。
3. 洗涤：将试板洗涤，去除未结合的细胞和其他杂质。
4. 二抗标记：加入酶标记的二抗，使其与捕获的分泌物结合。
5. 洗涤：将试板洗涤，去除未结合的二抗和其他杂质。
6. 底物反应：加入底物，使其与酶标记的二抗反应，产生可见的斑点。
ELISPOT的优点是灵敏度高、特异性好、操作简单、结果可靠。
它可
以检测单个细胞的分泌物，因此可以用于研究细胞免疫应答、肿瘤免
疫学、感染病毒的免疫学等领域。
此外，ELISPOT还可以用于药物筛
选和疫苗研究，帮助科学家们开发更有效的药物和疫苗。
ELISPOT的缺点是需要较长的实验时间和较高的成本，同时需要专业
的实验技能和设备。
此外，ELISPOT只能检测单个细胞的分泌物，无
法检测细胞表面分子的表达情况。
总之，ELISPOT是一种重要的免疫学检测技术，具有广泛的应用前景。
随着技术的不断发展，ELISPOT将会在疾病诊断、药物筛选、疫苗研
究等领域发挥越来越重要的作用。
ELISPOT工作原理
ELISPOT工作原理ELISPOT是一种基于酶联免疫斑点（enzyme-linked immunospot）技术的生物学实验方法，用于检测单个活细胞产生的细胞因子数量，以获得关于特定免疫反应的定量信息。
ELISPOT方法已成为研究和临床诊断中常用的细胞免疫分析技术。
本文旨在介绍ELISPOT技术的原理和应用。
1. ELISPOT技术的基本原理ELISPOT技术的基本原理是利用单个细胞在聚焦区域中分泌细胞因子的能力。
首先在多孔板上涂覆特定抗体，并使用细胞悬浮液孵育，使细胞吸附在多孔板上，然后刺激细胞产生细胞因子，特异性抗体识别并结合细胞因子，供试细胞被固定，而其产生的细胞因子仍然可扩散进入周围。
接着使用酶标技术，添加酶标抗体-酶复合物识别并结合周围可扩散的细胞因子，形成可被酶底物着色的斑点。
ELISPOT试验可用于检测细胞因子的免疫反应，可以在不光化细胞，也无需使用放射性同位素进行标记的情况下，测定非常微量的细胞因子。
2. ELISPOT技术的应用ELISPOT技术的应用非常广泛，可以用于研究细胞免疫学、癌症、感染病原体和自身免疫性疾病等。
下面将分别介绍这些应用。
2.1. 研究细胞免疫学ELISPOT技术可以用于检测不同和同种发育阶段、性别、某些基因型或特定条件下的免疫细胞产生的细胞因子。
例如，可以对不同的激活剂进行测试，检测免疫细胞的分泌情况，揭示特定免疫反应的机制。
此外，由于ELISPOT对特异性和非特异性T和B淋巴细胞的敏感性非常高，所以可以使用这种技术来监测疫苗接种效果或者进行不同细胞因子分子和癌细胞的功能评估等。
2.2. 癌症的研究和治疗免疫疗法已成为一种治疗恶性肿瘤的新式方法，其中包括活体细胞治疗和肿瘤抗原刺激，此类方法具有极大的潜力来抑制肿瘤细胞的增长和扩散。
ELISPOT技术用于评估肿瘤抗原特异性T细胞水平的变化，可以在研究和临床实验中确定特异性的肿瘤抗原。
ELISPOT技术具体可用于肿瘤特异性免疫反应的检测、克隆增殖能力的测定、转移性肿瘤特异性T细胞反应的检测，以及抗肿瘤免疫反应治疗效果的评估等。
酶联免疫斑点技术(ELISPOT)及其应用研究进展
者方 面 具有 ９％ ９ 的符 合 率 。当 比较 Ｔ Ｔ方 法和 自 Ｓ
建 Ｅ ＩＰ Ｔ方 法 时发现 ， ６ 的 Ｔ Ｔ阳 性 受试 者是 ＬＳ Ｏ ３％ Ｓ Ｅ Ｉ Ｐ Ｔ阴性 ， ２ 的 Ｔ Ｔ阴 性 受 试 者 是 Ｅ Ｉ Ｐ Ｔ Ｌ ＳＯ １％ Ｓ ＬＳ Ｏ 阳性 。另 外 ， ８ 的 Ｅ ＩＰ Ｔ Ｍ Ｔ阴性 受 试 者 是 ７％ ＬＳ Ｏ— Ｐ Ｅ Ｉ Ｐ Ｔ Ｂ Ｇ阳 性 ， 这 些 人 中 大 部 分 都 接 种 过 Ｌ ＳＯ —Ｃ
胞 中检 出 １ 分 泌待 检 Ｃ 个 Ｋ的细 胞 ， 其灵 敏 度 非 常 高 。 为其 使用 了识 别 Ｃ 子 中 ２ 不 同表 位 因 Ｋ分 个 的 ２种 单克 隆抗 体 ，因而 这种 方 法有 着 高度 的特
异性 ［。 过显 色 反应 ， ５通 ］ 在细 胞 分泌 可溶 性 蛋 白的 相应位 置 上显 现清 晰 可辨 的斑 点 ，可 直接 在 显 微 镜下 人工 计数 ，或通过 Ｅ ＩＰ Ｔ分 析 系 统对 斑 点 Ｌ ＳＯ
领 域 。本 文介 绍 了 Ｅ Ｉ Ｐ Ｔ的原 理 和特 点 ，对 Ｅ ＩＰ Ｔ的应 用 研 究进 展 进行 了综述 。 Ｌ ＳＯ ＬＳＯ 关 键 词 ：酶联 免疫 斑 点 （Ｌ Ｓ Ｏ 应 用 Ｅ ＩＰ Ｔ 中 图分 类 号 ：￥ ５ ． ＋ ８ ２ ４３ 文 献 标 识 码 ：Ａ
进 行计 数 ， 进行 高通 量 筛选 ， 率远 远 高 于其他 检 效
测 方法 ［。Ｅ Ｉ Ｐ Ｔ自创 立 至今 ２ ６ ＬＳＯ ］ ０多 年来 不 断发
Ａ ｓ ｙＥ ＩＰ Ｔ 技术 是利 用预 先包 被好 抗 原或抗 ｓａ ，ＬＳ Ｏ ） 体 的微量 板从 单细 胞 水平 检测 特异 性 抗 体分 泌 细 胞或特异 性细胞 因子 （ｙｏ ｉｅＣ） ｃ ｔｋ ｎ，Ｋ 分泌细 胞 的免 疫 学检测技 术 。 ９ ３年 ，ｅｇ ｉｋ 和 Ｃ ｅｋｎ ｋ １８ Ｓ ｄｗ ｃ ｔ ｚｒ ｉｓ ｙ 嘲 等根据 酶 联免疫 吸 附试验 （Ｌ Ｓ） Ｅ ＩＡ 的基 本原 理 结
ELISPOT技术原理及其应用
X坐标：各检测方法的检测结果 坐标：
Y坐标：每百万APC中实际IFN-γ+T细胞数量 坐标：每百万APC中实际IFNAPC中实际IFN
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达科为生物
第二部分： 第二部分：技术特点
1.技术操作流程 1.技术操作流程 2.ELISPOT技术要点 2.ELISPOT技术要点 ELISPOT 3.塑料板与膜板 3.塑料板与膜板 4.膜结构与抗体包被 4.膜结构与抗体包被 5.细胞处理 5.细胞处理 6.有血清与无血清 6.有血清与无血清 7.刺激物选择 7.刺激物选择 8.建立阳性对照 8.建立阳性对照 9.调整适当的细胞浓度 9.调整适当的细胞浓度 10.预培养法与直接法 10.预培养法与直接法 11.各种染色系统 11.各种染色系统
细胞因子的分泌以及对效应细胞的调节构成了一个精确的免 疫系统调节网络。 疫系统调节网络。
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3.ELISPOT技术原理 3.ELISPOT技术原理
达科为生物
用抗体捕获培养中的细胞分泌的细胞因子，并以斑点显色 的方式将其表现出来。
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1，2 ，
3
4
5
6
7
8
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ELISPOT技术要点 2. ELISPOT技术要点
达科为生物
细胞培养和培养前阶段无菌操作， 细胞培养和培养前阶段无菌操作，避免污染 细胞在ELISPOT板上孵育时要避免震动，包括开关 板上孵育时要避免震动， 细胞在 板上孵育时要避免震动 CO2孵箱 洗涤要充分， 洗涤要充分，尤其是裂解细胞之后的洗涤 洗涤时，枪头不能接触到膜，从孔中移出液体采用倾倒 洗涤时，枪头不能接触到膜， 的方式 洗涤最后一次要用高质量的吸水纸拍干
ELISPOT检测技术在儿童结核病诊断中的应用
Ｌ ｉ ｎ Ｃ ｉ ＪＡ Ｇ Ｑ ｎｂ ， Ｉ Ｎ ａ— ｎ ， ＨＥ －ｏ ｇ Ｉ — ， ＨＩ Ｈｕ ｍｉ Ｗｅ， Ｉ Ｎ ｉ—ｏ ＪＡ Ｇ Ｚ ｉ ａ ｇ Ｓ Ｎ Ａ ｄ ｎ ｆ
（ ｅ ｉｇＣ ｉ ｒｎ ＳＨ ｓｉ ｌ ｆｌ ｔｄｔ ａｉ ｌ ｄｃｌ ｎｖｒｔ，Ｂ ｉｎ ００ ５， ｈｎ ） Ｂ ｉｎ ｈｌ ｅ ’ ｏｐｔ ｉａ ｏＣ ｐｔ ｉ ｉ ｓｙ ｅ ｉｇ１０ ４ Ｃ ｉａ ｊ ｄ ａ Ａ ｉｅ ａ Ｍｅ ａ Ｕ ｅ ｉ ｊ
摘要 ： 了评 价 Ｅ ＩＰ Ｔ试 验 在儿 童结 核病 诊断 中 的应 用价值 ， 用 以结 核分 枝杆 菌特异 性蛋 白 Ｅ Ａ － 为 ＬＳ Ｏ 采 Ｓ Ｔ６和 Ｃ Ｐ １ （ｕｔｒ ｆｔ ｔ ｐｏ ｉ １ ） Ｆ 一０ ｃｌ ｅ ｉｒ ｅ ｒｔ ｎ ０ 为抗 原的 Ｅ ＩＰ Ｔ试验技 术 ， ｕ ｌａ ｅ 一 ＬＳ Ｏ 检测 了 ４ ２例非结核性肺疾病患儿 和 ２ ７例活动性
Ｅｖ ｌ ａ ｉ ｎ ｏ ａ ｕ ｔ ｆＥＬＩ Ｐ ｏ Ｓ ＯＴ ｓ ｙ ｆ ｒ Ｔｕ ｅ ｃ ｌｓｓ Ｄｉ ｇ ｏ ｉ ｎ Ｃｈ ｌ ｒ ｎ Ａｓａ ｏ ｂ ｒ ｕ ｏ ｉ ａ ｎ ｓｓｉ ｉ ｅ ｄ
Ｓ ｉ ，ＪＡＯ Ｗ ｅ— ｉ Ｚ ＵＮ Ｌ ｎ Ｉ ｉ ｗｅ ， ＨＡＯ Ｓ ｕ —ｉｇ Ｌ ｈ ｏ Ｈ ，ＨＵ Ｙ ｎ － ｕ ，Ｆ ＮＧ Ｘｕ － ｈ ｎ ｙｎ ， ＩＺ ａ — ａ ｉ ｇｈ ｉ Ｅ ｅ ｌ ｉ
诊断标准参照诸福棠实用儿科学第七版根据临床表现结核分枝杆菌痰涂片抗酸染色影像学检查组织病理学检查等出院时最终确诊结核病病例31例其中原发性肺结核7例原霞性肺结核合并肠结核结核性胸膜炎结核性腹膜炎结核性脑膜炎等肺外结核病患儿18例单纯肺外结核病患儿6例
标 记 免疫 分 析 与 临床
ELISPOT技术简介及实验步骤
one spot
ELISPOT技术优点
• 高灵敏度：单个细胞水平检测，极低频的阳性细胞检
出率——百万分之一
• 高通量：每个研究人员每天可做上百样本的检测 • 冻存标本的检测 • 安全：无放射性污染 • 高性价比：一般细胞实验室即可进行。
ELISPOT应用
• 疫苗开发：评估疫苗效力，或疫苗注射路径影响 • 传染疾病研究：HBV-ELISPOT、TB-ELISPOT • 过敏机制探讨：IL-4诱导免疫球蛋白亚型转换，其它参与
双因子酶联斑点检测
IFN-
IL-4
IFN-/IL-4
双因子荧光斑点检测
IFN-
IL-13
IFN-/IL-13
多色荧光斑点检测
IFN-
IFN-/TNF-/IL-10
TNF-
IL-10
BioRreader 读板
BioReader 3000
BioReader 5000
BioReader 4000
8.ELISPOT技术服务
ELISPOT 全国用户培训 ELISPOT 试剂开发服务
3.试剂的准备
*预包被ELISPOT技术
™ 预包被ELISPOT 试剂盒
6.实验室质控
*ELISPOT质控技术
冻干多价非特异性刺激物 PHA和PMA/IMC ELISPOT细胞质控品
PBMC-SPOTTM细胞
F肽特异性刺激肽
1
B2
1.1
22
69
2,818
6,715
Real Plate B3
1.2
30
77
3,466
11,915
Real Plate D5
12.2
65
酶联免疫斑点法
酶联免疫斑点法酶联免疫斑点法（Enzyme-linked immunospot assay, ELISPOT）是一种用于检测单个细胞分泌物（包括细胞因子、抗体和其他蛋白质）的方法。
该技术将单个细胞和特异性抗体共同培养于多孔的固体基质上，当特异性抗体捕获了细胞分泌物时，就会形成一个“免疫斑点”，而该斑点会通过化学反应显示出来，从而可进行定量分析。
该技术的优点一是提高了灵敏度和特异性，促进了单个细胞分泌物的检测能力。
二是实验条件较容易控制，能够极大地减少误差。
另外，与其他技术相比，ELISPOT技术具有较高的自动化水平和适应性。
同时，该技术可用于评估和比较不同治疗方案或疫苗的效果、评估细胞免疫反应、疾病诊断和监测、评估药物毒性和进行基础研究。
在实验中，ELISPOT可分为两个阶段。
第一阶段是细胞培养，即将感兴趣的细胞和特定的刺激物共同培养。
第二阶段是免疫斑点检测，即将细胞移到多孔的固体基质上，添加特异性抗体进行反应，以发现并定量斑点。
常用的免疫斑点计数仪可以通过电子显微镜对固定、染色的免疫斑点进行准确计数，从而获得准确的结果。
通过该技术，研究人员可以研究细胞免疫和疫苗的作用机制，及早发现传染病或肿瘤的预警信号，以促进更好的预防和治疗。
此外，酶联免疫斑点法也适用于儿童疫苗接种后对疫情的监测和跟踪，以及老年人免疫力的评估。
需要指出的是，这种技术并不能够直接用于临床检测，仅在研究领域发挥作用。
一些商业实验室已经开始使用该技术进行疫苗测试和特定蛋白质的检测，在检测和诊断方面具有很大的潜力。
总之，酶联免疫斑点法是一种基于细胞分泌物检测的技术手段，在生物医学研究、药物开发以及疾病预防和治疗等方面具有较为重要的应用价值。
ELISPOT-技术
14
• 高产量 T 细胞分析成为可行。一个经过训 练的相关实验室小组可以测试成百的样本 中几十种抗原的反应。只需要少量细胞， 就可以用于通其他细胞学分析方法进行比 较。例如，45 毫升的血液就足以用于测试 600 种不同抗原/肽类物质的反应。可以定 义CD4 和CD8 细胞的免疫因子指标。这是 因为只需要少数细胞，分析就可以在高产 量模式下进行。
15
• 可以定义CD4和CD8细胞的免疫因子指标。 这是因为只需要少数细胞，分析就可以在 高产量模式下进行。ELISPOT 分析在筛选 肽库，绘制免疫因子方面是一个理想的工 具。
• 用于确定抗原特异性 T 细胞的功能性亲和 力。这最大可能受到肽类药物刺激至50%的 影响。
• 可以用于研究未经药物处理过的细胞的分 泌过程。如果观察到净产量减少，可以确 定这种区别是来自于分泌细胞的减少，还 是每个细胞分泌产量的减少。
2
ELISA 和ELISPOT区别
• ELISA 通过显色反应，在酶标仪上测定吸 光度，与标准曲线比较得出可溶性蛋白总 量。
• ELISPOT 也是通过显色反应，在细胞分泌 这种可溶性蛋白的相应位置上显现清晰可 辨的斑点，可直接在显微镜下人工计数斑 点或通过 ELISPOT 分析系统对斑点进行计 数， 1 个斑点代表 1 个细胞，从而计算 出分泌该蛋白的细胞的频率。
5
6
ELISPOT 解决了以下问题
• 哪些斑点是抗原特异性 T 细胞产生的（此斑点 具有进一步分析价值），哪些是无关细胞产生的 （此斑点没有 T 细胞研究价值）
ELISPOT实验技术
酶联免疫斑点技术介绍一、 ELISPOT技术概述1. 技术原理和技术特点ELISPOT全名为酶联免疫斑点检测，英文：Enzyme-linked Immunospot Assay。
它结合了细胞培养技术与酶联免疫吸附技术（即ELISA技术），能够在单细胞水平检测细胞因子的分泌情况。
其技术原理，一句话概括就是：用抗体捕获培养中的细胞分泌的细胞因子，并以酶联斑点显色的方式将其表现出来（Sedgwick JD 2005）。
该技术检测细胞因子具有三大优点：其一，灵敏度高。
在一百万个阴性细胞中只要有一个分泌细胞因子的阳性细胞即可被检测出来。
这是目前为止，最为灵敏的检测技术，灵敏度比传统的的ELISA方法高2-3个数量级。
其二，单细胞水平，活细胞功能检测。
ELISPOT检测的是单个细胞分泌，而非细胞群体的平均分泌。
在检测的过程中，有活细胞培养与抗原刺激阶段，检测的是活细胞的功能，而非死细胞的遗留物。
其三，操作简便经济，可以进行高筒量筛选。
ELISPOT没有复杂的细胞体外扩增过程，不使用同位素，不需要大型的、专门的实验仪器设备。
按照标准化的实验操作，一个实验者可以同时处理数百个样品，效率远远高于其它检测方法（Kalyuzhny AE 2005）。
实验设计在96孔培养板上进行，直接以培养板的塑料板底或者PVDF膜以及硝酸纤维素膜为基质，包被上特异性的单克隆抗体，用以捕获细胞分泌的细胞因子。
（由于涉及到细胞培养的过程，对单克隆抗体的要求要远高于ELISA中的捕获抗体，该抗体需要无毒，不含内毒素，亲和力高等特点。
）之后，在培养板的孔内加入细胞培养基（现在无血清ELISPOT技术已经成熟，培养基中可以不再含有血清）、待检测的细胞以及抗原刺激物进行培养。
在特异性的抗原或者非特异性的有丝分裂原的刺激下，数小时之内，T细胞就会开始分泌各种细胞因子。
细胞因子当即就被位于细胞下方的膜上的单克隆抗体所捕获。
在洗去细胞之后，被捕获的细胞因子可以与生物素标记的第二抗体结合，然后用酶标亲和素再与生物素结合，进行化学酶联显色，就可以在膜的局部形成一个个圆形的斑点。
ELISPOT技术原理及其操作
LDA 能够对特异性 CTL 细胞进行定量,曾在很多年中被认为是 CTL 检测的“金标 准”，它使人们能够详细了解免疫反应动力学和记忆毒性 T 淋巴细胞(memorial CTL, mCTL) 亚群的细胞周期。但该方法需要高强度抗原刺激, 这会加快效应 CTL(eCTL)凋亡,且不能定量测定 eCTL 细胞数量或测定值偏低。其次,该方法较繁 琐,培养时间可长达 2～3 周，而且很容易造成 T 细胞数量损失。
ELISPOT 技术
在免疫学领域中,对于疾病以及疫苗研究不仅仅局限于体液免疫应答,细胞介导 的免疫应答(cell mediated immune response , CMI)也是人们所关注的,而 T 细 胞在 CMI 中起关键作用。在研究细胞免疫应答保护作用及其机理方面,有多种研 究 方 法 可 以 使 用 ， 如 ： ELISA （ 酶 标 记 免 疫 附 测 定 法 ， enzyme-linked immunosorbent assay）、流式细胞分析术（flow cytometry）、定量 RT-PCR 以及这里要介绍的近年使用越来越多的 ELISPOT。作为一项新型的免疫酶技术 ——酶联免疫斑点法(enzyme linked immunospot assay, ELISPOT) ,是从单细 胞水平检测分泌抗体细胞(ASC) 或分泌细胞因子(CK) 细胞的一项细胞免疫学 检测技术。由于该方法敏感性高,易操作,成本相对流式细胞分析术也较低，已被 广泛用于分泌 CK 细胞检测或 ASC 测定中。下面将从原理、具体实验操作、技术
与 ELISPOT 法相比较,胞内 CK 染色法(intra-cellular CK staining,ICS) 主要 应用细胞内累积细胞因子的染色和多色参数的 FACS 法,是检测循环淋巴细胞中 抗原特异性 T 淋巴细胞的可行方法,而 ELISPOT 法却可以检测所有分泌 CK 的 eCTL 。
分子医学技能：酶联免疫斑点(ELISPOT)技术
特点：
❖斑点可持久保存并进行计数分析
❖易操作、有效、快速、灵敏度高
✓ 细胞因子的检测不易受非分泌细胞的干扰 ✓ 比传统的ELISA和细胞内细胞因子染色法敏感20-200倍
❖样本量大的情况下实验结果可用计算机图象分 析系统进行快速、客观的分析
❖
基
Coating Ab
本
包被培养孔
原
理
根据实验设 计加入淋巴 细胞及含或 不含刺激因 子的培养液
酶联免疫斑点(ELISPOT)技术
❖ELISPOT（Enzyme-linked Immunospot Assay）
▪ 结合了细胞培养技术与酶联免疫吸附技术（即 ELISA技术），能够在单细胞水平检测细胞因子 的分泌情况；
▪ 用抗体原位捕获培养中的细胞分泌的细胞因子， 并以酶联斑点显色的方式将其表现出来。
❖双色ELISPOT结果示意图
蓝色：IFN-γ,红色：IL-2; 蓝色：IFN-γ,红色：IL-17
❖ ELISPOT
▪ B细胞杂交瘤的筛选 ▪ 化合物和药物免疫学反应的检测 ▪ 优化树突细胞和T细胞的抗肿瘤活性 ▪ 靶向疫苗的质控
方 ▪ 自身免疫疾病的诊断和预后分析 法 ▪ 自身免疫疾病免疫治疗的监控 主 ▪ 过敏性疾病的脱敏治疗的监测 要 ▪ 器官移植中排斥反应的预测 用 ▪ 微量组织、肿瘤和免疫细胞分泌谱的分析 途 ▪ 结核病的诊断
▪ 显色剂I和II应避光保存，不使用时切勿混合
❖ ELISPOT 实 验 结 果 示 意 图
细胞因子A
双抗体包被
❖双色ELISPOT原理
培养细胞 细胞因子B
包被抗体
Biotin-检测抗体
HRP-检测抗体 BCIP/NBT底物
AEC底物
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具体操作流程及常见问题
◆ 操作流程演示
◆ 常见问题小结
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第一天
第二天
1 2 3 4 5 6 7
PVDF膜酒精浸润 PBS洗涤三次 预包被可 加包被抗体过夜 以省去的 步骤 PBS洗涤三次 封闭，室温2小时 PBS洗涤三次 加入细胞和刺激物孵育过夜
无 菌 操 作
第三天
8 去除细胞，PBST4℃十分钟后洗涤三次 9 加检测抗体，室温孵育1.5小时 10 PBST洗涤三次 11 加SAP室温孵育1小时 12 PBST洗涤三次 13 加入 BCIP/NBT显色 14 计数，结果分析
1 2 3
人血分离 PBMC 方案
小鼠脾脏 淋巴细胞 分离方案
小鼠、大 鼠、兔子 血液淋巴 细胞 分离方案
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厂家
产品编号 AS1114544 AS1114545 用途 主要成分 密度 渗透压 AS1019818
产品名称 LymphoprepTM 分离液（即 用型） （也称之为淋巴细胞分离液）
规格
MABTECH ELISpot技术 应用简介
任东 莱兹技术部
1
ELISpot原理、优势及应用
主 要 内 容
具体操作步骤 常见问题总结
技术的改进
参考文献
2
Mabtech 公司是世界首家研发和生产ELISpot 试 剂盒的公司，为广大科研和临床用户提供稳定的 高质量的产品，包括人类、非人灵长类、大鼠、 小鼠等种属的T淋巴细胞因子和B细胞分泌抗体检 测产品，其中非人灵长类试剂盒是科研人员首选 之品。
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爱恨交加的 血清培养基
血清这一生物制品，含有 许多未知成分，以及受着 动物个体差异的影响
实验需要血清
细胞孵育离 不开血清 实验要避开 血清干扰
血清干扰ELISPOT
改进：只取血清中维持淋巴细胞生长所需要 的必须成分，去除其他杂质做成培养基
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细胞培养基 的改进 原理即，将血清中对淋巴细胞维持所必需的成 分（包括营养代谢成分、细胞信号成分和多种生长因 子），把它们做成原料，添加到空白培养基中。然后 需要反复验证这些添加成分，保证它们能够满足以下 三个要求：
洗涤时间和次数不 够，导致背景过深。
洗涤时间和次数比较合适， 背景容易分辨斑点。
26
3
细胞和刺激物的浓度
细胞浓度通常为2～5×105cells/well，刺激物浓 度10～50ug/mL，依据实际情况摸索形成最适密度 的单细胞层分泌合适的斑点数。
27
4
包被抗体的量
包被抗体的质量和浓度与斑点的大小形态很有 关系，如下图，随着包被抗体浓度的增加斑点变得 清晰致密。
8
◆ 悬浮在ELISpot板膜上的细胞，它
分泌细胞因子是没有方向性的，均匀 地向四面八方扩散，其中路径越短， 扩散中耗散损失就越少，到达该点的 细胞因子就越多，将来显色的时候颜 色就越深。
◆不同的细胞，对不同的刺激物，不
同的细胞因子，ELISpot斑点的直径 （平均直径）也不同，如果一次实验 中有两类细胞同时受到刺激，比如T 细胞与巨噬细胞，或者一次实验中T 细胞受到两种不同的刺激物刺激，比 如蛋白抗原与内毒素（大肠杆菌表达 的蛋白很可能含有较高浓度的内毒 素），那么同一个孔中就会出现两种 不同的斑点。
价格
Axis-shield 专一型分离液
用途
主要成分 密度 渗透压
1x250 ml ￥590 4x250 ￥1,800 ml 分 离 人外 周血 单个 核细 胞 PBMC ， 250ml 可 分离 250ml全血 Sodium diatrizoate (离子碘化物) 和多聚糖（黏性 相对较高） 1.077±0.001l g/mL(20 º C) 290±15mOsm 18Tube LymphoprepTM 分离管（即 s ￥1,350 用型） x10ml 分离人外周血单个核细胞PBMC，每管可分离10ml 全血 泛影葡胺钠(Sodium diatrizoate) 和多聚糖（黏性 相对较高） 1.077±0.001l g/mL(20 º C) 290±15mOsm
0.2ug/well
0.5ug/well
1.0ug/well
28
5
细胞、刺激物加样
要领为：先加刺激物（悬空滴加），然后悬在
孔的正上方，逐滴滴加细胞悬液(自然滴下)，此过 程中要避免产生气泡以及剧烈晃动培养板。这样细 胞就能依靠扩散的原理，均匀的分布在孔板内，避 免了贴壁细胞产生。
注意：一定不要拍击板子来 让细胞混匀，那样会适得其 反。
9
ELISPOT的优势
高通量检 测 灵敏度高 功能性检测 单细胞 水平
只要阳性细胞频率大于 4 个/60 万细胞，就可 以被ELISpot检测出来。 这算出来的实际灵敏度 为十五万分之一。
直观， 可信度高
10
ELISpot 技术的应用领域
移植中排斥反应的预测和监测。 疫苗研发和机制研究。 Th1/Th2极化的分析和研究。 自身免疫病研究。 肿瘤致病机制和治疗药物的研究和开发。 变态反应性疾病等自身免疫病研究。 感染性疾病的治疗和研究。
19
离心之后的 PBMC沉淀
PBMC计数
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准备5%CO2 37℃培养箱培养
＊适当浓度的抗原
（10-50μg/ml）
＊适当浓度的细胞悬
液（2～5×105/孔）
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BCIP/NBT底物
细胞因子单克隆抗 体
生物素化检 测Ab
抗生物素ALP
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室温下显色2-10分钟
室温避光过 夜晾干之后，读 板，或者晾干避 光保存。
厂家
产品编号 AS1114542 用途
产品名称
规格
价格
主要成分 密度 渗透压 AS1106865 用途 Axis-shield 全能型分离液 主要成分 密度 渗透压 AS1002424 用途
主要成分
OptiPrepTM 分离液（即用型） 1x250ml ￥1,240 最新型全能型分离液：可多种细胞，如分离人/哺乳 动物 PBMC ，也可分离单核细胞，多型核细胞、 DC 、 肝星状细胞、精子等；也可分离亚细胞器，如线粒 体、核糖体、溶酶体、核等；也可分离生物大分子， 如脂蛋白、蛋白、质粒DNA以及微生物等。 Iodixanol（非离子碘化物、低渗、低黏性、无毒） 1.320±0.001g/mL(20 º C) 170±15mOsm NycoPrepTM Universal 分离液 1x300ml ￥1,425 （即用型） 全能型分离液：可多种细胞，如分离人 / 哺乳动物 PBMC ，也可分离单核细胞，多型核细胞、 DC 、肝 星状细胞等；也可分离亚细胞器，如线粒体、核糖 体、溶酶体、核等；也可分离生物大分子，如脂蛋 白、蛋白、质粒DNA以及微生物等。 Nycodenz （ 非 离 子 碘 化 物 、 无 毒 ， 密 度 高 于 1.26g/ml时轻微高渗） 1.310±0.001g/mL(20 º C) 580±15 mOsm 1x500g ￥3,580 Nycodenz 粉剂 全能型分离液：可多种细胞，如分离人 / 哺乳动物 PBMC ，也可分离单核细胞，多型核细胞、 DC 、肝 星状细胞等；也可分离亚细胞器，如线粒体、核糖 体、溶酶体、核等；也可分离生物大分子，如脂蛋 白、蛋白、质粒DNA以及微生物等。 Nycodenz （ 非 离 子 碘 化 物 、 无 毒 ， 密 度 高 42于 1.26g/ml时轻微高渗）
ICE Peptide Pool 2x105 hu-PBMC indirect
tetanus 105 hu-PBMC indirect
ConA 2.5x104 hu-PBMC indirect
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培养基的改进
淋巴细胞 分离技术
ELISPOT 技术改进
淋巴细胞
冻存、复
苏技术
的改进
的改进
Reader的改进
29
拍击后细胞的贴壁实例
30
6
细胞的培养
1
2
培养过程中避免培养板的剧烈震动，以免形 成“拖尾”现象（图1）。但是如果大部分斑点 形态正常，只有少数有此现象时多数是因为DC 31 趋化所致（图2）。
7
斑点的出现空斑
主要原因：粒细 胞分泌或分解所致的
酶解现象。
可以通过采用多
价刺激物，以及提高
PBMC的分离质量来改 善。
3
原理
酶联免疫斑点检测（Enzyme-Linked ImmunoSpot Assay, ELISpot），从字面
上来说，可以分解成两部分：“酶联免疫” 与 “斑点”。
4
ELISA
ELISPOT
抗体捕获的抗原来自于样品细 胞在检测的当时新鲜分泌的抗原 分子
酶 联 免 疫 斑 点
抗体捕获的抗原来自样品 溶液中的已经存在的、均匀 分布的抗原分子
32
CDC的采集的一个实例： （透明板，PBMC，乙肝核心抗原蛋白）
33
8
显色时机的把握 显色时间一般控制在2～
10分钟，要依斑点的形成情
况适时终止显色。
显色反应和温度有很大的
关系，如果室温很低（如冬
季），可以适当延长显色的时
间。
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技术的改进
PMA/ionomycin 2.5x104 hu-PBMC indirect
抗原决定簇图谱分析。
化合物和药物免疫学反应的筛选等。
11
中国药品生物制品检定所： 2003年 《预防用DNA疫苗临 床前研究技术指导原则》《预防用以病毒为载体的活疫苗 制剂的技术指标原则》“使用ELISPOT方法检测淋巴细胞 分泌γ干扰素功能，应该作为检测和评价疫苗的细胞免疫的 有效方法” WHO：WHO-UNAIDS-sponsored training workshop 2003年 在艾滋病(HIV)疫苗的研究中，推荐使用ELISPOT 检测淋巴细胞分泌γ干扰素功能。 卫生部文件（【2012】6号）：增补结核感染T细胞检测 （免疫斑点法）等临床检验项目。