体内药物分析问答题

SPE：固相萃取(Solid Phase Extraction，SPE)就是利用固体吸附剂将液体样品中的目标化合物吸附，与样品的基体和干扰化合物分离，然后再用洗脱液洗脱或加热解吸附，达到分离和富集目标化合物的目的。

1、简述体内药物分析的对象及特点
体内药分的对象：人体和动物体液、组织、器官、排泄物
特点：（1）样品量少，不易重新获得
（2）样品复杂，干扰杂质多
（3）供临床用药监护的检测分析方法要求简便、快速、准确，以便迅速为临床提供设计合理的用药方案及中毒解救措施。

（4）实验室拥有多种仪器设备，可进行多项分析工作。

（5）工作量大，测定数据的处理和阐明有时不太容易。

需相关学科参与.
2、简述血浆中游离型药物浓度测定的方法？
平衡透析法、超滤法(UF)、超速离心法和凝胶过滤法
3、常见的生物样品有哪些？简述常用的去除蛋白质的方法？
常见的生物样品有：血液，尿液，唾液，组织，毛发。

去除蛋白质的方法：（1）加入与水相混溶的有机溶剂加入水溶性的有机溶剂；可使蛋白质的分子内及分子间的氢键发生变化而使蛋白质凝聚，使与蛋白质结合的药物释放出来。

常用的水溶性有机溶剂有：乙腈、甲醇、乙醇、丙醇、丙酮、四氢呋喃等。

（2）加入中性盐加入中性盐，使溶液的离子强度发生变化。

中性盐能将与蛋白质水合的水置换出来，从而使蛋白质脱水而沉淀。

常用的中性盐有：饱和硫酸铵、硫酸钠、镁盐、磷酸盐及枸橼酸盐等。

（3）加入强酸当pH低于蛋白质的等电点时，蛋白质以阳离子形式存在。

此时加入强酸，可与蛋白质阳离子形成不溶住盐而沉淀。

常用的强酸有：10％三氯醋酸、6％高氯酸、硫酸-钨酸混合液及5％偏磷酸等。

（4）加入含锌盐及铜盐的沉淀剂当pH高于蛋白质的等电点时，金属阳离子与蛋白质分子中带阴电荷的羧基形成不溶性盐而沉淀。

常用的沉淀剂有CuSO4-NaWO4、ZnSO4-NaOH等（5）酶解法在测定一些酸不稳定及蛋白结合牢的药物时，常需用酶解法。

最常用的酶是蛋白水解酶中的枯草菌溶素。

4，生物样品预处理的目的是什么？应考虑哪些问题？
目的：（1）使药物从缀合物及结合物中释放。

（2）纯化与富集样品（3）满足测定方法对分析样品的要求。

（4）保护仪器性能，改善分析条件
主要应考虑下列问题：（1）生物样品的种类（2）被测定药物的结构、理化及药理性质、存在形式、浓度范围（3）药物测定的目的（4）样品预处理与分析技术的关系
5，用液液萃取发提取生物样品中的药物时，应考虑那些影响因素？
要考虑所选有机溶剂的特性、有机溶剂相和水相的体积及水相的pH值等。

对所选用的有机溶剂，要求对被测组分的溶解度大：沸点低，易于浓集、挥散；与水不相混溶以及无毒、化学稳定、不易乳化等。

最常用的溶剂是乙醚和氯仿等。

提取时所用的有机溶剂要适量。

一般有机相与水相（体液样品）容积比为1：1或2：1。

根据被测药物的性质及方法需要，可从实验中考察其用量与测定响应之间的关系，来确定有机溶剂的最佳用量。

PH 的影响在溶剂提取中十分重要。

水相的pH随药物的理化性质的不同而异，但生物样品一般多在碱性下提取。

这是因为多数药物是亲脂性的碱性物质，而生物样品中的内源性物质多是酸性的，一般不含脂溶性碱性物质，所以在碱性下用有机溶剂提取时内源性杂质不会被提取出来。

6，固相萃取法的洗脱方式有哪两种？以亲脂性固相萃取柱为例，简述操作过程。

一种是药物比干扰物质与固定相之间的亲和力更强，因而在用冲洗溶剂洗去干扰物时药物被保留，然后用一种对药物亲和力更强的溶剂洗脱药物。

另一种干扰物质较药物与固定相之间
的亲和力更强，则药物被直接洗脱，干扰物质被保留在萃取柱上。

操作步骤：1吸附柱的选择：据检测量大小、待检物质理化性质。

2活化填料：采用甲醇活化，有利于吸附剂和目标物质相互作用，提高回收率，还能起到除杂作用。

3进样：使样品流经吸附柱进行吸附。

4冲洗：用水或者是适当的缓冲溶液对吸附柱进行冲洗，将杂质冲洗掉。

5洗脱：选择适当的洗脱剂进行洗脱，收集洗脱液，然后进行浓缩检验或者是直接在线检验
7.以色谱法为例，简述色谱条件优化时可进行哪些试验？
（1）试剂与溶剂试验。

照拟定的分析方法进行衍生化反应，萃取分离等样品预处理（反应试剂，衍生化试剂，萃取溶剂等）后，进样分析以考察反应试剂对测定的干扰。

通过改变反应条件、萃取方法或萃取条件，甚至检测器类型。

使空白试剂信号不干扰药物的测定（如R ＞1.5）。

本步骤主要考察需经化学反应的预处理过程，若预处理过程仅为生物样品的提取分离，则可不进行该步骤，直接进行空白生物基质试验。

（2）空白生物介质试验。

取空白生物介质，如空白血浆，按照拟定的生物样品预处理与样品分析方法操作。

考察生物介质中内源性物质对测定的干扰，在待测药物(或特定的活性代谢物、内标物质等)的“信号窗”内不应出现内源性物质信号。

（3）质控样品试验。

取空白生物基质，加入待测药物制成标准样品和质控样品，照“生物介质试验”项下方法试验，建立分析方法的定量范围与标准曲线，并进行方法的精密度与准确度、灵敏度、药物的萃取回收率等各项技术指标的评估。

同时进一步考察待测药物(或内标物)与内源性物质(或其它药物)的分离情况。

8.生物样品分析中标准曲线建立的一般步骤（以色谱法为例）
步骤：（1）标准系列溶液的制备。

精密称取待测药物的标准物质适量，用甲醇或其他适宜溶剂溶解并定量稀释制成一定浓度的标准贮备液，冰箱保存备用；精密量取标准贮备液适量，用水或其他适宜溶剂定量稀释制成系列标准溶液。

标准溶液的浓度以标准样品中药物浓度的10~50倍为宜，加入量为标准样品总体积的2%~10%。

若为难溶性药物，可使用有机溶剂或适当降低溶液浓度，但应除去溶剂后再加入生物基质，否则,在实际样品测定时应加入等体积的溶剂并涡旋混匀，以抵消溶剂的影响。

线性模式的标准曲线至少应包含6个浓度点(不包括零点,即空白)。

（2）内标溶液的制备。

设定最高浓度为100，最低浓度为1(个体差异)，内标溶液的浓度一般选择与标准系列溶液的中间浓度相当。

如：某标准溶液5、10、20、40、80、160、320μg/ml，则内标的浓度应配制成40μg/ml3.
（3）标准系列标准样品的制备。

取空白生物基质(如血浆)，加入标准系列溶液适量，涡旋混匀。

为防止在标准溶液加入及涡旋混合时造成的损失：①先加入标准溶液②再加入空白生物基质③涡旋混匀实验中的注意事项：①标准模拟生物样品的最高浓度应高于生物体用药后的达峰浓度，最低浓度应低于最高浓度的10％～5％。

②应先在离心试管中加入标准溶液，再加入空白生物基质后混悬。

③标准溶液加入到试管中后，应先挥干溶剂再加入空白生物基质。

（4）标准曲线的绘制。

以待测药物的检测响应(如色谱峰面积或峰高)或与内标物质的检测响应的比值(内标法)(因变量,y)对模拟血药浓度(自变量,x)求得回归方程(y＝a＋bx)及其相关系数（γ）。

在一组由至少7个浓度(不包括零点)构成的标准曲线中，至多可有2个浓度点数据，可予剔除。

但应有确切原因，如：（1）样品处理有损失；（2）色谱图有问题；（3）显著偏离标准曲线。

其余应有至少5个浓度点在标准曲线上。

9.萃取回收率能否说明方法具有较高的准确度？
萃取回收率有别于前述准确度效能指标项下的分析方法回收率，分析方法回收率是采用“回收实验”或“加样回收试验”得到的药物自样品中的回收率，它表示分析方法的准确度，又称相对回收率。

萃取回收率则称为绝对回收率，它是指经预处理（如萃取）后能将生物样品中的药物用于分析的比例，如以色谱分析为例，它是指能将多少比例的药物自样品中萃取出来用于进样分析。

10.试述放射免疫分析法中游离标记物语结合标记物的分离方法及各自的优缺点。

①第二抗体沉淀法用RIA反应中试剂抗体（一抗）来源动物的IgG免疫另一种动物，制得抗IgG血清（二抗）。

RIA反应结束时，加入二抗，使其形成抗原-一抗-二抗的双抗体复合物；但因一抗含量甚微，此复合物也少，不易离心分离，一般还需加入一定量的与一抗同种动物的血清或IgG，使其与二抗形成较大量的可见沉淀物，与双抗体复合物共同沉淀；离心后，即可有效的分离B与F。

也可将二抗与某些颗粒固体物相连，制成固体二抗，分离B与F效果也好。

②聚乙二醇（PEG）沉淀法PEG能非特异地沉淀抗原抗体复合物等大分子蛋白质，而不沉淀小分子抗原。

其优点是沉淀物完全且经济简便，但非特异性结合率较高，且当温度高于30℃时，沉淀物易复溶。

③PR试剂法将二抗与PEG按一定比例混合成悬液，是二抗法与沉淀法相结合的方法。

此法保留了二者的优点，节约了二者的用量，分离迅速，简便。

④活性炭吸附法活性炭可吸附小分子游离抗原或半抗原，而大分子蛋白质（如抗体和免疫复合物）则留在溶液中。

利用此原理，在反应后加入活性炭颗粒，使游离的标记抗原（F）吸附到颗粒上，再离心使颗粒沉淀，上清液中含标记抗原抗体复合物（B）供测定。

该法主要用于小分子抗原或药物的测定。

11.用HPLC法进行体内药物分析时有哪些直接进样的方法，各有什么特点？
（1）直接进样与沉淀蛋白进样；（2）柱切换技术；（3）胶束色谱；（4）限进填料。

12.免疫分析法的基本特点及基本试剂组成。

特点（1）特异性：一种抗原分子只能与由它刺激产生的抗体发生特异性结合反应.
（2）可逆性：抗原与抗体的特异性结合是由于两者的分子结构及立体构型相互吻合,它仅发生在分子的表面,并依靠抗原一抗体分子间的静电力作用,疏水作用,氢键作用及范德华引力等而存在.是可逆反应,改变反应条件可使结合物发生水解.
（3）最适比例性：抗原抗体的结合反应具有一定的量比关系.只有当抗原抗体两者的分子比例合适时,才能发生最强的结合反应.
三种基本试剂:标记抗原,未标记抗原和特异抗体。

13.毒物产生毒性作用的基本条件和影响因素有哪些？
（1）毒物的成分
（2）起作用的剂量：安全剂量，中毒量，致死量
中毒量：毒物引起个体中毒并出现中毒症状的剂量；造成死亡的剂量称为致死量（LD）某一毒物能引起某种动物的群体全部死亡的最小剂量成为全数致死量（LD100）;引起半数动物死亡的剂量称为半数致死量（LD50）
（3）作用途径与方式：摄入途径，吸收和分布特性，给药的浓度和速度
（4）受作用的生物体：同生物体的种属有关
（5）个体因素：年龄、性别、体重、健康状态、身体素质以及生活习性
14. 改良Stas-otto法的适用条件及操作流程。

当分析目标不够明确，或怀疑有多种毒物存在时，可采用改良Stas-Otto法进行分离萃取。