实用ELISA教程

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取16孔标准品的量。举例，我的标准品储存浓度是270ng/ml, 标准品分7个点，最高浓度是 1000pg/ml，每孔100ul, 2倍递减，所以是1000， 500， 250， 125， 62.5 ， 31.2， 15.6 pg/ml, 7个孔我需要0.2ng标准品。 做ELISA必须有复孔。所以，两排14个孔我需要0.4ng标准品, 1.5ul。 标准品稀释步骤： 取7个EP管，第1管放400ul缓冲液，第2到7管放200ul缓冲液。将1.5ul标准品加入到第一管中， 200ul枪轻轻吹打混匀。从第1管中取200ul加入第2管中，吹打均匀。依次稀释。第7管有400ul液 体，最后只用200ul。 标准品加样步骤： 从第1管中取100ul加到A1孔，再100ul加到A2复孔中。 第2到7孔，参考上述步骤。 第8孔，H1和H2加没有标准品的缓冲液，作为阴性对照。 样本加样： 血清或者细胞上清，解冻之后混匀，建议3000RPM离心10分钟，沉淀液体中的固体杂质。
Elisa 实用操作手册
• 给师弟科普ELISA基本步骤。与其写个文档， 不如直接写帖子，反正工作量一样。我自 己做ELISA也只是初学者，所以说得不对的 地方，请大家多多指正。
ELISA有白底（上图，不可拆）和黑空板子 （可拆，8个一排，12排）。用吸光度（一 般是450nm的OD值）来检测，就只能用白 底的板子。黑底的板子可以用Lumin读数。 第一步，拿到板子，还有封盖膜。
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第二天早上，来洗掉包被液。 注意事项： 1. ELISA用的所有液体系统，记得一定要预先调PH值到7.2-7.4之间，最好按 照说明书都无菌过滤过。1XPBS的PH值在7.68左右，仍然需要加盐酸调酸一 点。Trizma base配出来，PH在9.98,必须调PH!否则ELISA中抗原抗体根本不ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ能正常结合。蛋白对于PH值极度敏感。 2. 无菌要求多高，现在不知道。建议无菌配好的液体放在4度冰箱保存。每次 用之前，放在室温下至少15分钟。ELISA用的液体，室温的温度，效果比较 好。 洗包被液的时候，直接把板子翻过来，弃掉液体。在厚厚的吸水纸上，用力 拍打板子，力求把孔中的液体完全弃干净。 用WASH BUFFER洗涤三次。因为孔的最大容量是400UL,但是300UL基本就 可以把孔覆盖满。所以，建议洗板子的时候，每孔加350ul左右。 注意事项： 1.每次洗涤的时候，尽量拍干孔中液体。这样洗涤得比较干净。 2. 孔中没有液体时候，动作一定要快！！！ELISA包被后的孔，绝对不能干 掉！否则非常影响结果。
• 第二步：用100ul包被抗体，包被好板子之后，轻弹混匀。将封盖膜 的白色撕去，用透明有粘性的膜，贴在板子上，把膜压紧（贴膜是为 了防止液体挥发，所以一定要把每孔黏牢）。 室温孵育过夜。
注意事项： 1.如果一次只做一部分孔，贴膜可以剪刀剪开，只用一部分。保证膜 可以把加液后的孔盖住就可以。 2.加样时候，一定要保证每孔加样量完全一样。避免因为操作原因， 每孔液体量有区别。ELISA比较敏感，操作误差会导致最后读数有不 小的差别。 3.加的样，保证样品加在孔底，不要粘在管壁上，减少孔与孔之间的 差异。
• 3.封闭。 用是1%BSA in 1XPBS. 无菌过滤，4度保 存，用之前放在室温复温。 封闭液最好可以封闭全孔，所以每孔加 300UL封闭液，室温1小时。
4. 弃掉封闭液，拍干 。 洗涤三遍。步骤如前。
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5. 加标准品和样品。 标准品储存浓度很高，而且蛋白很忌反复冻融。建议第一次使用时，分装。可以48孔一只，-80 度冰箱保存，可以有效保存半年。4度保存，有效期是60天，而且浓度会衰减。
• 8.弃掉检测抗体液，拍干。 洗涤三遍。 9. 加Streptavidin-HRP(亲和素-辣根过氧化物酶)，这个一直4度 保存，使用的时候200倍稀释（96孔，9.6ML液体，加48ul的 Streptavidin-HRP，9552ul的缓冲液）。 100ul每孔，室温，避光（这步开始要避光），孵育20分钟。
• 样品稀释的一般原则
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• X,Y轴都取对数之后，可以看见点与点之间成直线。
但是，R2只有0.967，一般比较好的标准曲线， 应该是0.99左右。 • D1与D2的重复性不好（标准品浓度， 125pg/ml），可能是个人操作原因。 根据标准品得到的公式，就可以根据OD值来计算 各个样本检测浓度。
• 关于ELISA标本收集： 1. 血清：室温血液自然凝固 10-20 分钟后，离心 20 分钟 左右（ 2000-3000 转 / 分）。收集上清。如有沉淀形成， 应再次离心。 2. 血浆：应根据试剂盒的要求选择 EDTA 、柠檬酸钠或 肝素作为抗凝剂，加入 10 ％（ v/v ）抗凝剂 ( 0.1M 柠檬 酸钠或 1% heparin 或 2.0%EDTA.Na2) 混合 10-20 分钟 后，离心 20 分钟左右（ 2000-3000 转 / 分）。仔细收集 上清。如有沉淀形成，应再次离心。 3. 尿液：用无菌管收集。离心 20 分钟左右（ 2000-3000 转 / 分）。仔细收集上清。如有沉淀形成，应再次离心。 4. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。 离心 20 分钟左右（ 2000-3000 转 / 分）。仔细收集上清。 保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
10. 弃掉液体，拍干。洗涤三遍。
11. 加底物液（substrate solution）,A液：B液=1:1，用之前临时 混起来。储存的时候A，B两液分别储存在4度冰箱。 每孔100ul（等于每孔A液50ul，B液50ul），室温，避光，20分 钟。
• 说明： 1. 加AB液之后，白色的孔就会显色。淡绿色，颜色深浅跟目 标蛋白浓度正相关。 2. 生物素与亲和素结合，可以放大免疫反应的效应，便于显色。 3.ELISA包被的板子采用平底（flat），大概60个96孔板，260 美元左右。 白色的板子虽然不能拆卸，但是不用的孔，只要别污染，下次 可以用，所以一块板子等同于可以拆开来用。 12. 保留AB液在孔内，直接每孔加50ul的终止液（2N H2SO4）。终止液也是公司买的专门ELISA用的。 加完终止液，轻弹板子，混匀。可以看见淡绿色变为亮黄色。 黄色的颜色深浅，与绿色一致，与目标蛋白的浓度成正相关。
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按照顺序，每孔加100ul样本，记得做复孔。加样体积一定要一样，但是动作要快。样本还是一 定要保证加到管底，不要粘附到管壁上。 标准品和样品，每孔100ul，室温孵育2小时。
• 6. 弃掉液体，拍干。洗涤3遍。
• 7. 加检测抗体（detection antibody,尾端有生物素biotin）， 每孔100ul（储存液也是放-80度，用之前解冻后加缓冲液 混匀，稀释到工作浓度，缓冲液的PH值都已经调到7.27.4之间）。 室温孵育2小时。 备注：以上这些步骤没有要求避光。所以，每次加样之后， 只要保证把贴膜都贴牢，防止液体蒸发和孔间干扰即可。 板子可以放在操作台上。 不过因为操作习惯，即使不避光的步骤，也可以把板子放 在室温的抽屉里。
• 加完终止液，立即到机器上读数。选择450nm， 测OD值。 说明：不常做ELISA的实验室，请务必在实验之 前，确认吸光度检测仪器在正常使用状态。如果 仪器状态不好，读数不准，ELISA的结果也不可 信。 附图的板子颜色，是我昨天的结果，室温放了一 个晚上之后，今早来看， • 颜色普遍都黄色，虽然还有颜色深浅的区别。 刚做出来的时候，颜色淡的近乎白色，几乎没有 黄色。