实用ELISA教程
ELISA实验步骤一览表
同左
包被抗原：
同左
2
洗涤：移去包被液，凹孔用洗涤缓冲液（含0.05%吐温-20）洗3次，每次5分钟
同左
同左
同左
3
加被检标本：每凹孔加入用含有0.05%吐温-20的稀释缓冲液稀释的被检血清各0.2ml，37℃，作用1～2小时
每凹孔加入0.2ml用稀释缓冲液稀释的含抗原的被检标本，37℃作用1～2小时。
同左
同左
同左
8
加终止剂：每凹孔加2M H2SO4或2M柠檬酸0.05ml。
同左
同左
同左
9
观察记录结果：目测或用酶标比色计测定（O.P.D用492nm）O.D值。
同左
用酶标比色计测定a、b两组O.D值，并求出a、b、O.D值的差数。
同左
分2组,a组加酶标记抗原和被检抗原混合液0.2ml，另一组只加酶标记抗原液0.2ml，37℃作用1～2小时。（混合液可作成不同稀释度）。
a组加参考抗体和被检抗原混合液0.2ml，另一组加参考抗体与等量稀释剂0.2ml，37℃作用1～2小时。
4
洗涤：重复2
同左
洗涤：同左
洗涤
5
加入酶结合物：每凹孔加入稀释缓冲液稀释的酶结合物0.2ml。37℃作用1～2小时
ELISA实验步骤一览表
间接法（测抗体）
双抗体夹心法（测抗原）
竞争法（测抗原）
抑制性测定法
1
包被抗原：用包被缓冲液稀释抗原至最适浓度（5～20μg/ml）各0.3ml加于微反应板每个凹孔中,4℃过夜或37℃水浴2～3小时,贮存冰箱
包被抗体：用包被缓冲液稀释特异性抗体球蛋白至最适浓度（1～10μg /ml），每凹孔加0.3ml，4℃过夜，或37℃水浴3小时，贮存冰箱
ELISA试验方法
ELISA试验方法ELISA试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay），也称酶联免疫吸附试验，是一种常用于检测抗原或抗体的敏感且特异性的实验方法。
ELISA试验既可以用于研究基础科学，也可以应用于诊断医学、生物制药、科研开发等领域。
第一步：固相吸附首先，将特异性抗原或抗体加入固相载体，如微孔板或磁珠，通过吸附作用将其固定在载体上，形成固相。
然后，将未被吸附的地方进行阻断，例如使用牛血清蛋白（BSA）或胸腺素等阻断剂来封闭非特异性结合位点，减少非特异性结合。
第二步：样品加入将待检样品加入固相，并充分与特异性抗原或抗体反应。
如果待检物是抗原，则待检样品中存在的特异性抗体会与固相上的抗原结合。
如果待检物是抗体，则待检样品中存在的抗原会与固相上的抗体结合。
第三步：洗涤通过反复洗涤固相，去除非特异性结合的物质，确保只有特异性结合物留在固相上。
典型的洗涤液包括缓冲盐水或洗涤缓冲液。
第四步：二抗加入将经过酶标记的二抗加入固相，使其与特异性结合的抗原或抗体结合。
酶标记的二抗可以与特异性结合物形成二抗-抗原或二抗-抗体复合物。
第五步：洗涤再次进行洗涤步骤，去除非特异性结合的酶标记的二抗，确保只有特异性结合的复合物留在固相上。
第六步：底物加入将含有底物的反应物加入固相，使其与酶标记的二抗发生反应。
底物与酶标记的二抗之间的反应产生颜色变化，即可定性或定量检测待检物质的存在和浓度。
第七步：反应停止通过加入反应停止剂，停止酶反应，阻止进一步的底物转化为产物。
产物的生成量与待检物质的浓度成正比。
最后，通过光度计或酶标仪等检测设备，测量产生的颜色变化的光密度，可以定性或定量计算待检物质的存在和浓度。
ELISA试验具有高度的敏感性和特异性，能够检测低浓度的抗原或抗体。
它的操作简单、重复性好，广泛应用于生物医学研究、临床检测、植物检测、食品检测等领域。
不过需要注意的是，ELISA试验的结果受到很多因素的影响，如抗体的质量和纯度、试剂的质量和保存条件等，因此在进行ELISA试验时需要严格控制实验条件，保证结果的准确性和可重复性。
酶联免疫吸附试验(ELISA)的程序
酶联免疫吸附试验（ELISA）的程序第一节间接ELISA试验一用可溶性抗原的ELISA：1、纯化抗原：用包被液稀释至1—20ug/ml；2、以50—100ul/孔量加入酶标板孔中；3、置4（度）过夜或37（度）吸附3h；4、PBST洗三次；5、每孔200ulPBS/NCS 4（度）过夜封闭或37（度）封闭3h；6、PBST洗5次，每次1min（包被板可—20（度）或许（度）保存备用）7、每孔加50—100ul第一抗体，同时设阳性、阴性对照。
若杂交瘤筛选，每孔加杂交瘤培养上清；8、37（度）孵育2h9、PBST洗5次，每次5min10、每孔加50—100ul酶标第二抗体；若杂交瘤筛选，每孔加HRP 标记的抗小鼠（IgG+IgM）抗体；11、37（度）孵育2h12、PBST洗5次，每次数5分钟；13、每孔加OPD 或TMBS底物100ul14、37（度）避光作用；（OPD为10—20）分钟，TMBS为40分钟）；15以50ul2MH2SO4终止反应，在酶联免疫阅读仪上读取OD值（OPD 底物选用490nm滤光片，TMBS底物选用450nm滤:光片）；16结果判定：（1）P/N≥2.1 为阳性(2) P≥N+3SD 为阳性成功范例:NDV单抗检测，粘附素单抗检测，H单抗检测亚类鉴定和鸡白痢检疫等。
二、用全菌抗原的ELISA法（一）GA法1、新鲜培养的细菌用蒸馏水悬浮，光密度法或比浊法调整细菌浓度至1X10（6）个/ml。
注意：沙门氏菌等人畜共患病原体，使用前必须灭活或采用市售的灭活诊断菌液；2、酶标板中加200ul/孔，5%戊二醛（GA）溶液（0.1M NaHCO4 95ml+25%DNY戊二醛溶液5ml）;37(度);2小时3、蒸馏水洗5次;4、加细菌悬浮液,50ul/孔;5、37(度)温箱内过液,干燥吸附(20—24h)6、加PBS/NCS 220ul/孔37（度）封闭3小时或4（度）过夜封闭；7、PBST洗5次（—20（度）或4（度））存放备用；8、以下步骤同一。
ELISA操作规程
ELISA操作规程一、引言ELISA（酶联免疫吸附测定）是一种常用的实验方法，用于检测和定量分析特定抗原或者抗体的存在。
本操作规程旨在提供一套标准化的ELISA实验步骤，以确保实验的准确性和可重复性。
二、实验材料1. 96孔ELISA板2. 酶标仪3. 微量移液器和相应的可调移液器架4. 基质溶液（PBS等）5. 抗原或者抗体样品6. 酶标记的二抗7. 洗涤缓冲液8. 底物溶液9. 住手液三、实验步骤1. 准备工作a. 将96孔ELISA板放置在可调移液器架上。
b. 准备基质溶液，并将其加入ELISA板的每一个孔中，每孔100μL。
c. 将ELISA板放置在酶标仪中，孔底朝上，以避免溶液的蒸发。
2. 样品处理a. 将待测样品加入ELISA板的相应孔中，每孔100μL。
b. 将ELISA板盖好，轻轻摇动，使样品均匀分布。
c. 将ELISA板放置在酶标仪中，孔底朝上，孔盖向下。
3. 一抗孵育a. 将酶标记的一抗加入ELISA板的每一个孔中，每孔100μL。
b. 将ELISA板盖好，轻轻摇动，使一抗均匀覆盖样品。
c. 将ELISA板放置在酶标仪中，孔底朝上，孔盖向下。
4. 洗涤步骤a. 将洗涤缓冲液加入ELISA板的每一个孔中，每孔200μL。
b. 轻轻拍打ELISA板，使洗涤液充分覆盖孔底。
c. 倒掉洗涤液，重复以上步骤3次。
5. 二抗孵育a. 将酶标记的二抗加入ELISA板的每一个孔中，每孔100μL。
b. 将ELISA板盖好，轻轻摇动，使二抗均匀覆盖样品。
c. 将ELISA板放置在酶标仪中，孔底朝上，孔盖向下。
6. 洗涤步骤a. 重复步骤4中的洗涤步骤，以去除未结合的二抗。
7. 底物反应a. 将底物溶液加入ELISA板的每一个孔中，每孔100μL。
b. 将ELISA板盖好，轻轻摇动，使底物均匀覆盖样品。
c. 将ELISA板放置在酶标仪中，孔底朝上，孔盖向下。
8. 反应住手a. 在适当的反应时间后，将住手液加入ELISA板的每一个孔中，每孔100μL。
ELISA方法的及步骤
ELISA方法的及步骤
ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay）是一种免疫分析的方法，也叫酶标免疫分析，是在免疫学及其它生物领域中常用的分析技术，通过酶，抗体和抗原等物质的反应来测定其中一种物质的存在量及含量。
1、准备样品
首先将样品放入微孔板中，根据所需的数量准备多个样品，如果样品太浓，可以把它们降解成所需的浓度；如果样品太稀，可以根据需要加以稀释。
2、准备抗体和抗原
分别准备抗体和抗原，其中抗体是用来特异性结合抗原的，并起到抗原的定位、分析的作用，而抗原是根据需要溶解在其中一种介质(Buffer Solution)中，通常是立即使用；如果出于其中一种原因不能立即使用，可以先保存冰上，在使用前加热到室温。
3、准备链式反应物
将抗体和抗原分别加入微孔板中，同时把链式反应物加入微孔板中，链式反应物也叫链式抗体，可以促进抗体和抗原之间的反应，一般抗体和抗原均可与链式反应物发生反应，这样可以提高反应的准确性及灵敏度。
4、酶标偶联反应
将已准备的样品、抗体、抗原和链式反应物放入微孔板中，用摇床摇匀即可进行酶标偶联反应，反应的原理是：抗体和抗原发生特异性结合，当抗体和抗原结合后，其中的链式反应物与抗原结合。
ELISA方法详细过程及步骤
ELISA方法详细过程及步骤ELISA（酶联免疫吸附实验）是一种常用于测定生物样本中特定分子的定量方法。
它结合了免疫化学和酶学原理。
下面是对ELISA方法的详细过程及步骤的完整版说明：1.准备工作：首先，准备实验室材料，包括ELISA板、试剂、标样、洗涤液、试管、酶标板读取器等。
确保所有物品都是干净且无污染的。
2.涂覆抗原或抗体：将要测定的抗原或抗体在ELISA板的孔中涂覆。
可以将抗原或抗体溶液加入每个孔中，然后在37°C的恒温箱中孵育2到4个小时，以便其吸附在板上。
3.孔的封闭：将孔洗涤掉未吸附的物质，并用阻断液封闭孔，以防止非特异性结合。
4.样本和标准品的加入：将待测样本和不同浓度的标准品加入对应的孔中。
将ELISA板返回恒温箱，孵育一段时间，使样本和标准品中的抗原或抗体与固相相结合。
5.洗涤：将洗涤液加入孔中，用洗涤机或手动洗涤涡流器洗涤孔，以去除未结合的物质。
6.加入检测抗体：加入检测抗体，该抗体具有与待测物质结合的亲和性。
将ELISA板返回恒温箱进行孵育，使检测抗体与待测物质结合。
7.洗涤：重复第5步中的洗涤步骤，以去除未结合的检测抗体。
8.加入次级抗体：加入与检测抗体结合的二抗，通常是与酶结合的抗体。
这个二抗具有抗体结合和酶活性。
9.洗涤：重复第5步中的洗涤步骤，以去除未结合的次级抗体。
10.反应底物：加入染色底物，它通常是可以与酶发生反应并产生可见信号的底物。
11.反应停止：通过加入停止液，中止底物的反应并停止信号的产生。
12.读板：使用酶标板读取器，在特定波长下测量每个孔的吸光度。
这个吸光度与待测样本中目标物质的含量成正比。
13.数据分析：根据标准曲线，计算出待测样本中目标物质的浓度。
总结：ELISA方法是一种常用的免疫学定量方法，它可以用于测定生物样本中特定分子的含量。
在ELISA方法中，首先将待测物质（抗原或抗体）固定在ELISA板上，然后加入待测样本和标准品，进行孵育和洗涤的步骤，以去除未结合物质。
实用ELISA教程PPT课件
• 颜色普遍都黄色，虽然还有颜色深浅的区别。
刚做出来的时候，颜色淡的近乎白色，几乎没有 黄色。
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• X,Y轴都取对数之后，可以看见点与点之间成直线。
但是，R2只有0.967，一般比较好的标准曲线， 应该是0.99左右。 • D1与D2的重复性不好（标准品浓度， 125pg/ml），可能是个人操作原因。
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• 第二天早上，来洗掉包被液。 注意事项： 1. ELISA用的所有液体系统，记得一定要预先调PH值到7.2-7.4之间，最好按 照说明书都无菌过滤过。1XPBS的PH值在7.68左右，仍然需要加盐酸调酸一 点。Trizma base配出来，PH在9.98,必须调PH!否则ELISA中抗原抗体根本不 能正常结合。蛋白对于PH值极度敏感。
ELISA有白底（上图，不可拆）和黑空板子 （可拆，8个一排，12排）。用吸光度（一 般是450nm的OD值）来检测，就只能用白 底的板子。黑底的板子可以用Lumin读数。
第一步，拿到板子，还有封盖膜。
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• 第二步：用100ul包被抗体，包被好板子之后，轻弹混匀。将封盖膜 的白色撕去，用透明有粘性的膜，贴在板子上，把膜压紧（贴膜是为 了防止液体挥发，所以一定要把每孔黏牢）。 室温孵育过夜。
• 样品稀释的一般原则
• 用户须估计样品待测因子的含量，决定适当的稀释倍数，以使稀释后样品中 待测因子的浓度处于ELISA 试剂盒的最佳检测范围。根据待测因子含量高、 中、低的不同，分别采取不同的稀释方案：
ELISA操作步骤
ELISA操作步骤酶联免疫吸附试验（ELISA）是一种常用的实验方法，用于检测抗原或抗体的存在和浓度。
双抗体夹心法是ELISA的一种常见方法，也被称为间接ELISA。
该方法通过将待测抗原与特异性抗体结合，然后将该复合物夹在两种抗体之间，从而实现检测目标物的定量。
以下是ELISA操作步骤（双抗体夹心法）：1.准备所需试剂和设备，包括等量酶联免疫吸附试剂，洗涤缓冲液，检测抗体，底物液和浓缩液。
2.预先涂上酶标板：用特异性抗体溶液将酶标板的孔涂覆。
将抗体溶液加入每个孔中，然后在常温下孵育2小时或过夜在4°C下孵育。
孵育结束后，将溶液倒掉，然后用洗涤缓冲液洗涤掉未结合的抗体。
3.加入待测样品：将待测样品加入酶标板中，然后在常温下孵育1小时。
孵育结束后，倒掉孵育液，并用洗涤缓冲液洗涤掉未结合的样品。
4.加入检测抗体：将检测抗体加入酶标板孔中，然后在常温下孵育1小时。
检测抗体可以与目标物中的特异性抗体结合，并形成夹心复合物。
5.加入底物液：将底物液加入每个孔中，然后在室温下孵育20-30分钟。
底物液通常含有染色剂，当底物液与酶产生反应时，颜色会发生变化。
6.停止反应：在孵育结束后，加入停止液停止反应。
停止液会改变底物液的pH值，从而停止酶的反应。
这将保持颜色稳定，并允许结果的定量测量。
7.结果分析：使用酶标仪读取每个孔的吸光值。
这些吸光值可以用于计算样品中目标物的浓度。
通常，在酶标板上设置标准曲线，用于根据吸光值确定目标物的浓度。
8.清洗：在每个步骤之后，用洗涤缓冲液充分清洗酶标板。
洗涤的目的是去除未结合的试剂和非特异性物质，以确保结果的准确性。
9.数据处理和统计分析：根据读数结果计算样品中目标物的浓度，并进行统计分析。
常见的统计方法包括均值、标准差和方差。
以上是双抗体夹心法ELISA的一般操作步骤。
在实际操作中，可能会根据具体要求进行一些调整和优化。
同时，实验室安全操作规范和个性化要求也需要被遵循和注意。
ELISA法检测抗体效价
ELISA间接法检测抗体效价实验原理：ELISA（Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay），酶联免疫吸附实验。
指将可溶性的抗原或抗体吸附到聚苯乙烯等固相载体上，进行免疫反应的定性和定量方法。
ELISA操作过程：（一）抗原包被（蛋白包被浓度一般是0.5 ug-10 ug）①准备ELISA酶标板，根据检测的量包被抗原。
②用包被液（NaHCO3-Na2CO3溶液）梯度稀释抗原，包被100 ul/孔，设置双复孔。
③用保鲜膜密封酶标板，盖上盖，放在装有湿棉花的饭盒中，4℃过夜（16h-24h）。
（二）洗涤①取出酶标板，弃掉保鲜膜，甩掉其中液体，吸水纸上拍干。
②加入洗涤液，300 ul/孔，震荡，室温放置3 min。
甩掉其中液体，吸水纸上拍干。
③共洗涤3次。
④用纯水再洗两次。
（三）封闭①用PBS配制好5%的FBS溶液（封闭液，现用现配）。
②洗涤后加入封闭液300 ul/孔。
③保鲜膜密封酶标板，装饭盒中，37 ℃培养箱2h。
④封闭之后无需洗涤。
（四）一抗孵育①封闭快好前的30分钟准备好一抗（单克隆抗体），用封闭液稀释，稀释梯度1：1000，1：3000，1：9000，1：27000。
同时设置空白组（空白封闭液），阴性对照组（未免疫细胞上清），阳性对照组（多抗）。
②加入一抗100 ul/孔。
③孵育：37℃，1h。
（五）洗涤（六）二抗孵育①用封闭液稀释二抗，二抗稀释度是1：3000。
②洗涤后，加入二抗，100 ul/孔。
③孵育：37℃，45 min。
（七）洗涤（洗涤五次，再用纯水洗涤两次）（八）底物显色①配制底物液（一块板用量，96孔，10 ml）：1×甲液4.86 ml +1×乙液5.14 ml + 4 mgOPD（3-4粒），迅速混匀。
待充分溶解后加入30% H2O2 50ul 即可。
注：OPD（邻苯二胺）有致癌性，操作时应戴手套。
底物液需现用现配，H2O2最后加，不然过一会儿就变黄了。
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• 8.弃掉检测抗体液，拍干。 洗涤三遍。 9. 加Streptavidin-HRP(亲和素-辣根过氧化物酶)，这个一直4度 保存，使用的时候200倍稀释（96孔，9.6ML液体，加48ul的 Streptavidin-HRP，9552ul的缓冲液）。 100ul每孔，室温，避光（这步开始要避光），孵育20分钟。
•
第二天早上，来洗掉包被液。 注意事项： 1. ELISA用的所有液体系统，记得一定要预先调PH值到7.2-7.4之间，最好按 照说明书都无菌过滤过。1XPBS的PH值在7.68左右，仍然需要加盐酸调酸一 点。Trizma base配出来，PH在9.98,必须调PH!否则ELISA中抗原抗体根本不 能正常结合。蛋白对于PH值极度敏感。 2. 无菌要求多高，现在不知道。建议无菌配好的液体放在4度冰箱保存。每次 用之前，放在室温下至少15分钟。ELISA用的液体，室温的温度，效果比较 好。 洗包被液的时候，直接把板子翻过来，弃掉液体。在厚厚的吸水纸上，用力 拍打板子，力求把孔中的液体完全弃干净。 用WASH BUFFER洗涤三次。因为孔的最大容量是400UL,但是300UL基本就 可以把孔覆盖满。所以，建议洗板子的时候，每孔加350ul左右。 注意事项： 1.每次洗涤的时候，尽量拍干孔中液体。这样洗涤得比较干净。 2. 孔中没有液体时候，动作一定要快！！！ELISA包被后的孔，绝对不能干 掉！否则非常影响结果。
•
取16孔标准品的量。举例，我的标准品储存浓度是270ng/ml, 标准品分7个点，最高浓度是 1000pg/ml，每孔100ul, 2倍递减，所以是1000， 500， 250， 125， 62.5 ， 31.2， 15.6 pg/ml, 7个孔我需要0.2ng标准品。 做ELISA必须有复孔。所以，两排14个孔我需要0.4ng标准品, 1.5ul。 标准品稀释步骤： 取7个EP管，第1管放400ul缓冲液，第2到7管放200ul缓冲液。将1.5ul标准品加入到第一管中， 200ul枪轻轻吹打混匀。从第1管中取200ul加入第2管中，吹打均匀。依次稀释。第7管有400ul液 体，最后只用200ul。 标准品加样步骤： 从第1管中取100ul加到A1孔，再100ul加到A2复孔中。 第2到7孔，参考上述步骤。 第8孔，H1和H2加没有标准品的缓冲液，作为阴性对照。 样本加样： 血清或者细胞上清，解冻之后混匀，建议3000RPM离心10分钟，沉淀液体中的固体杂质。
ELISA操作步骤（双抗体夹心法）
ELISA操作步骤（双抗体夹心法）ELISA操作步骤（双抗体夹心法）1. 包被过程(注意设置空白对照,阴性对照):将所用抗原用包被稀释液稀释到适当浓度，每孔抗原加入100μl, 置37℃,4h,或4℃,24h;弃去孔中液体，(为避免蒸发,板上应加盖或将板平放在底部有湿纱布的金属湿盒中)。
2 PBS洗3次，每次3分钟。
具体为.吸干或甩干孔内反应液；.用洗涤液过洗一遍（将洗涤液注满板孔后，即甩去）；浸泡，即将洗涤液注满板孔，放置1-2分钟，间歇摇动，浸泡时间不可随意缩短；吸干孔内液体，可甩去液体后在清洁毛巾或吸水纸上拍干；.重复操作涤3次。
3. 加入待检测样品(建立合适的浓度梯度):检测时一般采用1:50-1:400的稀释度, 应采用较大稀释体积进行,一般保证样品吸取量>20μl。
将稀释好的样品加入酶标反应孔中，每样品至少加双孔，每孔100μl，置于37℃,40-60min。
4 PBS洗3次，每次3分钟。
5. 加入酶标抗体:酶标抗体: 根据酶结合物提供商提供的参考稀释度进行或建立浓度梯度，37℃,30-60min之间，短于30min往往结果不稳定，每孔加100μl。
6 PBS洗3次，每次3分钟。
7. 加入底物液(现用现配):TMB(四甲基联苯胺)使用液:TMB(10mg／5ml无水乙醇) 0.5ml底物缓冲液(PH5.5) 10ml0.75％H2O2 32μl，底物加入量每孔100μl （TMB空白显色孔除外）,置37℃避光放置20-25分钟。
8. 终止反应:每孔加入终止液50μl(2M H2SO4)终止反应, 此时蓝色立转黄色，于20min内测定实验结果。
9 结果判断:可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅。
也可测吸光值：在ELISA检测仪上，TMB反应产物检测需要450nm波长，检测时一定要首先进行空白孔系统调零。
用测定标本孔的吸收值与一组阴性标本测定孔平均值的比值(P/N)表示，当P/N大于2时作为抗体的效价即大于阴性对照吸光值的2倍，(数值的大小依具体检测要求而定)。
ELISA试验方法
ELISA试验方法ELISA是一种免疫学实验方法，用于检测和定量分析生物样本中的特定蛋白质或抗原。
它的全称是“酶联免疫吸附实验”（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay），是酶联免疫技术的一种应用。
ELISA试验方法基于抗原与抗体间的特异性结合原理。
首先，需要在固相载体上固定抗原，将其与待测样本中的特定蛋白质相结合。
然后，在固定的抗原上加入与待测样本中特定蛋白质结合的抗体，使其与抗原结合。
随后，通过加入酶标记的二抗来结合与待测样本中特定蛋白质结合的抗体，并通过显色反应来检测和量化结合事件。
下面是ELISA试验方法的详细步骤：1.板涂覆：将含有特定抗原的溶液加入固相载体（如微孔板）中，使抗原吸附在载体表面。
2.板洗涤：将未结合的抗原洗去，保留结合在载体上的抗原。
3.阻断：加入适当的阻断剂（如牛血清蛋白），阻止非特异性结合。
4.样品加入：将待测样本加入载体孔中，使样本中的特定蛋白质与载体上的抗原结合。
5.洗涤：将未结合的样品洗去，保留与载体上抗原结合的特定蛋白质。
6.加入一抗：加入与待测样本中的特定蛋白质结合的一抗体，使其与特定蛋白质结合。
7.洗涤：将未结合的一抗洗去，保留与载体上抗原结合的一抗体。
8.加入二抗：加入与一抗体结合的酶标记二抗体，使其与一抗体结合。
9.洗涤：将未结合的二抗洗去，保留与载体上抗原结合的酶标记二抗体。
10.底物加入：加入酶促反应底物（如TMB）使其发生显色反应，生成可见色素。
11.反应停止：加入停止剂（如硫酸）停止显色反应。
12.光密度测量：使用光密度仪测量载体中的各孔的吸光度（OD值），即可检测和定量特定蛋白质的含量。
1. 高灵敏度：ELISA能够检测到低浓度的特定抗原或抗体，一般可达到ng/mL的级别。
2.特异性强：ELISA方法利用抗原与抗体的特异性结合，因此可以高度特异性地识别并定量特定蛋白质。
3.可重复性好：ELISA方法的结果具有较好的重复性，可以进行定量和对比分析。
ELISA步骤、试剂及注意事项
ELISA步骤、试剂及注意事项操作步骤方法一用于检测未知抗原的双抗体夹心法：1.包被：用0.05M PH9。
牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg／ml。
在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0。
1ml,4℃过夜。
次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次,每次3分钟。
（简称洗涤，下同)。
2.加样:加一定稀释的待检样品0。
1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。
然后洗涤.（同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔）。
3。
加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体（经滴定后的稀释度)0。
1ml。
37℃孵育0.5～1小时，洗涤。
4.加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0。
1ml,37℃10～30分钟。
5.终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。
6.结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深,阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。
也可测O·D值：在ELISA检测仪上，于450nm （若以ABTS显色，则410nm）处，以空白对照孔调零后测各孔O·D值，若大于规定的阴性对照OD值的2。
1倍，即为阳性.方法二用于检测未知抗体的间接法:用包被缓冲液将已知抗原稀释至1～10μg／ml，每孔加0。
1ml，4℃过夜.次日洗涤3次。
加一定稀释的待检样品(未知抗体)0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时，洗涤。
(同时做空白、阴性及阳性孔对照)于反应孔中，加入新鲜稀释的酶标第二抗体(抗抗体）0。
1ml,37℃孵育30—60分钟，洗涤,最后一遍用DDW洗涤。
其余步骤同“双抗体夹心法”的4、5、6。
试剂器材1.试剂（1）包被缓冲液（PH9。
6 0。
05M碳酸盐缓冲液)：NaCO3？1.59克NaHCO32。
93克加蒸馏水至1000ml（2）洗涤缓冲液(PH7。
4 PBS）:0.15M KH2PO4 0.2克Na2HPO4·12H2O 2.9克NaCl 8。
elisa操作步骤及注意事项
elisa操作步骤及注意事项以elisa操作步骤及注意事项为题，本文将为大家介绍elisa（酶联免疫吸附测定法）的操作步骤和注意事项。
一、操作步骤1. 准备工作在进行elisa实验前，需要准备好实验所需的试剂和仪器设备，包括酶标板、试剂盒、洗涤缓冲液、底物溶液、阻断缓冲液等。
同时，需要对实验室台面和仪器进行消毒，并佩戴好实验手套和口罩，以确保实验的准确性和安全性。
2. 样品处理将待测样品（如血清、尿液、细胞培养上清液等）和对照样品放置在室温下静置，使其达到室温后，进行稀释处理。
通常情况下，待测样品需要按照一定比例进行稀释，以确保其浓度处于检测范围之内。
3. 酶标板涂覆将酶标板中的亲和素或抗体溶液加入到孔板中，然后将其在4℃下静置过夜，使亲和素或抗体能够均匀地吸附在酶标板上。
4. 标准曲线制备将标准品按照一定比例稀释，以制备出一系列浓度递增的标准品溶液。
然后将这些标准品溶液依次加入已涂覆的酶标板孔中，孔位之间要保持一定的距离。
5. 样品孔加样将样品溶液加入到酶标板的样品孔中，注意每个孔的加样量要保持一致。
为了保证实验的准确性，通常会设置阳性对照孔和阴性对照孔，以验证实验的可靠性。
6. 孔板洗涤使用洗涤缓冲液对酶标板进行洗涤，去除未结合的物质和杂质。
洗涤时要注意洗涤液的温度和洗涤次数，以确保洗涤的充分彻底。
7. 酶标记物加入将酶标记的二抗或酶标记的亲和素加入到酶标板的孔中，使其与靶分子结合。
然后，将酶标板置于恒温摇床上，进行孵育反应，使酶标记物与靶分子发生特异性结合。
8. 反应终止通过加入反应终止溶液，使酶标记物的酶活性停止，并终止酶标记物与靶分子的结合。
终止溶液的选择要根据实验所使用的底物和酶标记物来确定。
9. 读板测定使用酶标仪或多功能酶标仪对酶标板进行测量，测定底物的反应产物的吸光度。
根据吸光度值，可以计算出样品中靶分子的浓度。
二、注意事项1. 严格控制实验条件在进行elisa实验时，需要严格控制实验条件，包括温度、湿度、时间等。
ELISA操作流程
ELISA操作流程ELISA（受体结合酶联免疫吸附检测）是一种常用的生物化学实验技术，用于检测生物样品中特定抗原或抗体的存在。
该技术主要基于抗原-抗体特异性结合的原理，结合酶的反应可使目标分子在颜色、荧光或发光等性质上发生变化，从而实现定量或半定量的检测。
下面是ELISA的操作流程：1.涂布酶标板：将特异性或捕获性抗体溶液加入酶标板孔中，并在孔底表面吸附，形成抗体层，常用的方法为静置法或旋涂法。
吸附抗体的选择要考虑其特异性、纯度和稳定性。
2.阻断：在涂布之后，使用适当的阻断缓冲液封闭剩余的吸附位点，以避免非特异性结合。
3.样品孔：在吸附抗体的孔中加入待测样本，如血清、尿液或细胞培养上清。
一般来说，样品应该先经过稀释，以便在酶标板上形成可测的信号。
为了获得准确的结果，通常要进行样品的多倍稀释。
4.洗涤：通过将酶标板孔填满洗涤缓冲液，轻轻摇晃或用洗板机进行洗板，以洗去未固定的样品和其他成分。
洗涤过程至少重复3次，以确保非特异性结合物质的彻底去除。
5.次级抗体：将标记有酶的次级抗体加入孔中，使其与样品中的目标抗原或抗体结合。
次级抗体可以是针对特定物种IgG的抗血清，或是针对相对特异性的抗体，如蛋白A/G。
6.洗涤：再次进行洗涤步骤，以去除未结合的次级抗体。
7. 底物加入：向每个孔中加入染色底物，如TMB （tetramethylbenzidine），底物与酶反应后会在颜色上发生可见变化。
对于荧光ELISA或发光ELISA，将相应的底物加入。
8.反应停止：添加停止剂，如硫酸或酸，以停止酶的反应。
底物反应停止后，颜色会停在一定的反应时间点处。
9. 读取结果：通过光谱分析，使用酶标仪测定吸光度或荧光/发光的强度，以检测抗原或抗体的存在。
吸光度（Absorbance）与目标物质的浓度成正比。
10.数据分析：计算各标准品的吸光度值和待测样品的吸光度值，根据标准曲线或内部对照，计算出待测样品中目标物质的浓度。
总结：ELISA技术广泛用于生物医学研究和临床诊断，其操作流程简洁明了，通常需要进行涂布、阻断、样品孔、洗涤、次级抗体、底物加入、反应停止和结果读取等步骤。
ELISA原理及步骤
ELISA原理及步骤ELISA（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，酶联免疫吸附法）是一种广泛应用于生物医学研究和临床诊断的分析技术。
它基于免疫学原理，通过检测特定抗原和抗体的结合来定量测定目标物。
1.直接ELISA的原理及步骤：直接ELISA方法适用于已知抗体，且目标物的抗原性较好的情况。
该方法将特异性的抗原通过硫酸盐或其他方法固定于微孔板上，然后用荧光素标记的抗体与其结合，最后通过测量荧光素的荧光强度来进行定量测定。
步骤：1）将抗原分散涂布在微孔板上，然后孵育，使其与货物绑定。
2）将非特异性结合位点封闭，以防止非特异性结合。
3）加入荧光素标记的抗体，与抗原特异性结合。
4）洗涤净化微孔板以除去未结合的荧光素标记的抗体。
5）加入底物，并进行发光强度测定。
6）测量荧光素的荧光强度，利用标准曲线计算样品中目标物的浓度。
2.间接ELISA的原理及步骤：间接ELISA方法适用于已知抗原，但目标物的抗原性较差的情况。
该方法在抗原固定之后，加入绕行适体素标记的次级抗体，通过该次级抗体与目标物特异性结合，最后通过测量标记抗体的发光强度来进行定量测定。
步骤：1）将抗原分散涂布在微孔板上，然后孵育，使其与货物绑定。
2）将非特异性结合位点封闭，以防止非特异性结合。
3）加入特异性的初级抗体与目标物结合。
4）洗涤净化微孔板以除去未结合的初级抗体。
5）加入绕行适体素标记的次级抗体，使其与初级抗体结合。
6）洗涤净化微孔板以除去未结合的次级抗体。
7）加入底物，并进行发光强度测定。
8）测量标记抗体的发光强度，利用标准曲线计算样品中目标物的浓度。
3.竞争ELISA的原理及步骤：竞争ELISA方法适用于已知抗体和已知抗体与抗原的结合关系的情况。
该方法将标记抗原与固定抗原共同加入到微孔板中，通过测量标记抗原与抗体的竞争情况来进行定量测定。
步骤：1）将抗原分散涂布在微孔板上，然后孵育，使其与货物绑定。
2）将标记抗原共同加入到微孔板中。
ELISA操作流程
ELISA 操作流程1 。
包被：用包被液将抗体稀释至蛋白质含量为0.5~20 μg／ml,按100ul/孔加入酶标板，4℃包被过夜。
2. 洗板：次日弃去孔内液体，在纸巾上轻轻扣打以吸去残留液体，加入洗涤液(约280—300ul/孔)，漂洗2-3 次，每次3—5min;3. 封闭：按200-250ul/孔加入封闭液，室温2-3 小时或37℃1—2 小时,也可4℃封闭过夜，然后弃去孔内封闭液；4 。
样品处理：用洗涤液或样品稀释液将待检样品(含未知抗原)稀释至所需浓度；5. 标准液：用洗涤液或样品稀释液将标准液稀释至所需浓度(定性分析可省略本步骤)；6 。
加样:按排列顺序依次加入50—100ul/孔稀释好的标准液、处理过的待检样品、阴性对照及阳性对照，室温或37℃孵育30-60min；7 。
洗板：同步骤2；8. 加酶标抗体:酶标抗体的稀释按产品说明书，按50—100ul/孔加入新鲜配制的酶标抗体，室温或37℃孵育1 小时；9. 洗板：同步骤2;10. 加底物液显色：按100—150ul/孔加入新配制的TMB 底物溶液，室温避光反应15~ 30 分钟。
11. 终止反应：于各反应孔中加入50ul 的终止液。
12 。
结果判定：可于白色背景上，直接用裸眼观察结果，反应孔内颜色越深，阳性程度越强, 阴性反应为无色或极浅,依据所呈颜色的深浅，以“+”、“- ”号表示.也可在酶标仪上于450nm (若以ABTS 显色，则410nm) 处测OD 值。
检测时以空白对照孔调零后测各孔OD 值，若样品孔中的OD 值大于阴性对照孔的2 。
1 倍, 即为阳性。
1 。
包被：用包被缓冲液将已知抗原稀释至0。
5~20μg／ml,按100ul/孔加入酶标板，4℃包被过夜，次日洗涤2—3 次;2 。
洗板：次日弃去孔内液体，在纸巾上轻轻扣打以吸去残留液体，加入洗涤液(约280-300ul/孔)，漂洗2—3 次，每次3—5min;3 。
封闭：按200-250ul/孔加入封闭液，室温2-3 小时或37℃1-2 小时,也可4℃封闭过夜，然后弃去孔内封闭液；4. 样品处理：用洗涤液或样品稀释液将待检样品稀释致所需浓度；5. 标准液：用洗涤液或样品稀释液将标准液稀释至所需浓度(定性分析可省略本步骤)；6 。
elisa操作方法
elisa操作方法Elisa操作方法一、概述Elisa是一种常用的酶联免疫吸附实验技术，被广泛应用于生物医学研究和临床诊断中。
本文将介绍Elisa的操作方法，包括试剂准备、样品处理、板涂覆、孵育、洗涤、检测等步骤。
二、试剂准备1. 根据实验设计，准备所需的试剂，包括酶标板、抗原或抗体、底物、洗涤缓冲液、稀释缓冲液等。
2. 检查试剂是否过期，确保其质量可靠。
三、样品处理1. 收集样品，并根据实验需要进行适当的处理，如离心、稀释等。
2. 保持样品的稳定性，避免冻融和长时间暴露在室温下。
四、板涂覆1. 将酶标板中的孔加入适量的抗原或抗体，尽量均匀涂覆。
2. 使用封闭剂封闭孔，避免非特异性结合。
五、孵育1. 将板密封，置于恒温箱中进行孵育，确保温度和湿度的稳定。
2. 孵育时间根据实验需求进行设定，一般为1-2小时。
六、洗涤1. 将洗涤缓冲液加入酶标板孔中，轻轻摇晃或使用洗涤器进行洗涤，去除非特异性结合物质。
2. 反复洗涤3-5次，每次洗涤时间约1-2分钟。
七、检测1. 加入标记有酶的抗体或底物，与特异性结合物发生反应。
2. 反应结束后，加入停止液终止反应，阻止进一步的底物转化。
3. 使用酶标仪测量吸光度，获取实验结果。
八、数据分析1. 根据实验目的和样品特点，选择适当的统计方法和数据处理软件进行数据分析。
2. 统计分析实验结果，得出结论，并将结果进行图表展示。
九、结果解读1. 根据实验目的和已有知识，对实验结果进行解读和讨论。
2. 分析可能存在的误差和限制，并提出改进意见。
十、实验注意事项1. 严格遵守实验室操作规范，保证实验的准确性和可靠性。
2. 避免交叉污染，使用干净的实验器具和试剂。
3. 注意试剂的保存条件和有效期。
4. 控制实验条件的一致性，确保实验结果的可比性。
十一、结论Elisa操作方法是一种重要的生物分析技术，通过合理的实验设计和操作流程，可以获得准确可靠的实验结果。
熟练掌握Elisa的操作方法，对于生物医学研究和临床诊断具有重要意义。
elisa实验操作步骤
elisa实验操作步骤
ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。
结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。
在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。
操作步骤:
1．从已平衡至室温的密封袋中取出试验所需板条，未用的板条和干燥剂请放回铝箔袋内压实自封条，密封口袋，放回4℃。
2．空白孔加标准品和标本稀释液，其余相应孔中加标本或不同浓度标准品(100ul/孔)，用封板胶纸封住反应孔，36℃孵箱孵育90分钟。
3．提前20分钟准备生物素化抗体工作液。
4．洗板5次。
5．空白孔加生物素化抗体稀释液，其余孔加入生物素化抗体工作液(100ul/孔)。
用新封板胶纸封住反应孔，36℃孵箱孵育60分钟。
6．提前20分钟准备酶结合物工作液。
避光室温(22-25 ) ℃放置。
7．洗板5次。
8．空白孔加酶结合物稀释液，其余孔加入酶结合物工作液(100ul/孔)。
用新封板胶纸封住反应孔，36℃孵箱，避光孵育30分钟。
9．打开酶标仪电源，预热仪器，设置好检测程序。
10．洗板5次。
11．加入显色底物(TMB)100ul/孔，避光36℃孵箱，避光孵育15分钟。
12．加入终止液100ul/孔, 混匀后即刻测量OD450值(3分钟内)。
在仪器保存读数结果并打印一份纸质结果。
13．实验完毕后将未用完的试剂按规定的保存温度放回电冰箱保存至有效期结束。
ELISA操作方案
ELISA操作方案ELISA（酶联免疫吸附试验），是一种用来检测抗原或抗体在生物样本中的定量或半定量分析方法。
它是一种快速、准确、经济的实验技术，广泛应用于医学诊断、病毒学和免疫学研究中。
以下是进行ELISA实验的操作方案。
材料准备：1.酶标板：96孔的微孔板。
2.抗原和抗体：包括待检测抗原和抗体，以及阳性和阴性对照抗体。
3.缓冲液：ELISA实验需要的缓冲液，如PBS、TBS等。
4.酶标记抗体：如辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗体。
5.补体或底物溶液：根据实验需要准备。
操作步骤：1.酶标板涂覆：将待检测抗原溶液加入酶标板的孔中，一般每孔加入100-200μl，密封板子，放置在4℃的冰箱中过夜或较长时间，以便抗原充分吸附在酶标板表面。
2.孔洗涤：将涂覆了抗原的酶标板倒置，用洗涤缓冲液轻轻洗涤每个孔，洗涤3-4次，以去除未结合的抗原。
3.孔封闭：将酶标板孔加入蛋白封闭剂，封闭非特异性位点，减少非特异性结合。
4.给孔的抗原加入特异性抗体：将稀释好的抗体加入孔中，孔中的抗原和抗体进行特异性结合。
孔中每次加入100-200μl，孔盖密封，室温孵育1-2小时。
5.孔洗涤：与步骤2一致，洗涤3-4次。
6.添加酶标记抗体：将标记有辣根过氧化物酶（HRP）的抗体加入每个孔中，与特异性抗体结合，形成抗原-抗体-HRP复合物。
孔中每次加入100-200μl，孔盖密封，室温孵育1-2小时。
7.孔洗涤：与步骤2一致，洗涤3-4次。
8.酶底物添加：将POS底物溶液加入每个孔中，与酶标记抗体结合的HRP催化产生显色反应，形成可见的颜色。
9.停止反应：将酶底物反应停止剂加入每个孔中，停止HRP的催化反应，防止进一步的颜色生成。
10.检测与数据分析：使用酶标仪测量每个孔中的吸光度或荧光强度，并根据标准曲线将数据进行定量或半定量分析。
注意事项：1.实验前准备材料、试剂和设备，确保其干净、无污染。
2.保持操作环境的清洁，避免异物和污染的干扰。
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பைடு நூலகம்
按照顺序，每孔加100ul样本，记得做复孔。加样体积一定要一样，但是动作要快。样本还是一 定要保证加到管底，不要粘附到管壁上。 标准品和样品，每孔100ul，室温孵育2小时。
• 6. 弃掉液体，拍干。洗涤3遍。
• 7. 加检测抗体（detection antibody,尾端有生物素biotin）， 每孔100ul（储存液也是放-80度，用之前解冻后加缓冲液 混匀，稀释到工作浓度，缓冲液的PH值都已经调到7.27.4之间）。 室温孵育2小时。 备注：以上这些步骤没有要求避光。所以，每次加样之后， 只要保证把贴膜都贴牢，防止液体蒸发和孔间干扰即可。 板子可以放在操作台上。 不过因为操作习惯，即使不避光的步骤，也可以把板子放 在室温的抽屉里。
• 3.封闭。 用是1%BSA in 1XPBS. 无菌过滤，4度保 存，用之前放在室温复温。 封闭液最好可以封闭全孔，所以每孔加 300UL封闭液，室温1小时。
4. 弃掉封闭液，拍干 。 洗涤三遍。步骤如前。
•
5. 加标准品和样品。 标准品储存浓度很高，而且蛋白很忌反复冻融。建议第一次使用时，分装。可以48孔一只，-80 度冰箱保存，可以有效保存半年。4度保存，有效期是60天，而且浓度会衰减。
10. 弃掉液体，拍干。洗涤三遍。
11. 加底物液（substrate solution）,A液：B液=1:1，用之前临时 混起来。储存的时候A，B两液分别储存在4度冰箱。 每孔100ul（等于每孔A液50ul，B液50ul），室温，避光，20分 钟。
• 说明： 1. 加AB液之后，白色的孔就会显色。淡绿色，颜色深浅跟目 标蛋白浓度正相关。 2. 生物素与亲和素结合，可以放大免疫反应的效应，便于显色。 3.ELISA包被的板子采用平底（flat），大概60个96孔板，260 美元左右。 白色的板子虽然不能拆卸，但是不用的孔，只要别污染，下次 可以用，所以一块板子等同于可以拆开来用。 12. 保留AB液在孔内，直接每孔加50ul的终止液（2N H2SO4）。终止液也是公司买的专门ELISA用的。 加完终止液，轻弹板子，混匀。可以看见淡绿色变为亮黄色。 黄色的颜色深浅，与绿色一致，与目标蛋白的浓度成正相关。
• 样品稀释的一般原则
• • • • • • 用户须估计样品待测因子的含量，决定适当的稀释倍数，以使稀释后样品中 待测因子的浓度处于ELISA 试剂盒的最佳检测范围。根据待测因子含量高、 中、低的不同，分别采取不同的稀释方案： 高——指待测因子在40-400ng/ml。一般按1：100 稀释。297μι样品稀释液加 3μι样品。 中——指待测因子在4-40ng/ml。一般按1：10 稀释。225μι样品稀释液加 25μι样品。 低——指待测因子在62.5→4000pg/ml。按1：2 稀释。100μι样品稀释液加 100μι样品。 特低——指待测因子≤62.5pg/ml。样品一般不做稀释，或按1：2稀释。 样品的稀释应有详细记录。
Elisa 实用操作手册
• 给师弟科普ELISA基本步骤。与其写个文档， 不如直接写帖子，反正工作量一样。我自 己做ELISA也只是初学者，所以说得不对的 地方，请大家多多指正。
ELISA有白底（上图，不可拆）和黑空板子 （可拆，8个一排，12排）。用吸光度（一 般是450nm的OD值）来检测，就只能用白 底的板子。黑底的板子可以用Lumin读数。 第一步，拿到板子，还有封盖膜。
•
第二天早上，来洗掉包被液。 注意事项： 1. ELISA用的所有液体系统，记得一定要预先调PH值到7.2-7.4之间，最好按 照说明书都无菌过滤过。1XPBS的PH值在7.68左右，仍然需要加盐酸调酸一 点。Trizma base配出来，PH在9.98,必须调PH!否则ELISA中抗原抗体根本不 能正常结合。蛋白对于PH值极度敏感。 2. 无菌要求多高，现在不知道。建议无菌配好的液体放在4度冰箱保存。每次 用之前，放在室温下至少15分钟。ELISA用的液体，室温的温度，效果比较 好。 洗包被液的时候，直接把板子翻过来，弃掉液体。在厚厚的吸水纸上，用力 拍打板子，力求把孔中的液体完全弃干净。 用WASH BUFFER洗涤三次。因为孔的最大容量是400UL,但是300UL基本就 可以把孔覆盖满。所以，建议洗板子的时候，每孔加350ul左右。 注意事项： 1.每次洗涤的时候，尽量拍干孔中液体。这样洗涤得比较干净。 2. 孔中没有液体时候，动作一定要快！！！ELISA包被后的孔，绝对不能干 掉！否则非常影响结果。
• 8.弃掉检测抗体液，拍干。 洗涤三遍。 9. 加Streptavidin-HRP(亲和素-辣根过氧化物酶)，这个一直4度 保存，使用的时候200倍稀释（96孔，9.6ML液体，加48ul的 Streptavidin-HRP，9552ul的缓冲液）。 100ul每孔，室温，避光（这步开始要避光），孵育20分钟。
• X,Y轴都取对数之后，可以看见点与点之间成直线。
但是，R2只有0.967，一般比较好的标准曲线， 应该是0.99左右。 • D1与D2的重复性不好（标准品浓度， 125pg/ml），可能是个人操作原因。 根据标准品得到的公式，就可以根据OD值来计算 各个样本检测浓度。
• 关于ELISA标本收集： 1. 血清：室温血液自然凝固 10-20 分钟后，离心 20 分钟 左右（ 2000-3000 转 / 分）。收集上清。如有沉淀形成， 应再次离心。 2. 血浆：应根据试剂盒的要求选择 EDTA 、柠檬酸钠或 肝素作为抗凝剂，加入 10 ％（ v/v ）抗凝剂 ( 0.1M 柠檬 酸钠或 1% heparin 或 2.0%EDTA.Na2) 混合 10-20 分钟 后，离心 20 分钟左右（ 2000-3000 转 / 分）。仔细收集 上清。如有沉淀形成，应再次离心。 3. 尿液：用无菌管收集。离心 20 分钟左右（ 2000-3000 转 / 分）。仔细收集上清。如有沉淀形成，应再次离心。 4. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。 离心 20 分钟左右（ 2000-3000 转 / 分）。仔细收集上清。 保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
• 第二步：用100ul包被抗体，包被好板子之后，轻弹混匀。将封盖膜 的白色撕去，用透明有粘性的膜，贴在板子上，把膜压紧（贴膜是为 了防止液体挥发，所以一定要把每孔黏牢）。 室温孵育过夜。
注意事项： 1.如果一次只做一部分孔，贴膜可以剪刀剪开，只用一部分。保证膜 可以把加液后的孔盖住就可以。 2.加样时候，一定要保证每孔加样量完全一样。避免因为操作原因， 每孔液体量有区别。ELISA比较敏感，操作误差会导致最后读数有不 小的差别。 3.加的样，保证样品加在孔底，不要粘在管壁上，减少孔与孔之间的 差异。
• 加完终止液，立即到机器上读数。选择450nm， 测OD值。 说明：不常做ELISA的实验室，请务必在实验之 前，确认吸光度检测仪器在正常使用状态。如果 仪器状态不好，读数不准，ELISA的结果也不可 信。 附图的板子颜色，是我昨天的结果，室温放了一 个晚上之后，今早来看， • 颜色普遍都黄色，虽然还有颜色深浅的区别。 刚做出来的时候，颜色淡的近乎白色，几乎没有 黄色。
•
取16孔标准品的量。举例，我的标准品储存浓度是270ng/ml, 标准品分7个点，最高浓度是 1000pg/ml，每孔100ul, 2倍递减，所以是1000， 500， 250， 125， 62.5 ， 31.2， 15.6 pg/ml, 7个孔我需要0.2ng标准品。 做ELISA必须有复孔。所以，两排14个孔我需要0.4ng标准品, 1.5ul。 标准品稀释步骤： 取7个EP管，第1管放400ul缓冲液，第2到7管放200ul缓冲液。将1.5ul标准品加入到第一管中， 200ul枪轻轻吹打混匀。从第1管中取200ul加入第2管中，吹打均匀。依次稀释。第7管有400ul液 体，最后只用200ul。 标准品加样步骤： 从第1管中取100ul加到A1孔，再100ul加到A2复孔中。 第2到7孔，参考上述步骤。 第8孔，H1和H2加没有标准品的缓冲液，作为阴性对照。 样本加样： 血清或者细胞上清，解冻之后混匀，建议3000RPM离心10分钟，沉淀液体中的固体杂质。