标准储备菌株纯度确认标准操作规程
菌种的确认标准操作规程
1．目的建立菌种确认标准操作规程，以减少菌种污染和生长特性的改变，保证实验结果的可靠性和准确性。
2．依据《中国药典》2010版二部3．范围本规程适用于质量控制实验室所用标准储备菌株。
4．责任质量管理部，质量控制实验室5．内容5.1试验菌株大肠埃希菌（Escherichia coli）[CMCC(B)44 102]金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC(B)26 003]枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）[CMCC(B)63 501]白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC(F)98 001]黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC(F)98003]5.1.1标准菌株5.1.1.1标准菌株应来自认可的国内或国外菌种收藏机构。
5.1.1.2标准菌株经过复活并在适宜的培养基中生长后，即为标准储备菌株。
5.1.1.3标准储备菌株应进行纯度和特性确认。
5.1.2工作菌株5.1.2.1标准储备菌株可用于制备每月或每周一次转种的工作菌株5.1.2.2工作菌株的传代次数应严格控制，不得超过5 代（从菌种收藏机构获得的标准菌株为第0代），以防止过度的传代增加表型变化的风险。
因此必要时，应对工作菌株的纯度和特性进行确认。
5.2菌种确认试验的主要内容5.2.1菌种的纯度确认5.2.1.1纯度检测：是指通过适当的方法检测菌种是否为纯培养物。
5.2.1.2试验内容①菌落形态：在特定的培养基上，将待检测培养物稀释涂布或平板划线，适宜培养后，同一平板上的单菌落的大小、形状、颜色、质地、光泽等是否相似；对于两种或以上形态的出发菌株，应再分别挑取单菌落划线或稀释涂布培养，检测是否重复出现相同特征。
②镜检特征：对数生长期的培养物革兰氏染色反应应呈现一致性；细胞形状、大小、荚膜、芽孢等特征应相似。
5.2.2菌种的特性确认5.2.2.1生化试验：各种微生物具有各自的独特的酶系统，因而在代谢过程中所参与的物质分解和合成代谢的产物也不同，这些代谢产物又具有不同的生化特征。
菌种的确认标准操作规程
1．目的建立菌种确认标准操作规程，以减少菌种污染和生长特性的改变，保证实验结果的可靠性和准确性。
2．依据《中国药典》2010版二部3．范围本规程适用于质量控制实验室所用标准储备菌株。
4．责任质量管理部，质量控制实验室5．内容5.1试验菌株大肠埃希菌（Escherichia coli）[CMCC(B)44 102]金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC(B)26 003]枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）[CMCC(B)63 501]白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC(F)98 001]黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC(F)98003]5.1.1标准菌株5.1.1.1标准菌株应来自认可的国内或国外菌种收藏机构。
5.1.1.2标准菌株经过复活并在适宜的培养基中生长后，即为标准储备菌株。
5.1.1.3标准储备菌株应进行纯度和特性确认。
5.1.2工作菌株5.1.2.1标准储备菌株可用于制备每月或每周一次转种的工作菌株5.1.2.2工作菌株的传代次数应严格控制，不得超过5 代（从菌种收藏机构获得的标准菌株为第0代），以防止过度的传代增加表型变化的风险。
因此必要时，应对工作菌株的纯度和特性进行确认。
5.2菌种确认试验的主要内容5.2.1菌种的纯度确认5.2.1.1纯度检测：是指通过适当的方法检测菌种是否为纯培养物。
5.2.1.2试验内容①菌落形态：在特定的培养基上，将待检测培养物稀释涂布或平板划线，适宜培养后，同一平板上的单菌落的大小、形状、颜色、质地、光泽等是否相似；对于两种或以上形态的出发菌株，应再分别挑取单菌落划线或稀释涂布培养，检测是否重复出现相同特征。
②镜检特征：对数生长期的培养物革兰氏染色反应应呈现一致性；细胞形状、大小、荚膜、芽孢等特征应相似。
5.2.2菌种的特性确认5.2.2.1生化试验：各种微生物具有各自的独特的酶系统，因而在代谢过程中所参与的物质分解和合成代谢的产物也不同，这些代谢产物又具有不同的生化特征。
标准菌种确认标准操作规程范文
标准菌种确认标准操作规程一目的建立标准菌种确认标准操作规程，以减少菌种污染和生长特性的改变，保证实验结果的可靠性和准确性。
二范围本规程适用于质量控制实验室所用标准储备菌株。
三内容1.1 试验菌株大肠埃希菌(Escherichia coli )[CMCC(B)44102]金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus )[CMCC(B)26003] 枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis )[CMCC(B)63501] 白色念珠菌(Candida albicans )[CMCC(F)64941]黑曲霉(Aspergillus niger ) [CMCC(F)98003]铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa ) [CMCC(B)10104] 生抱梭菌(Clostridium sporogenes ) [CMCC(F)98001]1.1.1 标准菌株1.1.1.1 标准菌株应来自认可的国内或国外菌种收藏机构。
1.1.1.2 标准菌株经过复活并在适宜的培养基中生长后，即为标准储备菌1.1.1.3 标准储备菌株应进行纯度和特性确认。
1.1.2 工作菌株1.121 标准储备菌株可用于制备每两个月或定期转种的工作菌株。
1.122 工作菌株的传代次数应严格控制，不得超过5代（从菌种收藏机构获得的标准菌株为第0代），以防止过度的传代增加表型变化的风险。
因此必要时，应对工作菌株的纯度和特性进行确认。
1.2 菌种确认试验的主要内容1.2.1 菌种的纯度确认1.2.1.1 纯度检测：是指通过适当的方法检测菌种是否为纯培养物。
1.2.1.2 试验内容①菌落形态：在特定的培养基上，将待检测培养物稀释涂布或平板划线，适宜培养后，同一平板上的单菌落的大小、形状、颜色、质地、光泽等是否相似；对于两种或以上形态的出发菌株，应再分别挑取单菌落划线或稀释涂布培养，检测是否重复出现相同特征。
②镜检特征：对数生长期的培养物革兰氏染色反应应呈现一致性；细胞形状、大小、荚膜、芽抱等特征应相似。
菌种的确认标准操作规程
1．目的建立菌种确认标准操作规程，以减少菌种污染和生长特性的改变，保证实验结果的可靠性和准确性。
2．依据《中国药典》2010版二部3．范围本规程适用于质量控制实验室所用标准储备菌株。
4．责任质量管理部，质量控制实验室5．内容5.1试验菌株大肠埃希菌（Escherichia coli）[CMCC(B)44 102]金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC(B)26 003]枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）[CMCC(B)63 501]白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC(F)98 001]黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC(F)98003]5.1.1标准菌株5.1.1.1标准菌株应来自认可的国内或国外菌种收藏机构。
5.1.1.2标准菌株经过复活并在适宜的培养基中生长后，即为标准储备菌株。
5.1.1.3标准储备菌株应进行纯度和特性确认。
5.1.2工作菌株5.1.2.1标准储备菌株可用于制备每月或每周一次转种的工作菌株5.1.2.2工作菌株的传代次数应严格控制，不得超过5 代（从菌种收藏机构获得的标准菌株为第0代），以防止过度的传代增加表型变化的风险。
因此必要时，应对工作菌株的纯度和特性进行确认。
5.2菌种确认试验的主要内容5.2.1菌种的纯度确认5.2.1.1纯度检测：是指通过适当的方法检测菌种是否为纯培养物。
5.2.1.2试验内容①菌落形态：在特定的培养基上，将待检测培养物稀释涂布或平板划线，适宜培养后，同一平板上的单菌落的大小、形状、颜色、质地、光泽等是否相似；对于两种或以上形态的出发菌株，应再分别挑取单菌落划线或稀释涂布培养，检测是否重复出现相同特征。
②镜检特征：对数生长期的培养物革兰氏染色反应应呈现一致性；细胞形状、大小、荚膜、芽孢等特征应相似。
5.2.2菌种的特性确认5.2.2.1生化试验：各种微生物具有各自的独特的酶系统，因而在代谢过程中所参与的物质分解和合成代谢的产物也不同，这些代谢产物又具有不同的生化特征。
标准菌种确认标准操作规程完整
一目的建立标准菌种确认标准操作规程，以减少菌种污染和生长特性的改变，保证实验结果的可靠性和准确性。
二围本规程适用于质量控制实验室所用标准储备菌株。
三容1.1 试验菌株大肠埃希菌（Escherichia coli）[CMCC(B)44102]金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC(B)26003]枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）[CMCC(B)63501]白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC(F)64941]黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC(F)98003]铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[CMCC(B)10104]生孢梭菌（Clostridium sporogenes）[CMCC(F)98001]1.1.1 标准菌株1.1.1.1 标准菌株应来自认可的国或国外菌种收藏机构。
1.1.1.2 标准菌株经过复活并在适宜的培养基中生长后，即为标准储备菌株。
1.1.1.3 标准储备菌株应进行纯度和特性确认。
1.1.2 工作菌株1.1.2.1 标准储备菌株可用于制备每两个月或定期转种的工作菌株。
1.1.2.2 工作菌株的传代次数应严格控制，不得超过 5 代（从菌种收藏机构获得的标准菌株为第0代），以防止过度的传代增加表型变化的风险。
因此必要时，应对工作菌株的纯度和特性进行确认。
1.2 菌种确认试验的主要容1.2.1 菌种的纯度确认1.2.1.1 纯度检测：是指通过适当的方法检测菌种是否为纯培养物。
1.2.1.2 试验容①菌落形态：在特定的培养基上，将待检测培养物稀释涂布或平板划线，适宜培养后，同一平板上的单菌落的大小、形状、颜色、质地、光泽等是否相似；对于两种或以上形态的出发菌株，应再分别挑取单菌落划线或稀释涂布培养，检测是否重复出现相同特征。
②镜检特征：对数生长期的培养物革兰氏染色反应应呈现一致性；细胞形状、大小、荚膜、芽孢等特征应相似。
标准菌株验证鉴定步骤
1.1 金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌标准菌株：挑取部分干粉溶解于0.9% 无菌氯化钠溶液中，划线接种于营养琼脂平板上，36℃±1℃培养18-24 小时。
并观察菌落形态。
a. 金黄色葡萄球菌：菌落凸起，圆形，不透明；b. 大肠埃希氏菌：菌落稍凸，圆形，湿润，乳白色；c. 铜绿假单胞菌：菌落扁平，圆形，边缘不整齐，光滑湿润，可产生蓝绿或黄绿色素；d. 枯草芽孢杆菌: 表面粗糙不透明，镜检菌体有芽孢。
1.2白色念珠菌：挑取部分干粉溶解于0.9% 无菌氯化钠溶液中，划线接种于改良马丁琼脂培养基平板或PDA 琼脂平板上，30℃-35℃培养24-48 小时。
本菌细胞呈卵圆形，很象酵母菌，比葡萄球菌大5～6 倍，革兰氏染色阳性，但着色不均匀。
黑曲霉：挑取部分干粉溶解于0.9% 无菌氯化钠溶液中，划线接种于改良马丁琼脂斜面培养基上，23℃-28℃培养48-96 小时。
菌丛呈黑褐色，粗糙。
1.2 生孢梭菌：挑取部分干粉溶解于0.9% 无菌氯化钠溶液中，接种于硫乙醇酸盐流体培养基中，30℃～35℃培养18-24 小时；或在厌氧条件下接种于哥伦比亚琼脂上，30℃～35℃厌氧培养18-24 小时。
2、菌种鉴定：2.1金黄色葡萄球菌：革兰氏染色试验：革兰氏阳性菌(紫色)，葡萄状排列，球菌。
兔血浆试验：接种1 个单菌落于1 支兔血浆溶液中，30℃-35℃培养至6 小时，每半小时观察一次。
凝固为阳性。
金黄色葡萄球菌为阳性反应。
2.2大肠埃希氏菌：革兰氏染色试验：革兰氏阴性杆菌，红色。
IMVC 生化试验：2.3铜绿假单胞菌：革兰氏染色试验：革兰氏阴性杆菌，红色A。
氧化酶试验：将氧化酶试纸用蒸馏水浸湿，用细玻璃棒或一次性接种针挑取单个菌落，涂在试纸上。
在60s 内变为蓝色或蓝紫色为阳性，不变色为阴性。
绿脓菌素试验：取斜面培养物接种于PDP 琼脂培养基斜面上，培养24 小时，加三氯甲烷3～5 ml 至培养管中，搅碎培养基并充分振摇。
标准菌种确认标准操作规程
一目的建立标准菌种确认标准操作规程，以减少菌种污染和生长特性的改变，保证实验结果的可靠性和准确性。
二范围本规程适用于质量控制实验室所用标准储备菌株。
三内容1.1试验菌株大肠埃希菌（Escherichiacoli）[CMCC(B)44102]金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）[CMCC(B)26003]枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）[CMCC(B)63501]白色念珠菌（Candidaalbicans）[CMCC(F)64941]黑曲霉（Aspergillusniger）[CMCC(F)98003]铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa）[CMCC(B)10104]生孢梭菌（Clostridiumsporogenes）[CMCC(F)98001]1.1.1标准菌株1.1.1.1标准菌株应来自认可的国内或国外菌种收藏机构。
1.1.1.2标准菌株经过复活并在适宜的培养基中生长后，即为标准储备菌株。
1.1.1.3标准储备菌株应进行纯度和特性确认。
1.1.2工作菌株1.1.2.1标准储备菌株可用于制备每两个月或定期转种的工作菌株。
1.1.2.2工作菌株的传代次数应严格控制，不得超过5代（从菌种收藏机构获得的标准菌株为第0代），以防止过度的传代增加表型变化的风险。
因此必要时，应对工作菌株的纯度和特性进行确认。
1.2菌种确认试验的主要内容1.2.1菌种的纯度确认1.2.1.1纯度检测：是指通过适当的方法检测菌种是否为纯培养物。
1.2.1.2试验内容①菌落形态：在特定的培养基上，将待检测培养物稀释涂布或平板划线，适宜培养后，同一平板上的单菌落的大小、形状、颜色、质地、光泽等是否相似；对于两种或以上形态的出发菌株，应再分别挑取单菌落划线或稀释涂布培养，检测是否重复出现相同特征。
②镜检特征：对数生长期的培养物革兰氏染色反应应呈现一致性；细胞形状、大小、荚膜、芽孢等特征应相似。
标准菌株使用标准操作规程
标准菌株使用标准操作规程1 检验目的对实验室的标准菌株进行合理的保存，并规范合理的使用流程，保证菌株的性能稳定可靠。
2 范围微生物实验室保存的标准菌株。
3 职责微生物组工作人员正确执行本操作规程。
4 术语和定义4.1标准菌株其特征进行了分类和描述，有明确的来源。
ATCC（American Type Culture Collection）美国标准菌株收藏中心。
4.2标准储备菌株标准菌株经过一代转接后获得的同种菌株。
4.3 工作菌株标准储备菌株传代后得到的同种菌株。
4.4 标准培养物标准菌株、标准储备菌株、工作菌株的统称。
4.5质控菌株ATCC最佳，但当无法获得时可以使用ATCC演化的菌株或我国国家菌种库储存的标准菌株。
特殊情况，例如定性试验可用已知的菌种作为质控菌株。
室间质评的菌株即可。
5 保存程序5.1标准菌株5.1.1商业购买的ATCC标准菌株干粉，-80℃低温保存，可以2年以上。
安瓿真空包装的，-80℃可长期稳定保存。
将标准菌株进行编号和登记。
5.1.2复苏用1ml无菌的小牛血清或营养肉汤溶解。
根据菌种的生长特点，接种到新鲜培养基上选择适宜的培养条件培养18-24h。
酵母菌要求3天，形成孢子的微生物宜保存孢子。
5.2标准储备菌株5.2.1由复苏后的ATCC标准菌株制备。
复苏后的标准菌株要检查其纯度，必要时进行生化试验检查。
刮取培养物上的菌体，用足量的菌悬浮于防冻培养基中。
防冻液可以是无菌脱纤维羊血、10%甘油肉汤。
储存足够量的标准储备菌株，可用1-2年。
一年52周需要52支以上。
5.2.2甘油肉汤保存法成分有蛋白胨、牛肉浸出粉、氯化钠、甘油、纯化木。
相当于20%的甘油。
挑取5环菌落加入到1ml甘油肉汤中混匀。
苛养菌可以适当增加菌量。
-80℃保存。
除链球菌和嗜血杆菌以外细菌均可使用。
保存期限1-5年。
5.2.3全血保存法成分为脱纤维羊血。
挑取5环菌落加入到1ml甘油肉汤中混匀。
苛养菌可以适当增加菌量。
标准菌株的复活、传代及性能确认操作规程
1标准菌株复活购回的标准菌株一般为安培装冻干粉剂，依照随产品附有的菌种复活方法，以及〈〈人间传染病微生物分类目录〉〉和〈〈实验室生物安全通用要求〉〉，在相应的生物安全水平下，开启包装。
用75%酒精棉球擦拭安培瓶上部，可用砂轮或锉刀在安培瓶上部划一小痕迹，用无菌纱布包住安培瓶，两手分别捏住安培瓶上下两端，稍向外用力便可打开安培瓶。
依据菌株特性选择合适的培养基和培养条件，用无菌吸管吸适量的液体培养基加到冻干块上，吹打混匀成悬液，将全部悬液移入含有5ml合适的液体培养基中，将管中残留的几滴悬液移种到斜面上，适宜的温度培养一定的时间。
观察生长状况，可适当延长培养时间。
2菌株的性能确认2.1纯度检查菌落形态取复活后的培养物，在相应的鉴别平板或非选择平板上划线分离，培养出单菌落，观察菌落形态是否符合该菌株要求，同一平板上的单菌落大小，形状、颜色、质地、光泽是否相似，对于出现两种以上形态的菌株，应再分别挑取单菌落划线，检测是否出现相同特征。
2.2细胞形态取划线平板上的单菌落，革兰氏染色反应应符合要求，且呈现一致性。
2.3生化鉴定必要时进行生化鉴定2.4污染处理如发现菌株有污染，挑选目标菌培养成功后，将培养物灭菌销毁（121℃30min）3菌株的传代3.1标准储备菌株的制备标准储备菌株是在经多次传代后制备的多份相同的菌株。
将复活后经过性能确认的菌株的斜面培养物，用0.85%的灭菌生理盐水0.5ml洗斜面菌苔成菌悬液将上述菌悬液吸入灭菌管中，加入0.5ml40%的灭菌甘油，混匀，密封。
保藏温度为—18℃3.2工作菌株的制备由冻干或超低温保存的标准储备菌株经一次传代得到的菌株。
工作菌株不宜再传代，工作菌株使用和储存过程中严格遵守无菌操作，即不存在交叉污染，可以多次使用。
保藏温度为4-6℃3.3制备好的菌株应由室主任统一编号，标识，专人专柜保藏。
标准菌株的管理与使用操作规程
标准菌株的管理与使用操作规程一、目的规范用于微生物实验质量控制和操作评估的标准菌株管理与使用程序，尽量减少交叉污染确保实验结果可靠与实验室安全。
二、范围本工作指引适用于微生物实验室所有标准菌株的管理与使用。
三、内容3.1 程序1.标准菌株的复壮a.将复壮所用的0.5-1ml液体培养基（如TS或BPW）置于室温；b.将标准菌株从冰箱取出置于室温；c.无菌操作去除菌株的包装物；d.无菌操作敬液体培养基导入菌株容器；或者无菌操作剪开菌株包装物，将菌株倒入液体培养基；e.将试管在37℃下放置一段时间后，使菌种完全溶解到培养基中；f.轻轻摇动试管形成悬浮液；g. 从菌种悬浮液中接种几环到培养基平板（如营养琼脂）划线培养；h. 将接种过的平板置于合适的温度和条件下培养复壮。
2. 从培养过的平板或斜面上挑取几个菌落，按照相应的LI接种到选择性培养基上。
3. 将挑选出的菌落按照相应的LI进行菌种确认。
进行革兰氏染色或者镜检，并纯化后按照相应的LI进行生化试验确认。
记录下所有的现象。
4. 在每年复壮或者买入是都要进行菌种确认实验。
5. 菌种确认达到要求后，使用Microbank Frozen Beads标准储备菌株。
a.取一定量的标准菌株培养物（18-24h），无菌操作接种到装有小珠的小瓶内并加入肉汤（BPW）。
关紧小瓶并颠倒4-5次乳化培养物。
不要剧烈摇晃，避免液体洒出；b.将多余的液体吸出。
关紧小瓶；c.在小瓶上贴上标签，标明菌种名称和准备日期；d.小瓶在冷冻条件下（大约-20℃）可储存一年；e.从Microbank中准备工作菌株：从小瓶中无菌操作取出一个小珠，接种到非选择性培养基平板或斜面，或者放入液体培养基中。
小珠从小瓶中取出后决不可以再放回。
立即将小瓶放回冷冻；f. 接种过的平板、斜面或者肉汤放在37℃培养24-48h。
一旦发现平板、斜面或者肉汤有微生物生长后立即从培养箱取出；g.在平板、斜面或者肉汤上粘贴标签，注明菌种名称、准备日期和有效期。
标准菌株使用标准操作规程
标准菌株使用标准操作规程2020年4月19日文档仅供参考标准菌株使用标准操作规程1检验目的对实验室的标准菌株进行合理的保存，并规范合理的使用流程，保证菌株的性能稳定可靠。
2范围微生物实验室保存的标准菌株。
3职责微生物组工作人员正确执行本操作规程。
4术语和定义4.1标准菌株其特征进行了分类和描述，有明确的来源。
ATCC(American Type Culture Collection)美国标准菌株收藏中心。
4.2标准储备菌株标准菌株经过一代转接后获得的同种菌株。
4.3工作菌株标准储备菌株传代后得到的同种菌株。
4.4标准培养物标准菌株、标准储备菌株、工作菌株的统称。
4.5质控菌株ATCC最佳，但当无法获得时能够使用ATCC演化的菌株或中国国家菌种库储存的标准菌株。
特殊情况，例如定性试验可用已知的菌种作为质控菌2020年4月19日文档仅供参考株。
室间质评的菌株即可。
5保存程序5.1标准菌株5.1.1商业购买的ATCC标准菌株干粉，-80℃低温保存，能够2年以上。
安甑真空包装的，-80℃可长期稳定保存。
将标准菌株进行编号和登记。
5.1.2复苏用1ml无菌的小牛血清或营养肉汤溶解。
根据菌种的生长特点，接种到新鲜培养基上选择适宜的培养条件培养18-24h。
酵母菌要求3天，形成抱子的微生物宜保存胞子。
5.2标准储备菌株5.2.1由复苏后的ATCC标准菌株制备。
复苏后的标准菌株要检查其纯度，必要时进行生化试验检查。
刮取培养物上的菌体，用足量的菌悬浮于防冻培养基中。
防冻液能够是无菌脱纤维羊血、10%甘油肉汤。
储存足够量的标准储备菌株，可用1-2年。
一年52周需要52支以上。
5.2.2甘油肉汤保存法成分有蛋白胨、牛肉浸出粉、氯化钠、甘油、纯化木。
相当于20%的甘油。
挑取5环菌落加入到1ml甘油肉汤中混匀。
苛养菌能够适当增加菌量。
-80℃ 保存。
除链球菌和嗜血杆菌以外细菌均可使用。
保存期限1-5年。
5.2.3全血保存法成分为脱纤维羊血。
菌种传代、保存、使用、销毁操作规程(第一版第0次修订)
1术语标准菌株是指由微生物菌种保藏管理中心提供的冷冻干燥菌。
传代用菌种（标准储备菌株）是指用标准菌种制备的采用特定保存方法长期固定保存的菌种，用于传代及制备工作用菌种。
工作菌株是指用标准菌种或传代用菌种接种至相应固体或液体培养基后作为日常工作使用的菌种。
菌种的代是指将其接种至一新鲜培养基培养上，每萌发一次即称为一代，从菌种保藏中心获得的冷冻干燥菌种为第0代。
2操作程序2.1菌种接收（验收）菌种到达实验室后，由菌种管理人员接收菌种，检查其名称和数量，以及每一支的完整性，同时将菌种的所有信息，进行记录，内容包括：名称、编号、数量、代数、来源、接收日期、接收人等，并将其贮存于菌种说明书规定条件中，在有效期内完成菌种复苏。
2.2菌种复苏、复核、传代按菌种所附说明书进行复苏培养，或按检验标准中菌株的要求接种至适宜培养基内适宜温度和时间进行培养。
必要时按相应检验标准复核菌株，即接种上述培养物至适宜培养基中，适宜温度和时间进行培养后，观察菌落形态，或进行革兰氏染色及镜检，必要时进行进一步生化鉴定。
若菌种不纯或疑有污染，应查因及处理。
菌种复核后转接斜面或按冻存管说明书制备冻存液。
菌种管编号，将菌种冻存管冻存、斜面相应温度培养后适宜温度保存或使用。
菌株传代、使用不超过5代。
操作完成及时予以记录。
2.3菌种保存斜面低温保存法：将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上，待菌生长充分以后，转移至4～8℃冰箱中保存。
此法用于菌种的短期保存，使用时若发现污染杂菌和变异等异常情况，应停止使用并灭活销毁。
冻存管法：按产品说明书操作与保存。
斜面低温保存法主要用于工作菌种的保存，保存时间根据菌种种类不同而不同，细菌与酵母菌一般2个月，霉菌及芽胞一般3个月；冻存管法用于传代菌种的保存。
2.4实验室菌种的编号采用字母加数字表示：菌株保藏编号（代次）-保存年份-顺序号。
代次用G带有下标数字表示。
2.5菌种保管保存、领用与销毁菌种设双人双锁保管、领用。
标准贮备菌株鉴定操作规程
分发部门：综合部销售部研发部生产部质量部质检制剂车间仓库1 主题内容与适用范围本规程规定了标准贮备菌株鉴定的操作方法。
本规程适用于对标准贮备菌株的鉴定。
2 引用标准《药品生产质量管理规范》、《中国药典2015年版》及《伯杰氏系统细菌学手册》现行版3 职责微生物检测质检员：负责按本规程对微生物标准菌株进行鉴定。
质量部负责人：负责按本规程对标准菌株的鉴定结果进行审核。
质量部QA：负责监督本规程的执行；4 程序采购的标准菌株需进行纯度和特性的确认。
4.1 方法增菌培养→分离培养→纯培养→确认试验（菌落形态、革兰氏染色、镜检、生化鉴定）4.1.1 纯培养用无菌接种环挑取待鉴定菌落/菌液至相应的琼脂培养基斜面或平板上培养，得到纯化的单一菌落，做以下检查。
4.1.2 革兰氏染色、镜检4.1.2.1 革兰氏染色原理（1）革兰氏染色法可将所有细菌分为两大类：革兰氏阳性细菌G+和革兰氏阴性细菌G－。
细菌对于革兰氏染色的不同反应是由于它们细胞壁的成份和结构不同而造成的。
（2）革兰氏阳性细菌G+：其细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用结晶紫溶液染色细胞后用脱色剂脱色时，引起细胞壁肽聚糖糖层网状结构中的孔径缩小以至关闭，通透性降低，使结晶紫－碘复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此呈现深紫色。
（3）革兰氏阴性细菌G－：其细胞壁中肽聚糖含量低而脂类物质含量高，当用乙醇脱色时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫－碘复合物易被乙醇抽出而脱色，继而又被复染液着色，因此呈现红色。
4.1.2.2 革兰氏染色液(1)草酸铵结晶紫溶液：结晶紫乙醇饱和液(结晶紫2g溶于20ml95%乙醇中)20mlL，1%草酸铵水溶液80ml 将两液混匀置24h后过滤即成。
(2)卢戈氏碘液：碘0.33g，碘化钾0.66g，蒸馏水100ml。
先将碘化钾溶于少量蒸馏水中，然后加入碘使之完全溶解，再加蒸馏水至100ml即成。
配成后贮于棕色瓶内备用，如变为黄色即不能使用。
标准储备菌株纯度确认标准操作规程
标准储备菌株纯度确认标准操作规程1.⽬的：建⽴标准菌种确认标准操作规程，以减少菌种污染和⽣长特性的改变，保证实验结果的可靠性和准确性。
2.范围：微⽣物限度实验室所⽤标准储备菌株。
3.职责：QC主管⽣测员对本规程的实施负责。
4.依据：中国药典2015年版四部通则。
5.内容：5.1.实验菌株5.1.1 标准菌株5.1.1.1 标准菌株应来⾃认可的国内或国外菌种收藏机构。
5.1.1.2 标准菌株经过复活并在适宜的培养基中⽣长后，即为标准储备菌株。
5.1.1.3 标准储备菌株应进⾏纯度和特性确认。
5.1.2 ⼯作菌株5.1.2.1 标准储备菌株可⽤于定期转种（每3个⽉）或制备⼯作菌株。
5.1.2.2 ⼯作菌株的传代次数应严格控制，不得超过5代（从菌种收藏机构获得的标准菌株为第0代），以防⽌过度的传代增加表型变化的风险。
因此必要时，应对⼯作菌株的纯度和特性进⾏确认。
5.2 菌种确认试验的主要内容5.2.1 菌种的纯度确认5.2.1.1 纯度检测：是指通过适当的⽅法检测菌种是否为纯培养物。
5.2.1.2 实验内容⑴菌落形态：在特定的培养基上，将待检测培养物稀释涂布或平板划线，适宜培养后，⽤⼀平板上的单菌落的⼤⼩、形状、颜⾊、质地、光泽等是否相似；对于两种或以上形态的出发菌株，应再分别挑取单菌落划线或稀释涂布培养，检测是否重复出现相同特征。
⑵镜检特征：对数⽣长期的培养物⾰兰⽒染⾊反应应呈现⼀致性；细胞形状、⼤⼩、荚膜、芽孢等特征应相似。
5.2.2 菌种的特性确认5.2.2.1 ⽣化试验各种微⽣物具有各⾃的独特的酶系统，因⽽在代谢过程中所参与的物质分解和合成代谢的产物也不同，这些代谢产物⼜具有不同的⽣化特征。
根据此特征，利⽤⽣物化学⽅法来鉴定不同的微⽣物的试验即为微⽣物的⽣化试验。
5.3 菌种的确定⽅法⽤⽆菌的接种环粘取培养物，在相应的培养基平板上划线分离单个菌落，并在适宜条件下培养。
培养后观察是否具有典型的菌落形态，然后挑取单⼀纯菌落，进⾏⾰兰染⾊、镜检，观察其染⾊特性及菌形。
检定菌管理规程
检定菌管理规程1. 目的规范检定菌种的管理与使用程序，确保菌种的溯源性和稳定性，保证微生物限度检查的结果准确可靠，保证检验人员的安全。
2.范围检定菌的申购、接收、保存、传代、使用与销毁等。
3.术语或定义3.1标准菌株：来自认可的国内或国外菌种保藏机构，其复苏、复壮或培养物的制备应按供应商提供的说明或按已验证的方法进行。
3.2 标准储备菌株：从国内或国外菌种保藏机构获得的标准菌株经过复活并在适宜的培养基中生长后，即为标准储备菌株。
标准储备菌株应进行纯度和特性确认。
3.3 工作菌株：是指用标准储备菌种接种至普通琼脂斜面培养基上，作为以后工作使用的菌株。
4. 职责4.1 质量控制部主任负责菌种的申购。
4.2 微生物检验人员负责菌种的验收、保管、传代、使用及销毁等。
4.3 质量管理负责人负责菌种申购计划的批准。
5. 程序5.1 检定菌种的购买质量控制部主任根据菌种使用情况（包括临时检验需要），提出申购计划，由质量管理负责人批准后，申购记录（附件1）交给物供部负责人购买。
5.2 检定菌种的接收菌种到达实验室后，由微生物检验人员验收菌种，检查其名称和数量，以及每一支的完整性，同时将菌种的所有信息，填写在检定菌种接收记录（附件2）上，内容包括：菌种名称、数量、编号、代数、来源、接收日期、接收人等。
5.3 检定菌种的保管5.3.1 菌种保管应有专人负责，保存于加锁的冰箱中，将购进的试管斜面菌种放入（2～8℃）冷藏保存，有效期为3个月。
确保菌种安全，因工作变动时，必须做好交接工作。
5.3.2 工作用菌种采用斜面低温保存法。
5.3.3 检定菌种的定期检查在菌种的保存期间，应每周检查保存菌种冰箱的温度、菌种管的塞子是否松动或生霉，并及时填写《检定菌种观察记录》（附件3），如有异常应及时灭活处理后销毁。
5.3.4 所保管的菌种，不能随意转让其他单位和个人，需要时应有单位证明和批准手续方可供应。
5.4 检定菌种的传代5.4.1 1代是指将活的培养物接种到微生物生长的新鲜培养物中培养，任何形式的转种均被认为是传代1次，从菌种保藏机构获得的标准菌种为第0代。
标准菌验收、制备、保藏、传代、使用、销毁的管理
标准菌验收、制备、保藏、传代、使用、销毁的管理介绍了微生物实验中使用的标准菌的验收、制备、保藏、传代、使用、销毁的管理规程规定了质量管理部门实验用标准菌种的验收、制备、储管、使用、以及销毁等的相关规定。
适用于微生物限度检查、无菌检查、抗生素微生物（效价）测定、评价防腐剂和抗菌剂的抑菌效果和确认灭菌效果、检验方法的验证、培养基的适用性检查，样品检验时的阳性对照等。
依据: 中国药典2010年版二部及菌种使用说明书1.标准菌的来源标准菌株由中国药品生物制品检定所医学菌种保藏中心（China Medical culture collection ,CMCC）提供的冷冻干燥菌种（0代）或由上级药检部门已接种好的菌种斜面（3代）。
黑曲霉的0代菌种为保存于含15%甘油的0.9%无菌氯化钠溶液中的孢子悬液冷存管。
中国药品生物制品检定所医学微生物菌种保藏管理中心提供的冷冻干燥菌种的标签CMCC （B）代表细菌（bacteria）,CMCC(F)代表真菌（fungi）每种菌具有固定的代号。
2.标准菌的验收从菌种保藏中心购买的原始菌种管是玻璃安瓿装的冻干菌，接收同时应检查是否有随菌种附有的相关资料。
接收菌种时应检查安瓿的数量和名称，和每一支安瓿的完整性。
在相应的菌种接收记录上记上所有的关于菌种的信息，如名称、数量和接收日期等。
在菌种安瓿及菌种管上粘贴标签，内容包括：菌种名称、菌种代号、代次、接收日期、接收人、贮存条件、有效期至。
新购入的0代原始菌种储存于－20℃，有效期为三年。
从上级药检部门购买的已接种好的菌种斜面（3代）应检查菌种管是否完好。
储存于2～8 ℃，有效期为3个月。
3. 标准菌的复苏、复壮及标准储备菌株的制备3.1物品及试剂：接种针、酒精灯、移液管、75%酒精及75%酒精棉球3.2培养基改良马丁琼脂培养基:用于黑曲霉复苏、复壮.液体硫乙醇酸盐培养基:用于生孢梭菌复苏、复壮.营养肉汤培养基:用于金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌、短小芽孢杆菌、铜绿假单胞菌复苏、复壮。
标准菌种确认标准操作规程
标准菌种确认标准操作规程一目的建立标准菌种确认标准操作规程，以减少菌种污染和生长特性的改变，保证实验结果的可靠性和准确性。
二围本规程适用于质量控制实验室所用标准储备菌株。
三容1.1 试验菌株大肠埃希菌（Escherichia coli）[CMCC(B)44102]金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC(B)26003]枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）[CMCC(B)63501]白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC(F)64941]黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC(F)98003]铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[CMCC(B)10104]生孢梭菌（Clostridium sporogenes）[CMCC(F)98001]1.1.1 标准菌株1.1.1.1 标准菌株应来自认可的国或国外菌种收藏机构。
1.1.1.2 标准菌株经过复活并在适宜的培养基中生长后，即为标准储备菌株。
1.1.1.3 标准储备菌株应进行纯度和特性确认。
1.1.2 工作菌株1.1.2.1 标准储备菌株可用于制备每两个月或定期转种的工作菌株。
1.1.2.2 工作菌株的传代次数应严格控制，不得超过5 代（从菌种收藏机构获得的标准菌株为第0代），以防止过度的传代增加表型变化的风险。
因此必要时，应对工作菌株的纯度和特性进行确认。
1.2 菌种确认试验的主要容1.2.1 菌种的纯度确认1.2.1.1 纯度检测：是指通过适当的方法检测菌种是否为纯培养物。
1.2.1.2 试验容①菌落形态：在特定的培养基上，将待检测培养物稀释涂布或平板划线，适宜培养后，同一平板上的单菌落的大小、形状、颜色、质地、光泽等是否相似；对于两种或以上形态的出发菌株，应再分别挑取单菌落划线或稀释涂布培养，检测是否重复出现相同特征。
②镜检特征：对数生长期的培养物革兰氏染色反应应呈现一致性；细胞形状、大小、荚膜、芽孢等特征应相似。
标准菌株使用标准操作规程
标准菌株使用标准操作规程1 检验目的对实验室的标准菌株进行合理的保存，并规范合理的使用流程，保证菌株的性能稳定可靠。
2 范围微生物实验室保存的标准菌株。
3 职责微生物组工作人员正确执行本操作规程。
4 术语和定义4.1标准菌株其特征进行了分类和描述，有明确的来源。
ATCC（American Type Culture Collection）美国标准菌株收藏中心。
4.2标准储备菌株标准菌株经过一代转接后获得的同种菌株。
4.3 工作菌株标准储备菌株传代后得到的同种菌株。
4.4 标准培养物标准菌株、标准储备菌株、工作菌株的统称。
4.5质控菌株ATCC最佳，但当无法获得时可以使用ATCC演化的菌株或我国国家菌种库储存的标准菌株。
特殊情况，例如定性试验可用已知的菌种作为质控菌株。
室间质评的菌株即可。
5 保存程序5.1标准菌株用1ml无菌的小牛血清或营养肉汤溶解。
根据菌种的生长特点，接种到新鲜培养基上选择适宜的培养条件培养18-24h。
酵母菌要求3天，形成孢子的微生物宜保存孢子。
5.2标准储备菌株成分有蛋白胨、牛肉浸出粉、氯化钠、甘油、纯化木。
相当于20%的甘油。
挑取5环菌落加入到1ml甘油肉汤中混匀。
苛养菌可以适当增加菌量。
-80℃保存。
除链球菌和嗜血杆菌以外细菌均可使用。
保存期限1-5年。
成分为脱纤维羊血。
挑取5环菌落加入到1ml甘油肉汤中混匀。
苛养菌可以适当增加菌量。
-80℃保存。
主要用于保存链球菌、嗜血杆菌及厌氧菌。
保存期限1-5年。
5.3工作标准菌株由标准储备菌株传代得到的菌株。
标准储备菌株对多向下传三代。
过多的传种会增加变异的机会。
标准储备菌株根据菌种特点选择适宜的培养基和培养条件进行培养18-24h即工作标准菌株。
储存在2-8℃，可放四周。
个别营养要求高的为2周，例如肺炎链球菌和嗜血杆菌。
使用时应编号并登记。
5.4编号方法每个菌的保存管都要有唯一的编号，签字笔标注，便于查找和管理。
5.5记录管理5.5.1菌种应有严格的登记。
标准菌种确认标准操作规程
一目的建立标准菌种确认标准操作规程，以减少菌种污染和生长特性的改变，保证实验结果的可靠性和准确性。
二范围本规程适用于质量控制实验室所用标准储备菌株。
三内容1.1试验菌株大肠埃希菌（Escherichiacoli）[CMCC(B)44102]金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）[CMCC(B)26003]枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）[CMCC(B)63501]白色念珠菌（Candidaalbicans）[CMCC(F)64941]黑曲霉（Aspergillusniger）[CMCC(F)98003]铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa）[CMCC(B)10104]生孢梭菌（Clostridiumsporogenes）[CMCC(F)98001]1.1.1标准菌株1.1.1.1标准菌株应来自认可的国内或国外菌种收藏机构。
1.1.1.2标准菌株经过复活并在适宜的培养基中生长后，即为标准储备菌株。
1.1.1.3标准储备菌株应进行纯度和特性确认。
1.1.2工作菌株1.1.2.1标准储备菌株可用于制备每两个月或定期转种的工作菌株。
1.1.2.2工作菌株的传代次数应严格控制，不得超过5代（从菌种收藏机构获得的标准菌株为第0代），以防止过度的传代增加表型变化的风险。
因此必要时，应对工作菌株的纯度和特性进行确认。
1.2菌种确认试验的主要内容1.2.1菌种的纯度确认1.2.1.1纯度检测：是指通过适当的方法检测菌种是否为纯培养物。
1.2.1.2试验内容①菌落形态：在特定的培养基上，将待检测培养物稀释涂布或平板划线，适宜培养后，同一平板上的单菌落的大小、形状、颜色、质地、光泽等是否相似；对于两种或以上形态的出发菌株，应再分别挑取单菌落划线或稀释涂布培养，检测是否重复出现相同特征。
②镜检特征：对数生长期的培养物革兰氏染色反应应呈现一致性；细胞形状、大小、荚膜、芽孢等特征应相似。
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1.目的：建立标准菌种确认标准操作规程，以减少菌种污染和生长特性的改变，保证实验结果的可靠性和准确性。
2.范围：微生物限度实验室所用标准储备菌株。
3.职责：QC主管生测员对本规程的实施负责。
4.依据：中国药典2015年版四部通则。
5.内容：5.1.实验菌株5.1.1 标准菌株5.1.1.1 标准菌株应来自认可的国内或国外菌种收藏机构。
5.1.1.2 标准菌株经过复活并在适宜的培养基中生长后，即为标准储备菌株。
5.1.1.3 标准储备菌株应进行纯度和特性确认。
5.1.2 工作菌株5.1.2.1 标准储备菌株可用于定期转种（每3个月）或制备工作菌株。
5.1.2.2 工作菌株的传代次数应严格控制，不得超过5代（从菌种收藏机构获得的标准菌株为第0代），以防止过度的传代增加表型变化的风险。
因此必要时，应对工作菌株的纯度和特性进行确认。
5.2 菌种确认试验的主要内容5.2.1 菌种的纯度确认5.2.1.1 纯度检测：是指通过适当的方法检测菌种是否为纯培养物。
5.2.1.2 实验内容⑴菌落形态：在特定的培养基上，将待检测培养物稀释涂布或平板划线，适宜培养后，用一平板上的单菌落的大小、形状、颜色、质地、光泽等是否相似；对于两种或以上形态的出发菌株，应再分别挑取单菌落划线或稀释涂布培养，检测是否重复出现相同特征。
⑵镜检特征：对数生长期的培养物革兰氏染色反应应呈现一致性；细胞形状、大小、荚膜、芽孢等特征应相似。
5.2.2 菌种的特性确认5.2.2.1 生化试验各种微生物具有各自的独特的酶系统，因而在代谢过程中所参与的物质分解和合成代谢的产物也不同，这些代谢产物又具有不同的生化特征。
根据此特征，利用生物化学方法来鉴定不同的微生物的试验即为微生物的生化试验。
5.3 菌种的确定方法用无菌的接种环粘取培养物，在相应的培养基平板上划线分离单个菌落，并在适宜条件下培养。
培养后观察是否具有典型的菌落形态，然后挑取单一纯菌落，进行革兰染色、镜检，观察其染色特性及菌形。
再做生化试验或使用菌种鉴定系统进一步鉴定菌种。
5.3.1 大肠埃希菌的确认5.3.1.1 菌落形态⑴取大肠埃希菌新鲜培养物至胰酪大豆胨液体培养基中，经35℃培养18～24小时后，形成菌膜，管底有粘液状沉淀，培养物有粪臭味。
⑵取上述培养物接种于麦康凯琼脂平板上，35℃培养18～24小时后，观察结果。
⑶麦康凯琼脂平板上菌落形态呈鲜桃红色或微红色，菌落中心呈深桃红色，圆形，扁平，边缘整齐，表面光滑，湿润。
5.3.1.2 革兰染色、镜检⑴革兰染色以接种环沾取无菌水于洁净的载玻片上，取麦康凯琼脂平板上的菌落，制成均匀涂片，自然或微温晾干，再通过火焰2～3次干燥固定。
滴加结晶紫染液，染色1分钟，水洗。
滴加碘液，媒染1分钟，水洗，用滤纸吸干余水。
滴加95%乙醇，脱色20～30秒，至流出液无色，水洗。
滴加沙黄染液，复染1分钟，待干后，镜检。
⑵染色结果：革兰阳性菌呈蓝紫色；革兰阴性菌呈红色。
⑶镜检结果：两端钝圆的短小直杆菌，单个或成对，革兰阴性，无芽孢，多有鞭毛。
以周身鞭毛运动或不运动，许多菌株有荚膜和微荚膜。
5.3.1.3 生化试验⑴靛基质试验 (I) 取麦康凯琼脂平板上的菌落，接种于蛋白胨水培养基，培养24～48小时，沿管壁加入靛基质试液数滴，轻轻摇动试管。
液面成玫瑰红色为阳性，呈试剂本色为阴性。
98%的大肠埃希菌靛基质试验为阳性。
一般24h即可出现阳性结果，以无菌操作先从管中取出1或2ml培养液进行检查，如靛基质是阴性，余下的蛋白胨水培养基再培养24h，作靛基质试验。
⑵甲基红试验(M) 取麦康凯琼脂平板上的菌落,接种于缓冲葡萄糖胨水培养基,培养48±2小时,于培养液中加入甲基红指示液2～3滴（约每1ml培养液加指示液1滴），轻微摇动，立即观察。
液面成红色或橘红色为阳性，呈黄色为阴性。
⑶乙酰甲基甲醇生成试验(V-P) 取麦康凯琼脂平板上的菌落，接种于缓冲葡萄糖胨水培养基,培养48±2小时，于2ml培养液中加入α-萘酚乙醇试液1ml,混匀，再加40%氢氧化钾试液0.4ml,充分振摇，在30分钟内出现红色为阳性，无红色反应色为阴性。
⑷枸橼酸盐利用试验(C) 取麦康凯琼脂平板上的菌落，接种于西蒙氏柠檬酸盐琼脂培养基斜面上，培养2～4天。
培养基斜面上有菌苔生长，培养基由绿色变为蓝色时为阳性，培养基颜色无改变，无菌苔生长为阴性。
⑸乳糖发酵试验取麦康凯琼脂平板上的菌落，接种于乳糖发酵管，培养小时，观察产酸（指示剂为酸性品红者为红色；指示剂为溴麝香草酚蓝者为黄色），产气（小倒管内有气泡，气泡无论大小都是产气）。
为避免迟缓发酵乳糖产生假阴性，亦可接种5%乳糖发酵管。
绝大多数迟缓发酵乳糖的细菌，可于24小时出现阳性，或适当延长培养时间。
5.3.2 金黄色葡萄球菌的确认5.3.2.1 菌落形态⑴取金黄色葡萄球菌新鲜培养物至胰酪大豆胨液体培养基中，经35℃培养18～24小时后，呈均匀浑浊生长，繁殖较多时易产生沉淀，沉淀易被摇散。
⑵取上述培养物划线接种于甘露醇氯化钠琼脂平板上，培养24～72小时观察结果。
⑶菌落形态金黄色，圆形凸起，边缘整齐，外围有卵磷脂分解的乳浊圈，菌落直径1～2mm。
5.3.2.2 革兰染色、镜检⑴革兰染色以接种环沾取无菌水于洁净的载玻片上，取甘露醇氯化钠琼脂平板上的菌落，制成均匀涂片，自然或微温晾干，再通过火焰2～3次干燥固定。
滴加结晶紫染液，染色1分钟，水洗。
滴加碘液，媒染1分钟，水洗，用滤纸吸干余水。
滴加95%乙醇，脱色20～30秒，至流出液无色，水洗。
滴加沙黄染液，复染1分钟，待干后，镜检。
⑵染色结果：革兰阳性菌呈蓝紫色；革兰阴性菌呈红色。
⑶镜检结果：为革兰阳性球菌，菌体呈球形或略椭球形，菌体短小，菌体大小不一。
无芽孢，一般不产生荚膜。
排列呈不规则的葡萄状，亦可呈单个、成双或短链状排列。
5.3.2.3 生化试验⑴触酶试验取甘露醇氯化钠琼脂平板上的菌落，接种至TSA斜面上，培养24小时。
取TSA上的菌落置于洁净的载玻片上，然后滴加3%的过氧化氢数滴，长气泡为阳性，否则为阴性。
（原理：具有过氧化氢酶的细菌，能催化过氧化氢生成水和氧，出现气泡）5.3.3.1 枯草芽孢杆菌的确认5.3.3.1 菌落形态⑴取枯草芽孢杆菌新鲜培养物至胰酪大豆胨液体培养基中，经35℃培养18～24小时后，液体培养基表面呈片状生长。
⑵取上述培养物划线接种于胰酪大豆胨琼脂平板上，培养24～72小时观察结果。
⑶菌落为灰色，干燥、皱缩、无典型卷发状。
1.3.3.2 革兰染色、镜检⑴革兰染色以接种环沾取无菌水于洁净的载玻片上，取胰酪大豆胨琼脂平板上的菌落，制成均匀涂片，自然或微温晾干，再通过火焰2～3次干燥固定。
滴加结晶紫染液，染色1分钟，水洗。
滴加碘液，媒染1分钟，水洗，用滤纸吸干余水。
滴加95%乙醇，脱色20～30秒，至流出液无色，水洗。
滴加沙黄染液，复染1分钟，待干后，镜检。
⑵镜检结果：革兰阳性芽孢杆菌芽孢为椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。
5.3.4 白色念珠菌的确认5.3.4.1 菌落形态⑴取白色念珠菌新鲜培养物至沙氏葡萄糖液体培养基中，经35℃培养24～48小时后，液体呈浑浊生长。
⑵取上述培养物划线接种于沙氏葡萄糖琼脂平板上，经35℃培养24～48小时（必要时延长至72小时）观察结果。
⑶菌落呈乳白色偶见淡黄色，表面光滑有浓酵母气味，培养时间稍久则菌落增大，颜色变深、质地变硬或有皱褶。
⑷取沙氏葡萄糖琼脂平板上的培养物接种至念珠菌显色培养基平板上，经35℃培养24～48小时（必要时延长至72小时）观察结果。
⑸平板上为绿色或翠绿色的菌落。
5.3.4.2 革兰染色、镜检取念珠菌显色培养基平板上的培养物进行革兰染色，镜检。
⑴革兰染色以接种环沾取无菌水于洁净的载玻片上，取念珠菌显色培养基平板上的菌落，制成均匀涂片，自然或微温晾干，再通过火焰2～3次干燥固定。
滴加结晶紫染液，染色1分钟，水洗。
滴加碘液，媒染1分钟，水洗，用滤纸吸干余水。
滴加95%乙醇，脱色20～30秒，至流出液无色，水洗。
滴加沙黄染液，复染1分钟，待干后，镜检。
⑵镜检结果：革兰阳性芽孢杆菌芽孢为厚膜孢子、菌丝、芽管。
5.3.5 黑曲霉菌的确认5.3.5.1 镜检：可见孢子，菌丝。
5.3.6 铜绿假单胞菌的确认5.3.6.1 菌落形态⑴取铜绿假单胞菌新鲜培养物至胰酪大豆胨液体培养基中，经35℃培养18～24小时后，液面可形成菌膜，细菌在深层发育不良，呈微浑浊或透明状，菌液上层为蓝绿色。
⑵取上述培养物划线接种于溴化十六烷基三甲铵琼脂平板上，培养18～24小时观察结果。
⑶菌落形态呈扁平、无定形、周边扩散、表面湿润，灰白色，周围时有蓝绿色素扩散。
5.3.6.2革兰染色、镜检⑴革兰染色以玻璃棒沾取无菌水于洁净的载玻片上，取溴化十六烷基三甲铵琼脂平板上的菌落，制成均匀涂片，自然或微温晾干，再通过火焰2～3次干燥固定。
滴加结晶紫染液，染色1分钟，水洗。
滴加碘液，媒染1分钟，水洗，用滤纸吸干余水。
滴加95%乙醇，脱色20～30秒，至流出液无色，水洗。
滴加沙黄染液，复染1分钟，待干后，镜检。
染色结果：革兰阳性菌呈蓝紫色；革兰阴性菌呈红色。
⑵镜检结果：为革兰阴性、无芽孢杆菌。
单个、成对或短链状排列。
5.3.6.3 生化试验用无菌玻璃棒轻轻接触单个典型菌落表面中心，沾取培养物，接种至胰酪大豆胨琼脂斜面上，培养18～24小时，⑴氧化酶试验将洁净滤纸片置于平皿内，用无菌玻璃棒沾取上述斜面上生长的菌落涂于滤纸片上，滴加新配置的1%二盐酸二甲基对苯二胺试液。
（在30秒内若培养物呈粉红色并逐渐变为紫红色为阳性，否则为阴性。
）注：1. 验菌落（苔）必须新鲜，陈旧培养物反应结果不可靠2. 实验宜采用玻璃棒或木棒挑取菌（苔），避免与铁、镍等金属接触，不可用普通接种针（环），否则易出现假阳性。
可以用白金材料。
3. 试剂宜新鲜配制放置过久二盐酸二甲基对苯二胺氧化变色不可用。
4. 反应需在有氧条件下就行，勿滴加试剂过多，以免浸泡培养物使之与空气隔绝，呈假阴性反应。
⑵绿脓菌素试验取TSA斜面培养物接种于绿脓菌素测定琼脂用培养基，培养24小时，观察斜面有无色素。
有色素，在试管内加三氯甲烷3～5ml，以无菌玻璃棒搅碎培养基并充分振摇，。
使培养物中的色素完全萃取在三氯甲烷内。
静止片刻，待三氯甲烷分层，用无菌吸管将三氯甲烷移至另一试管中，加入盐酸试液（1mol∕L）约1ml，振摇后静置片刻。
（若在盐酸层出现粉红色为阳性，无粉红色为阴性。
）试验可用未接种的绿脓菌素测定用琼脂培养基斜面作为阴性对照。
若培养基斜面无色素产生，于室温培养1～2天，再按上法试验，凡经再次检验，绿脓菌素试验仍为阴性应继续做一下试验。
⑶硝酸盐还原产气试验取TSA上的培养物，接种于硝酸盐胨水培养基中，置35℃培养24小时。