酶的固定化技术、现状及发展趋势

酶的固定化技术、现状及发展趋势

酶的固定化

固定化酶是20世纪60年代开始发展起来的一项新技术最初主要是将水溶性酶与不溶性载体结合起来,成为不溶于水的酶的衍生物, 所以曾称为“水不溶酶”和“固相酶”但后来发现也可以将酶包埋在凝胶内或置于超滤装置中, 高分子底物与酶在超滤膜一边, 而反应产物可以透过膜逸出, 在这种情况下, 酶本身仍是可溶的因此, 用水不溶酶和固相酶的名称就不恰当了在年第一届国际酶工程会议上, 正式建议采用“固定化酶”的名称。所谓的固定化酶，是指在一定的空间范围内起催化作用的，并能反复和连续使用的酶。固化酶的出现，解决了酶在工程化应用中存在的问题。极大地提高了酶的应用价值。

酶的本质是蛋白质，酶的固定化实质是具有催化活性的蛋白质的固定。没的催化活性主要依靠他的特殊的高级结构——活性中心。当高级结构或活性中心发生变化时，酶的催化活性便下降，底物的特异性也可能发生变化，因此制备固定化酶时必须严格操作条件，尽可能避免酶的高级结构受到损害。

酶的固定化方法很多，主要分

为四类：即吸附法、包埋法、共价

结合法、交联法等。吸附法和共价

结合法又可称为载体结合法。

1、包埋法：

包埋固定化法是把酶定位于聚合物材料的格子结构或微胶囊结构中这样可以防止酶蛋白释放, 但是底物仍能渗人格子内与酶相接触此法较为简便, 酶分子仅仅是被包埋起来, 生物活性破坏少,

但此法对大分子底物不适用

（1）凝胶包埋。凝胶包埋法是将酶包埋在交联的水不溶性凝胶的空隙中的方法交联聚丙烯酞胺凝胶包埋法是首先被采用的包埋技术。用此法固定了胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、β一淀粉酶用此方法后来又固定了过氧化氢酶、胰凝乳蛋白酶、β一葡萄糖苷酶，近年又有人使用天然材料如藻酸盐和卡拉胶进行包埋。

（2）微胶囊包埋将酶包埋于半透性聚合体膜内, 形成直径为1~100μm的微囊这种固定化酶是以物理方法包埋在膜内的, 只要底物和产物分子大小能够通过半透膜, 底物和产物分子就能

够以自由扩散的方式通过膜。

2、吸附法：

吸附法吸附固定是最简单的方法, 酶与载体之间的亲和力是范德华力、离子键和氢键此方法又可分为物理吸附法和离子吸附法

（1）物理吸附法,使用对蛋白质具有高度吸附能力的非水溶性载体, 如活性碳、几丁质、多孔玻璃等作为吸附剂, 将酶吸附到表面上使酶固定化这种方法操作简单, 反应条件温和, 载体

可反复使用, 但结合不牢固, 酶易脱落。

（2） 离子吸附法,利用酶蛋白在解离状态下可用电荷引力而固着于带有与酶蛋白电荷相异的离

子交换剂(水不溶性载体)上的固定化方法此法操作简单, 固定较为牢固, 在工业上用途颇广常用的载体有阴离子交换剂.

3、 共价法：

酶蛋白分子上的官能团和固相支持物表面上的反应基团之间形成共价键连接的方法其优点是酶与载体之间的连接很牢固, 稳定性好, 但反应条件激烈, 操作复杂, 控制条件苛刻目前, 已建立的方法包括.

(1) 重氮法,这是共价键法中使用最多的一种如下式所示, 将具有氨基的不溶性载体, 以稀盐酸和亚

硝酸钠处理成为重氮化物, 再与酶分子偶联酶蛋白中的游离氨基, 组氨酸中的咪哇基, 酪氨酸中的酚基, 可与其结合。

2[[]R NH R N N Cl -+→-→-≡酶]R-N=N-[酶]

（3） 肤键法， 此法是将有功能基团的载体与酶蛋白中赖氨酸的ε一氨基或N 末端的a 一氨基作用

形成肤键成为固定化酶。

（4） 烷基化法和芳基化法， 以卤素为功能基团的载体与酶蛋白的氨基或琉基发生烷基化或芳基

化反应,形成固定化酶。

4、 交联法：

使酶与带两个以上的多官能团试剂进行交联反应,生成不溶于水的二维交联聚集体, 交联形成的固定化酶称为交联酶与共价结合法一样, 都是靠化学结合的方法使酶固定化其区别在于交联法使用了交联剂常用的交联剂有戊二醛、蹂酸，单用戊二醛交联得到固定化酶的方法很少单独使用将此法与吸附法或包埋法联合使用可以达到良好的加固效果，例如先用几丁质吸附, 再用戊二醛交联等。

固定化方法的选择与比较

虽然发展了许多固定化技术, 并用于多种酶, 但现在还没有一种能适合所有应用和所有酶的全能方法因为各种酶的化学特性和组成差别很大, 底物和产物性质不同, 产物的用途也不一样因此, 对固定化酶的每一种应用来说, 必须找到既简便又廉价的方法, 并且要在给出产品的同时很好地保留酶活性, 还要有高的工作稳定性。

从载体材料特性和使用各种方法所获得的大量资料, 可归纳出选用固定化方法的一般依据, 并可作为某些特殊情况下的使用原则, 但并不能保证一定会成功因此, 必须通过多种方法的比较试验才能找出适合的方法

各种固定化方法的比较

固定化酶的性质

酶固定化后所引起的酶性质的改变, 一般认为其原因可能有两种一是使酶本身变化二是受固定化载体的物理或化学性质的影响所谓酶本身的变化, 主要是由于活性中心的氨基酸残基、高级结构和电荷状态等发生了变化载体影响, 则主要体现在固定化酶的周围, 形成了能对底物产生影响的扩散层, 以及静电的相互作用等引起的。

（1）温度酶被固定化以后, 其最适温度比天然酶高一些, 一般因酶而异, 大致提高5~15℃范围。（2）稳定性酶经固定后, 稳定性都有所增加, 稳定性的提高包括对各种试剂的稳定性、对蛋白酶的稳定性、热稳定性的存及操作稳定性等

（3）pH值酶和细胞经固定化后, 其最适pH及pH活性曲线有时发生变化, 有时则不发生变化据报道, 最适pH的变化是由载体的静电荷决定的,用聚合阳离子作载体, 其最适pH比固定化前向酸性一侧偏移1个pH单位，这可解释为当酶被结合到聚合阳离子载体上时, 酶蛋白的阳离子数增多, 从而造成固定化酶反应区域pH值比外部溶液偏碱这样, 实际上酶的反应是在反应液的pH偏碱的一侧进行的, 从而使最适pH值转移到了酸性一侧, 若用聚合阴离子作载体, 则与上述情况相反, 最适pH值移向碱性一侧。

酶的固定化应用现状及发展趋势

1、在工业上的应用

（1）高糖果浆的生产：利用含葡萄糖异构酶的固定化酶生产高果糖浆是固定化酶在工业应用方面规模最大的一项早期工业生产果葡糖浆是采用游离的葡萄糖异构酶或含有此酶的微生物菌体分批进行的, 近年来,比蔗糖更便宜的果葡糖浆的需求量日渐增大, 因此很多国家都进行了旨在以大量和廉价生产果葡糖浆为目的的固定化葡萄糖异构酶的应用研究, 并成功地实现了工业生产

(2)L-氨基酸、有机酸的生产L—天门冬氨酸是最早用固定化酶在工业上大规模生产的氨基酸所用

的固定化方法有聚丙烯酞胺凝胶法、琼脂凝胶包埋法、明胶戊二醛包埋法和卡拉胶包埋法随后, 又发展起利用固定化细胞生产L一丙氨酸。目前, 可以利用固定化酶和细胞生产的氨基酸和有机酸还有L一谷氨酸、L一异亮氨酸、L一瓜氨酸、L一赖氨酸、L一色氨酸、L一精氨酸、乳酸、醋酸、柠檬酸、葡萄糖酸等。

2、医学方面的应用

现在人们已将酶作为药物广泛地在医疗上加以应用, 发展成为酶疗法但用于治疗目的的酶, 本身是一种蛋白质, 进人少、体后, 会产生抗体, 由于抗体反应, 能引起患者的过敏性休克此外, 作为药物使用的酶, 一般活力比较低, 酶本身也不太稳定, 易被蛋白酶水解, 失去治疗作用如果将酶制成微小的胶囊型固定化酶再注人人体, 则可以增加稳定性, 并且避免与体液接触而产生抗体。例如, 一天门冬酸胺酶具有治疗白血病的作用, 但天然L一天门冬酸胺酶进人人体会产生抗体, 使病人出现休克因此, 需将其微囊化或用可溶性高分子如梭甲基壳聚糖对其进行修饰以降低其毒副作用, 这种修饰实际上与固定化在化学本质上是一样的。微小胶囊还适于包埋多酶系统, 因而可用于代谢异常症的治疗泣叉或制造少、工器官如人工肾脏以代替血液透析等。需要说明的是, 用于体内治疗的固定化载体或胶囊都应具有良好的生物相容性或是可以生物降解的,以避免长期存留对人体带来的不良影响

3、环境保护方面的应用