脂质体转染操作步骤

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转染详细步骤大攻略

转染详细步骤大攻略范例----真核重组表达质粒pDsRed-N1-NS1在A549细胞中表达按上海索莱宝生物科技有限公司去内毒素质粒小提试剂盒说明书方法进行质粒抽提，测得质粒浓度为410.32ng/µl。

将培养的A549细胞铺板，待细胞密度长到90%左右时，按lipo2000说明书转染A549细胞，36h后于荧光显微镜下观察DsRed-NS1融合蛋白的表达情况。

具体操作步骤如下：1）质粒准备按上海索莱宝生物科技有限公司去内毒素质粒小提试剂盒说明书方法进行质粒抽提，具体步骤如下：(1) 取1-5ml细菌培养物，12000rpm离心1 min,尽量吸除上清（菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中）。

(2) 向留有菌体沉淀的离心管中加入200µl溶液P1（请先检查是否已加入RNaseA）,使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。

（注：如果菌块未彻底混匀，会影响裂解导致质粒提取量和纯度偏低）(3)向离心管中加入200µl溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。

（注：混匀一定要温和，以免污染基因组DNA，此时菌液应变得清亮粘稠，所用时间不应超过5min，以免质粒受到破坏）(4)向离心管中加入250µl溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时会出现白色絮状沉淀。

12000rpm 离心10min，用移液器小心地将上清转移到另一个干净的离心管中，尽量不要吸出沉淀。

（注：溶液P3加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。

如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清）(5)加入1/5体积冰预冷的去内毒素清除剂，振荡混匀，溶液变浑浊，冰浴2min 至溶液变清亮。

(6)37℃水浴5 min，不时振荡，溶液又变浑浊。

12000rpm室温离心5min，溶液应分为两相，上层水相含质粒DNA，下层油状相含内毒素。

(7)将质粒DNA上层水相转移至新管，弃下层油状相，注意不要吸入油状相，重复抽提三次，即重复步骤5-7三次。

脂质体转染mrna细胞原理

脂质体转染mrna细胞原理
脂质体转染mRNA细胞的原理是利用脂质体作为载体，将目的mRNA包裹在其内部，然后通过与细胞膜融合让mRNA进入细胞质，最终达到将目的mRNA表达出来的目的。

脂质体是由磷脂和胆固醇等组成的微小囊泡结构，与细胞膜结构相似。

其内部的疏水层可以容纳水溶性的物质，包括mRNA分子。

脂质体转染mRNA的步骤如下：
1. 准备目的mRNA：目的mRNA是指需要转染到细胞内进行表达的mRNA，可以是外源的mRNA，也可以是经过In vitro 转录合成的人工合成mRNA。

这些mRNA一般会在实验室中事先准备好。

2. 制备脂质体：将脂质体粉末或液体悬浮液溶解在适当的缓冲液中，形成脂质体溶液。

脂质体通过磷脂的双层结构来包裹mRNA，形成稳定的脂质体-mRNA复合物。

3. 混合脂质体与mRNA：将目的mRNA与脂质体溶液混合，并进行充分的混合和搅拌。

这样就可以使mRNA和脂质体发生相互作用，形成脂质体-mRNA复合物。

4. 转染细胞：将脂质体-mRNA复合物加入到需要转染的细胞培养液中，使其与细胞接触。

脂质体复合物会与细胞膜融合，从而使脂质体内的mRNA进入细胞质。

5. mRAN转录和表达：在细胞质中，脂质体释放的mRNA会
被细胞的核糖体识别，进而进行mRNA转录和翻译，最终使
该mRNA编码的蛋白质在细胞内得到表达。

脂质体作为转染载体具有一定的优势，如制备简单、生物相容性好等。

但是，脂质体转染也存在一些问题，如转染效率较低、引起细胞毒性等。

因此，在实际应用中需对转染条件进行优化，以提高转染效率和减少毒性。

脂质体转染实验原理与操作步骤总(精)

脂质体转染的实验原理与操作步骤大全日期:2012-06-25 来源:互联网作者:青岚点击:3644次摘要:细胞转染的方法主要包括:电穿孔法、显微注射、基因枪、磷酸钙共沉淀法、脂质体转染法、多种阳离子物质介导、病毒介导的转染等, 理想的细胞转染方法是具有高转染效率、对细胞的毒性作用小等, 本文主要介绍细胞转染常用的方法 -脂质体转染的原理和操作步骤等。

找产品,上生物帮 >> >>细胞转染的方法主要包括:电穿孔法、显微注射、基因枪、磷酸钙共沉淀法、脂质体转染法、多种阳离子物质介导、病毒介导的转染等, 理想的细胞转染方法是具有高转染效率、对细胞的毒性作用小等,本文主要介绍细胞转染常用的方法 -脂质体转染的原理和操作步骤等。

脂质体 (lipofectin regeant, LR 试剂是阳离子脂质体 N-[1-2, 3-Dioleyoxy , Propyl]-n, n , n-Trimethylammonium Chloride(DOTMA和 Dioleoyl photidye-thanolamine(DOPE的混合物 [1:1(w/w]。

它适用于把 DNA 转染入悬浮或贴壁培养细胞中 ,是目前条件下最方便的转染方法之一。

转染率高,优于磷酸钙法,比它高5~100倍,能把 DNA 和 RNA 转染到各种细胞。

用 LR 进行转染时, 首先需优化转染条件, 应找出该批 LR 对转染某一特定细胞适合的用量、作用时间等,对每批 LR 都要做:第一,先要固定一个 DNA 的量和DNA/LR混合物与细胞相互作用的时间, DNA 可从1~5μg和孵育时间 6小时开始,按这两个参数绘出相应 LR 需用量的曲线,再选用 LR 和 DNA 两者最佳的剂量,确定出转染时间 (2~24小时。

因 LR 对细胞有一定的毒性,转染时间以不超过 24小时为宜。

细胞种类:COS-7、 BHK 、 NIH3T3、 Hela 和 Jurkat 等任何一种细胞均可作为受体细胞。

脂质体转染原理及操作步骤

脂质体转染原理及操作步骤脂质体转染是一种常用的基因传递技术，用于将外源的核酸（例如DNA、RNA）转入细胞内。

脂质体是由人工合成的类似于细胞膜的双层脂质膜组成，具有较好的生物相容性和可降解性，因此可以用来包裹并传递外源核酸进入目标细胞内。

本文将详细介绍脂质体转染的原理和操作步骤。

脂质体由两个疏水性脂质尾部和一个亲水性脂质头部组成，形成类似生物细胞膜的双层结构。

这种双层结构使得脂质体可以包裹水溶性的外源核酸，并形成脂质体-核酸复合物。

当复合物与细胞膜接触时，由于脂质体的类似性，这些复合物可以与细胞膜融合，并释放外源核酸进入细胞。

然而，简单地将脂质体-核酸复合物添加到细胞培养基中并不能有效地将外源核酸转入细胞内。

为了提高转染效率，常常需要使用电穿孔或钙磷共沉淀等方法，以增加细胞膜的通透性。

操作步骤：1.准备工作：-完整的脂质体转染试剂盒。

-DNA或RNA溶液。

-靶细胞。

-无菌操作条件下的实验室。

2.重组脂质体的合成：-按照试剂盒说明将脂质体复合物合成。

-使用无菌的工具和试剂。

3.核酸引物的制备：-将外源DNA或RNA与引物混合，使其形成核酸复合物。

4.细胞处理：-将培养皿中的细胞进行冲洗，去除培养基。

-将适量的细胞培养基添加到培养皿中，以保证细胞的正常生长。

5.导入核酸：-将所制备的核酸复合物滴加到细胞培养基中。

-将细胞培养皿置于无菌环境中，以便细胞吸收和利用核酸。

6.细胞培养：-按照细胞类型和所使用的培养基，将细胞置于恰当的培养条件下，并进行培养。

-根据需求添加所需要的生长因子和抗生素。

7.观察和分析：-在一定的培养时间后，观察细胞是否发生了显著的变化。

- 使用适当的实验方法（如PCR、Western blot等）检测外源基因的表达。

-观察并记录实验结果。

以上是脂质体转染的原理和操作步骤。

脂质体转染是目前常用的基因传递技术之一，可以用于研究基因功能、疾病治疗等领域。

随着技术的不断发展，转染效率和特异性将逐渐提高，为研究和治疗带来更多的机会和挑战。

Hieff TransTM脂质体核酸转染试剂说明书

Hieff Trans TM脂质体核酸转染试剂说明书产品描述Hieff Trans TM脂质体核酸转染试剂是一种多用途的脂质体转染试剂，适用于DNA、RNA 和寡核苷酸的转染，对大多数真核细胞具有很高的转染效率。

其独特的配方使其可直接加入培养基中，血清的存在不会影响转染效率，这样可以减少去除血清对细胞的损伤。

转染后不需要除去核酸-Hieff Trans TM复合物或更换新鲜培养基，也可在4～6小时后除去。

Hieff Trans TM以无菌的液体形式提供。

通常情况下对于 24 孔板转染，每次用1.5μl左右，则1ml Hieff Trans TM约可做660次转染；对于6孔板，每次用6μl左右，则1ml Hieff Trans TM约可做160 次转染；运输与保存方法冰袋（wet ice）运输。

产品4ºC保存，一年有效。

不可冷冻！注意事项1）Hieff Trans TM脂质体核酸转染试剂要求细胞铺板密度较高，以90%-95%为佳，这有助于减少阳离子脂质体细胞毒性造成的影响；如果你研究的基因要求比较长的表达时间，比如细胞周期相关基因，或者细胞表面蛋白，最好选择细胞铺板密度要求较低的转染试剂，不适合用脂质体核酸转染试剂。

2）Hieff Trans TM脂质体核酸转染试剂可用于有血清培养基的转染，并且转染前后不需要换培养基。

但是，制备转染复合物时要求用无血清培养基稀释DNA和转染试剂，因为血清会影响复合物的形成。

另外，要检测所用的无血清培养基与脂质体核酸转染试剂的相容性，已知CD293, SFMII, VP-SFM 就不相容。

3）转染的时候培养基中不能添加抗生素。

4）使用高纯度的DNA或RNA有助于获得较高的转染效率，质粒中的内毒素是转染的大敌。

5）阳离子脂质体应该在4度保存，要注意避免多次反复长时间开盖，因为可能会导致脂质体氧化而影响转染效率。

6）初次使用应优化DNA浓度和阳离子脂质体试剂量以得到最大的转染效率。

贴壁细胞的脂质体转染

一、实验材料1、宿主细胞CHO（贴壁细胞）2、脂质体LIPOFECTAMINE 2000（invitrogen公司）3、6孔细胞培养版4、无血清培养基OPTI-MEM（GIBICO）5、转染级质粒二、实验步骤invitrogen的LIPOFECTAMINE 2000说明书上列举了24孔、12孔、6孔……板的实验体系，因为需要转染的细胞量大，所以一直采用的是6孔版做的转染。

以下是以6孔板为例说明一下我的体系和方法吧！1、转染前一天，以合适的细胞密度接种到6孔培养板上。

（我的接种密度是3~4*105/ml.）转染时，细胞要达到90~95%的融合。

2、溶液1：240ul 无血清培养基 + 10 ul lipofectamine 2000 per well （总体积250 ul）（温育5min）3、溶液2：X ul 无血清培养基 + 4 ug 质粒 per well（总体积250 ul）4、将溶液1与溶液2混合，室温下置20min。

5、与此同时，将6孔板中的细胞用无血清培养基冲洗细胞两遍后，加入2ml 无血清培养基。

6、将溶液1与溶液2的混合液逐滴加入孔中，摇动培养板，轻轻混匀。

在37℃，5％的CO2中保温5~6小时。

7、6小时后，更换含有血清的全培养基，在37℃，5％的CO2中48~72h检测转染水平。

8、如果做稳定转染，换全培养基培养后24h，即可以1：10或更高的稀释比例（根据细胞的生长情况）接种到新的培养基。

三、个人经验：我觉得贴壁细胞的脂质体转染还是很容易的，有了经验之后，现在做转染得心应手，转染前后细胞的形态几乎不发生变化，几乎没有细胞死亡。

转染率很高。

以下是个人经验，与大家分享。

1.细胞的状态。

这点非常重要，不要急于求成，一定要让细胞处于最佳的生长状态再做。

有文献说传代不要超过17代。

我总是在细胞复苏后的3代左右做，那时细胞状态最好，不要用传了很多代的细胞去做，细胞的形态都会发生变化了。

2.细胞的融合度。

Invitrogen脂质体2000的操作流程及注意事项

Invitrogen脂质体2000的操作流程及注意事项发布日期：2010-11-13 21:29:08 浏览次数：338Invitrogen脂质体2000的操作流程及注意事项众所周知，Invitrogen脂质体2000是广大老师所熟知的转染试剂，其特点：转染步骤快速简便（1）DNA-阳离子脂质体试剂的复合体可以直接加入到细胞培养基中，有血清也不怕。

（2）转染后不需要除去Lipofectamine 2000试剂，无需换培养基。

我们介绍一下 Invitrogen脂质体2000的操作流程、注意事项等。

一、操作流程事实上Lipofectamine系列产品操作流程都是又快又简单：稀释DNA以及Lipofectamine 2000，混合2种稀释液保温20分钟，加入培养细胞中孵育24－96小时检测结果。

下面是Invitrogen提供的详细流程和注意事项。

1、转染前一天，胰酶消化细胞并计数，细胞铺板，使其在转染日密度为90%。

细胞铺板在0.5ml 含血清，不含抗生素的正常生长的培养基中。

2、对于每孔细胞，使用50μl无血清培养基（如OPTI-MEMⅠ培养基）稀释0.8μg-1.0μg DNA。

3、对于每孔细胞，使用50μl OPTI-MEMⅠ培养基稀释1μl-3μl LIPOFECTAMINE 2000试剂。

Lipofectamine 2000稀释后保温5分钟（在30分钟内同稀释的DNA混合。

保温时间过长会降低活性。

）注意：即使Lipofectamine 2000使用OPTI-MEMⅠ稀释，细胞也可以使用D-MEM培养。

如果D-MEM做为Lipofectamine 2000的稀释液，必须在5分钟内同稀释的DNA混合。

4、混合稀释的DNA（第2步）和稀释的Lipofectamine 2000（第3步）。

在室温保温20分钟。

注意：溶液可能会混浊，但不会影响转染。

复合物可以在室温保持6小时稳定。

5、直接将复合物加入到每孔中，摇动培养板，轻轻混匀。

脂质体转染原理及操作步骤

脂质体转染原理及操作步骤
脂质体转染是一种常用的基因传递方法，通过将目标基因以及负载该基因的脂质体添加到细胞培养物中，使其与细胞膜融合，并将基因导入到细胞内。

脂质体转染的操作步骤如下：
1. 提取脂质体：首先，从脱脂牛奶或其它来源中提取脂质体。

可以通过超声处理、离心等方法将脂质体分离出来。

2. 混合目标基因与脂质体：将目标基因与脂质体混合，目标基因可以是质粒DNA、RNA等。

将基因加入脂质体溶液中，进
行充分混合。

3. 孵育：将脂质体-基因混合物在室温下孵育一段时间，通常
为15-30分钟。

这一步主要是让脂质体与基因充分结合。

4. 加入细胞：将孵育好的脂质体-基因混合物加入需要转染的
细胞培养物中。

细胞种类可以是哺乳动物细胞、脊椎动物细胞、细菌等。

5. 孵育细胞：将细胞培养物保持在适宜的培养条件下，孵育一定时间，让细胞充分吸收脂质体-基因复合物。

6. 收获转染细胞：经过一定时间的孵育后，可从培养物中收获转染细胞。

可以根据实验需要进行后续分析。

需要注意的是，脂质体转染的效率与脂质体组分、浓度、孵育时间、细胞类型等因素密切相关，需要进行参数优化才能达到较高的转染效果。

阳离子脂质体转染操作方法

阳离子脂质体转染操作方法
阳离子脂质体转染是一种常用的基因传递实验技术，可以将核酸载体有效地转染至细胞内。

下面是阳离子脂质体转染的基本操作方法：
1. 细胞培养：选择适合的细胞培养基及条件，将要转染的细胞在培养皿中培养至指定的生长状态，通常是80%～90%的细胞密度。

2. 制备DNA-脂质体复合物：将目标DNA与阳离子脂质体以适当比例混合，制备成DNA-脂质体复合物。

复合物的制备条件可以根据实际情况进行优化，一般来说，将DNA与脂质体按照质量比1:3～1:5混合，在无菌条件下保持15～30分钟使其充分结合。

3. 转染：将DNA-脂质体复合物均匀滴加至细胞培养皿中，注意避免产生气泡，插入培养皿中心。

轻轻摇晃培养皿使其均匀分布，然后将培养皿放回密闭的培养箱中，继续培养。

4. 代谢酶抑制：在培养细胞转染后的前24小时内，添加代谢酶抑制剂（如10 μg/mL的氨基葡萄糖苷或10 mM的2-脱氧-D-葡萄糖）来提高转染效率。

5. 培养：根据需要的实验设计，继续培养细胞，通常在转染后24～72小时进行下一步的实验。

需要注意的是，每个细胞系对阳离子脂质体的适应性不同，因此在实际操作中需要进行不同的试验优化。

同时，与脂质体浓度、DNA浓度、转染时间等因素也需要进行优化。

细胞的脂质体转染法和电穿孔法

细胞的脂质体转染法和电穿孔转染法（一）脂质体转染一、实验试剂及器材Lipofectamine® 3000 Transfection Reagent，质粒DNA(0.5-5 μg/μL储液)，Opti-MEM®减血清培养基，培养板，酒精灯，离心机，微量移液器，离心管等。

二、实验步骤1. 接种细胞至70－90%汇合度时转染；2. 使用Opti-MEM®减血清培养基稀释Lipofectamine® 3000试剂（2管），充分混匀（6孔板Opti-MEM®培养基为125 μL× 2，Lipofectamine® 3000为3.75和7.5 μL）；3. 在每管已稀释的Lipofectamine® 3000试剂中加入稀释的DNA（用P3000TM试剂稀释）（1:1比例）；4. 室温孵育5分钟；5. 加入DNA－脂质体复合物至细胞中；6. 37°C(PK-15在39°C下培养)孵育细胞2–4天，然后分析转染细胞。

三、注意事项1. 在无血清培养基（如Opti-MEM®减血清培养基）中制备DNA－Lipofectamine® 3000脂质体复合物，直接将其加入含细胞培养基的细胞中（在血清／抗生素存在或不存在时均可）；2. 转染后无需去除转染复合物或者更换／添加培养基；3. Lipofectamine® 3000试剂用量各有不同，测试推荐的两种浓度的Lipofectamine® 3000试剂，以确定最佳用量，开始新的转染；4. Lipofectamine® 3000试剂应放在4℃储存（切勿冷冻）。

附上Lipofectamine 3000 REagent Protocol：（二）电穿孔转染法一、实验试剂及器材BTX ECM2001®2001细胞电融合仪，细胞，胰蛋白酶，电转液，DMEM，培养板，离心机等。

LIPOFECTAMINE2000转染试剂转染步骤

LIPOFECTAMINE2000转染试剂转染步骤转染是一种将外源DNA或RNA导入到细胞内的技术，以研究基因功能、蛋白质表达、细胞信号转导等方面的问题。

LIPOFECTAMINE2000是一种常用的转染试剂，广泛应用于多种细胞系中。

以下是LIPOFECTAMINE2000转染试剂转染步骤的详细介绍。

一、细胞种植与处理准备1.1细胞传代：将细胞进行传代，以保证其在良好的状态下进行实验。

1.2细胞密度调整：将细胞于适宜培养皿中培养至60-80%的密度，以保证细胞的适宜转染。

1.3细胞处理准备：在转染前，将细胞用无酶EDTA或胰酶剥离并重新悬浮在适宜的培养基中，以保持细胞的完整性和适宜的状态。

二、试剂配制2.1DNA或RNA的制备：将外源DNA或RNA在无菌条件下制备，并使用纯化试剂进行纯化和浓缩。

2.2转染试剂配制：将冻干的LIPOFECTAMINE2000转染试剂通过加入合适的无菌水，稀释成适宜浓度的转染试剂。

三、转染操作3.1转染试剂与DNA/RNA的混合：将适量的LIPOFECTAMINE2000转染试剂与DNA或RNA混合在无菌的管中，轻轻混合均匀。

注意，避免过量试剂和核酸的使用，以减少细胞的毒性和副作用。

3.2孵育混合物：将混合物在常温条件下孵育15-30分钟，以促使脂质体与核酸形成稳定的复合体。

四、转染过程4.1转染试剂与细胞的混合：将混合物缓慢滴加到处理好的细胞培养基上，缓慢摇晃培养皿以使混合物均匀分布。

4.2转染时间及培养条件：将细胞放置在转染液中，保持静止状态，同时将培养皿放回培养箱中，在37℃、5%CO2的恒温恒湿条件下进行转染。

转染时间需要根据细胞系和转染试剂的要求进行优化，一般为4-6小时。

4.3转染液的去除：将转染液小心去除，并将细胞用含有适宜抗生素或筛选剂的培养基洗涤一次，以去除残留的转染试剂。

五、细胞处理及分析5.1细胞培养：将细胞放回恒温恒湿培养箱中，用适宜培养基进行细胞的培养。

质粒扩增、提取、转化和转染等操作程序

一般普通质粒扩增：先将质粒转化到DH5α等大肠杆菌中，通过扩大培养获取大量含有质粒的大肠杆菌。

大肠杆菌的培养需要用到LB液体培养基，配方见下文。

根据质粒带有的抗生素抗性基因，还需要在LB中加入适量相应抗生素，如氨苄青霉素、卡那霉素等。

LB 液体培养基(Luria-Bertani) ：称取蛋白胨(Tryptone)10 g，酵母提取物(Yeast extract) 5 g，NaCl 10 g，溶于800ml 去离子水中，用NaOH 调pH至7.5, 加去离子水至总体积1 升,高压下蒸气灭菌20 分钟。

质粒提取目前一般都有商业化生成的试剂盒销售，可按照相应试剂盒的说明书操作。

转化：①取出感受态细胞（也有商品化感受态销售），冰浴10分钟。

②取连接产物10μl 放入感受态细胞中（100μl/管），轻轻旋转以混匀内容物，冰浴30分钟。

③42℃热休克120 秒（按照需要加长或减少时间），不能摇动Ep管。

冰浴5 分钟，然后转移到事先预热至37℃的无抗生素的普通LB培养基800ul，50~100rpm 37℃恒温振荡 1 小时30 分钟。

④用无菌弯头玻棒铺菌器将150ul 菌液铺于含有抗生素的LA平板。

⑤铺菌的LA 平板于37℃正放2~3 小时，然后倒置培养16-24 小时。

⑥将疑似阳性克隆的白斑选出，接到新的含有抗生素的LB中培养14小时左右，做菌液PCR或抽提质粒酶切以进一步鉴定转化是否成功。

转染：①将3μl（约4μg）纯化好的经除菌的质粒DNA溶入250μl 无血清培养基DMEM (无双抗) 中，轻轻混匀，室温放置5 mim。

②再吸取10 μl 脂质体溶入250 μl 无血清培养基DMEM（无双抗）中，轻轻混匀，室温放置5 mim。

③将制备好的DNA 与脂质体轻轻混合均匀，室温放置20 mim。

然后加入1.5 ml 无血清培养基DMEM（无双抗）中，轻轻混匀，即为包裹好的脂质体/DNA。

④将包裹好的脂质体/DNA小心滴加至备用细胞表面，37℃，5% CO2，饱和湿度中孵育10小时。

lipo2000转染操作步骤

.Lipo2000 瞬时转染细胞步骤RNAi or siRNA Transfection Stealth?1 24孔板为例，其余规格的转染见表以适宜30-50%。

1 中板，细胞密度为如果转染后需要长时间注意：根据转染后细胞检测时间长短决定细胞中板密度，后检测，则细胞中板密度适当降低，已避免细胞过度生长导致存活降低。

24-36小时后）每个孔转染方式如下：2 第二天（无血清培养基中。

溶于A 将20pmol siRNA50ul Opti-mem 。

B 将1ul lipo2000溶于50ul Opti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min 两管混合，放置C 将A B20min。

加管mix3 转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。

将C 孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。

入24Plasmid DNA TransfectionDNA(ug):lipo 2000(ul)=1:2-3转染时细胞密度越高，转染效率，表达效率也越高，并且可以降低细胞毒性。

1 中板。

70-80%5 时转染 cells/well贴壁细胞：0.5-2X10，第二天待细胞密度达到 5 ，中板后随即转染。

4-8X10cells/well悬浮细胞：2 转染。

A 将0.8ug DNA溶于50ul Opti-mem无血清培养基中。

B 将2ul lipo2000溶于50ul Opti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。

C 将A B两管混合，放置20min。

转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。

将C管mix加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。

1 / 3.：中板密度根据不同细胞不同实验有所不同，这里仅提的数据仅供参考* 足以。

6孔板细胞质粒转染量1-2ug**：足以。

6cm dish细胞质粒转染量4-6ug***：和碳酸氢钠进行缓HEPES 其中使用了减血清培养基是EMEM 的改良型,Opti-MEM? I常用其作为无.谷氨酰胺、痕量元素和生长因子并添加次黄嘌呤、胸苷、丙酮酸钠、冲,L-lip2000分别混合。

lip2000转染说明书

4. 哺乳动物细胞siRNA转染4.1 转染方法：将制备好的siRNA、siRNA表达载体或表达框架转导至真核细胞中的方法主要有以下几种：磷酸钙共沉淀；电穿孔法；DEAE-葡聚糖和polybrene；机械法；阳离子脂质体试剂。

目前用的最多的是阳离子脂质体法。

4.1.1 磷酸钙共沉淀将氯化钙，RNA(或DNA)和磷酸缓冲液混合，沉淀形成包含DNA且极小的不溶的磷酸钙颗粒。

磷酸钙-DNA复合物粘附到细胞膜并通过胞饮进入目的细胞的细胞质。

沉淀物的大小和质量对于磷酸钙转染的成功至关重要。

在实验中使用的每种试剂都必须小心校准，保证质量，因为甚至偏离最优条件十分之一个pH都会导致磷酸钙转染的失败。

4.1.2 电穿孔法电穿孔通过将细胞暴露在短暂的高场强电脉冲中转导分子。

将细胞悬浮液置于电场中会诱导沿细胞膜的电压差异，据认为这种电压差异会导致细胞膜暂时穿孔。

电脉冲和场强的优化对于成功的转染非常重要，因为过高的场强和过长的电脉冲时间会不可逆地伤害细胞膜而裂解细胞。

一般，成功的电穿孔过程都伴随高水平（50%或更高）的毒性。

4.1.3 DEAE-葡聚糖和polybrene带正电的DEAE-葡聚糖或polybrene多聚体复合物和带负电的DNA分子使得DNA 可以结合在细胞表面。

通过使用DMSO或甘油获得的渗透休克将DNA复合体导入。

两种试剂都已成功用于转染。

DEAE-葡聚糖仅限于瞬时转染。

4.1.4 机械法转染技术也包括使用机械的方法，比如显微注射和基因枪（biolistic particle）。

显微注射使用一根细针头将DNA，RNA或蛋白直接转入细胞质或细胞核。

基因枪使用高压microprojectile将大分子导入细胞。

4.1.5 阳离子脂质体试剂在优化条件下将阳离子脂质体试剂加入水中时，其可以形成微小的（平均大小约100-400nm）单层脂质体。

这些脂质体带正电，可以靠静电作用结合到DNA的磷酸骨架上以及带负电的细胞膜表面。

聚凝胺法实验报告

一、实验目的本实验旨在探究聚凝胺法在哺乳动物细胞DNA转染中的应用效果，通过比较聚凝胺法与常规脂质体转染法的转染效率，评估聚凝胺法在基因转染实验中的可行性。

二、实验材料1. 细胞：人胚胎肾细胞（HEK293）2. DNA：目的基因质粒3. 聚凝胺：10mg/ml溶液4. 脂质体转染试剂5. 其他试剂：DMEM培养基、胎牛血清、青霉素、链霉素、磷酸盐缓冲盐溶液（PBS）、无血清培养基等三、实验方法1. 细胞培养：将HEK293细胞接种于6孔板，置于37℃、5%CO2培养箱中培养至细胞密度约为80%。

2. 聚凝胺法转染：（1）取适量目的基因质粒，用无血清培养基稀释至终浓度为1μg/μl；（2）将聚凝胺溶液用无血清培养基稀释至终浓度为5g/ml；（3）将稀释后的质粒与聚凝胺溶液混合，室温孵育15分钟；（4）将混合溶液加入细胞培养孔中，轻轻摇晃混匀，37℃、5%CO2培养箱中孵育6小时；（5）吸去培养孔中的溶液，用含10%胎牛血清的DMEM培养基清洗细胞2次；（6）继续培养细胞24小时后，进行后续实验。

3. 脂质体转染法：按照脂质体转染试剂说明书进行操作，具体步骤如下：（1）取适量目的基因质粒，用无血清培养基稀释至终浓度为1μg/μl；（2）将脂质体溶液用无血清培养基稀释至终浓度为50μg/μl；（3）将稀释后的质粒与脂质体溶液混合，室温孵育15分钟；（4）将混合溶液加入细胞培养孔中，轻轻摇晃混匀，37℃、5%CO2培养箱中孵育6小时；（5）吸去培养孔中的溶液，用含10%胎牛血清的DMEM培养基清洗细胞2次；（6）继续培养细胞24小时后，进行后续实验。

4. 实验分组：（1）对照组：未进行转染的细胞；（2）聚凝胺法转染组；（3）脂质体转染组。

5. 实验指标：（1）细胞活力检测：采用CCK-8法检测细胞活力，比较不同转染方法对细胞活力的影响；（2）荧光素酶报告基因表达检测：通过检测荧光素酶报告基因的表达水平，比较不同转染方法对目的基因转染效率的影响；（3）基因表达检测：采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测目的基因的mRNA表达水平，比较不同转染方法对目的基因转染效率的影响。

Hieff TransTM脂质体核酸转染试剂(亲手整理

Hieff TransTM 脂质体核酸转染试剂产品描述Hieff Trans TM 脂质体核酸转染试剂是一种多用途的脂质体转染试剂，适用于DNA 、RNA 和寡核苷酸的转染，对大多数真核细胞具有很高的转染效率。

其独特的配方使其可直接加入培养基中，血清的存在不会影响转染效率，这样可以减少去除血清对细胞的损伤。

转染后不需要除去核酸-Hieff Trans TM 复合物或更换新鲜培养基，也可在4～6小时后除去。

Hieff Trans TM 以无菌的液体形式提供。

通常情况下对于 24 孔板转染，每次用1.5μl 左右，则1ml Hieff Trans TM 约可做660次转染；对于6孔板，每次用6μl 左右，则1ml Hieff Trans TM 约可做160 次转染；运输与保存方法冰袋（wet ice ）运输。

产品4ºC 保存，一年有效。

不可冷冻！注意事项1）Hieff Trans TM 脂质体核酸转染试剂要求细胞铺板密度较高，以90%-95%为佳，这有助于减少阳离子脂质体细胞毒性造成的影响；如果你研究的基因要求比较长的表达时间，比如细胞周期相关基因，或者细胞表面蛋白，最好选择细胞铺板密度要求较低的转染试剂，不适合用脂质体核酸转染试剂。

2）Hieff Trans TM 脂质体核酸转染试剂可用于有血清培养基的转染，并且转染前后不需要换培养基。

但是，制备转染复合物时要求用无血清培养基稀释DNA 和转染试剂，因为血清会影响复合物的形成。

另外，要检测所用的无血清培养基与脂质体核酸转染试剂的相容性，已知CD293, SFMII, VP-SFM 就不相容。

3）转染的时候培养基中不能添加抗生素。

4）使用高纯度的DNA 或RNA 有助于获得较高的转染效率，质粒中的内毒素是转染的大敌。

5）阳离子脂质体应该在4度保存，要注意避免多次反复长时间开盖，因为可能会导致脂质体氧化而影响转染效率。

6）初次使用应优化DNA 浓度和阳离子脂质体试剂量以得到最大的转染效率。

lipo2000转染方法

lipo2000转染方法Lipo2000转染方法引言：Lipo2000是一种常用的转染试剂，广泛应用于生物医学研究领域。

本文将介绍Lipo2000转染方法的原理、步骤以及其在实验中的应用。

一、原理：Lipo2000转染试剂是一种基于脂质体的转染方法。

其原理是通过脂质体与目标DNA或RNA结合形成复合物，然后将复合物转染至靶细胞中。

脂质体的疏水性结构使其能够与负电荷的核酸结合，从而实现核酸的传递。

二、步骤：1. 准备工作：a. 将Lipo2000转染试剂取出并放置于室温下回温。

b. 根据实验需要，准备好需要转染的靶细胞。

c. 根据转染试剂和靶细胞的要求，选择合适的培养基和培养条件。

2. 转染复合物的制备：a. 将所需的DNA或RNA与Lipo2000转染试剂按照一定的比例混合，轻轻摇晃使其均匀混合。

b. 将混合液静置一段时间，使其形成稳定的脂质体-核酸复合物。

3. 细胞转染：a. 将转染复合物滴加到准备好的细胞培养基中，轻轻摇晃培养皿使其均匀分布。

b. 将培养皿放回培养箱中，按照细胞的培养要求进行后续处理。

4. 细胞培养：a. 根据实验需要，选择合适的培养基和培养条件进行细胞培养。

b. 根据实验设计，进行所需的时间点采样或进一步处理。

三、应用：Lipo2000转染方法在生物医学研究中有着广泛的应用。

以下列举几个常见的应用领域：1. 基因功能研究：通过转染特定基因的siRNA或miRNA，可以实现对基因的特定抑制，从而研究其功能。

2. 蛋白表达调控：通过转染携带特定启动子的DNA或RNA，可以实现对目标蛋白的表达调控。

3. 细胞信号通路研究：通过转染特定信号通路相关基因的DNA或RNA，可以研究该信号通路的调控机制及其在疾病发生发展中的作用。

4. 肿瘤药物筛选：通过转染肿瘤细胞系，可以评估特定药物对肿瘤细胞的抑制效果，为药物筛选提供参考依据。

5. 病毒感染研究：通过转染携带特定病毒基因的DNA或RNA，可以模拟病毒感染过程，研究病毒的传播机制和致病机理。

脂质体转染实验步骤和细胞转染技术总述

脂质体转染实验步骤和细胞转染技术总述
一、脂质体转染实验步骤
1）细胞处理：细胞培养，细胞脱落，细胞悬液浓缩；
2）添加脂质体：将DNA与相应脂质体混合，可以将DNA结合到脂质体上；
3）细胞接种：将脂质体/DNA混合物接种到细胞悬液中，使DNA能够被细胞吞噬；
4）转染放置：将接种混合物保持在室温静置一定的时间，从而使DNA能够被细胞吞噬；
5）细胞活化：在静置期间，DNA会被细胞内吞噬，当添加激活剂和营养培养基时，细胞会活化；
6）细胞培养：在细胞活化后，细胞会被培养，并进行观察，以评估DNA转染的效果；
7）细胞收集：在培养过程中，可以通过浓缩细胞悬液，将转染后的细胞收集起来，以便进行其他分析。

细胞转染是将外源DNA片段转染到细胞中，从而改变其基因表达的技术。

目前常用的细胞转染技术有电转染、磁珠转染、质粒转染、脂质体转染等。

1）电转染
电染是一种最常用的染技术，即通过将DNA片段置于细胞悬液中，然后用微电流刺激，使DNA片段直接进入细胞。

脂质体转染操作步骤

脂质体转染操作步骤
（一）准备材料
1.质粒：一般是由受体细胞胞浆抽提的质粒，其中含有DNA操纵因子、胞质蛋白等；
2.抗体：主要由混合物或单一蛋白质组成，用于鉴定质粒抗原性以及
抑制免疫反应；
3.细胞培养液：一般为包含细胞培养基和生长因子的混合物；
4.转染试剂：也称转染缓冲液，主要由多种物质，如阿拉伯胞浆清酯、卡夫培糖、酚红、多数体核酸等组成，用于载体细胞的传感和质粒的迁移。

（二）脂质体转染操作
1.取出细胞培养液，将受体细胞倒入培养管中，用浓度为0.25%（体
积比）的牛血清添加至8-10%，以细胞膜生长抗性抑制剂（如抗生素或吲
哚美辛）等抑制细胞膜的分裂，加以培养；
2.将培养液中的受体细胞的数量控制在2×105/ml以上，用酚酞红法
检测，检测结果达到要求后，把受体细胞从培养管中放入6 ml的离心管中，进行6000 g的离心；
3.将离心液放入新的容器中，把细胞抽出，再加入细胞稀释缓冲液
（以PBS或缓冲液为主，加入百维素或多数体核酸）至1×106/ml，离心5000 g；
4.将离心液抽出，用转染试剂缓冲液把细胞洗涤，再分别加入DNase I, 抗体和质粒，放入摇床中。