脂质体介导DNA转染法
脂质体转染原理及操作步骤
脂质体转染原理及操作步骤脂质体转染是一种常用的基因传递技术，用于将外源的核酸（例如DNA、RNA）转入细胞内。
脂质体是由人工合成的类似于细胞膜的双层脂质膜组成，具有较好的生物相容性和可降解性，因此可以用来包裹并传递外源核酸进入目标细胞内。
本文将详细介绍脂质体转染的原理和操作步骤。
脂质体由两个疏水性脂质尾部和一个亲水性脂质头部组成，形成类似生物细胞膜的双层结构。
这种双层结构使得脂质体可以包裹水溶性的外源核酸，并形成脂质体-核酸复合物。
当复合物与细胞膜接触时，由于脂质体的类似性，这些复合物可以与细胞膜融合，并释放外源核酸进入细胞。
然而，简单地将脂质体-核酸复合物添加到细胞培养基中并不能有效地将外源核酸转入细胞内。
为了提高转染效率，常常需要使用电穿孔或钙磷共沉淀等方法，以增加细胞膜的通透性。
操作步骤：1.准备工作：-完整的脂质体转染试剂盒。
-DNA或RNA溶液。
-靶细胞。
-无菌操作条件下的实验室。
2.重组脂质体的合成：-按照试剂盒说明将脂质体复合物合成。
-使用无菌的工具和试剂。
3.核酸引物的制备：-将外源DNA或RNA与引物混合，使其形成核酸复合物。
4.细胞处理：-将培养皿中的细胞进行冲洗，去除培养基。
-将适量的细胞培养基添加到培养皿中，以保证细胞的正常生长。
5.导入核酸：-将所制备的核酸复合物滴加到细胞培养基中。
-将细胞培养皿置于无菌环境中，以便细胞吸收和利用核酸。
6.细胞培养：-按照细胞类型和所使用的培养基，将细胞置于恰当的培养条件下，并进行培养。
-根据需求添加所需要的生长因子和抗生素。
7.观察和分析：-在一定的培养时间后，观察细胞是否发生了显著的变化。
- 使用适当的实验方法（如PCR、Western blot等）检测外源基因的表达。
-观察并记录实验结果。
以上是脂质体转染的原理和操作步骤。
脂质体转染是目前常用的基因传递技术之一，可以用于研究基因功能、疾病治疗等领域。
随着技术的不断发展，转染效率和特异性将逐渐提高，为研究和治疗带来更多的机会和挑战。
阳离子脂质体基因载体的细胞转染研究
阳离子脂质体基因载体的细胞转染研究姜云霞1,2,王冰2,崔韶晖2,赵轶男2,杨宝灵2,段艳2,3,王秀武1,3,张树彪2*(1.辽宁师范大学生命科学学院,辽宁大连116029;2.大连民族学院生命科学学院国家民委-教育部重点实验室,辽宁大连116600;3.中国科学院大连化学物理研究所,辽宁大连116023)摘要 研究阳离子脂质体在不同细胞中的转染效率及毒性。
首先采用D N A 延滞实验研究L ipo fec tam in e2000、D O T A P 转染试剂与D N A 的结合能力。
然后选用绿色荧光蛋白的质粒pG F P -N 2作为报告基因模型和转染试剂制成复合物后转染H e la 、7721、H T 29细胞,比较多种因素对转染的影响。
最后使用M T T 比色法分析L ipo fectam i n e 2000、D O T A P 转染试剂对细胞的毒性。
随着复合物中转染试剂比例的增加,L ipo fectam in e2000、D O T A P 与DN A 结合能力逐渐增强。
L ipo fe ctam in e2000在H e la 细胞转染最高效率约72%;在7721、H T 29细胞转染效率较低,D O T A P 在3种细胞的转染效率都很低;在转染效率最高时2种转染试剂的细胞存活率均在90%以上。
对商品化的转染试剂研究和讨论以期为阳离子类脂非病毒载体的研究提供参考。
关键词 阳离子脂质体;转染效率;M T T中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517-6611(2009)17-07862-03S tud y on th e C e ll T ran s fe c t ion o f th e C a t ion ic L ip o som e G e n e C a rrie r J I ANG Yu n -x ia e t a l (C o lleg e o f L ife S cien ce ,L iaon in g N o rm a l U n iv e rsity ,D a lian,L iaon in g 116029)A b s tra c t T h e tran sfe ction e fficien cy an d cy to tox icity o f ca tion ic liposom e in diffe ren t ce lls w e re stud ied.T h e com b in in g ability o f L i po fectam i n e 2000,D O T AP an d D N A w as stu died th rou gh D N A de la y tes t .W ith th e in crea sin g o f th e p ropor tion o f tran s fection re agen t in th e com plex ,D N A de lay w a s s tren g th en ed.W h enth e m a ss ra tio o f L ipo fectam in e2000to D N A an d D O T A P to D N A w a s i n crea sedto 3∶1and 6∶1respective ly ,on ly a little D N A m oved ou t fro mth e o r ig in s ite.F u r th erm ore ,pG F P -N 2th a t can e xpre ss th e g reenflu o re scen t p ro te in w as ch osen a s a repor te r to obse rve th e tran sfec tion e fficien -cy d ire ctly.T h en,L ipo fectam in e2000/D N A co m p lexe s w e re tran s fectedi n to seve ra l ce ll lin e s ,su chas H e la ,7721,H T 29,an d th e e ffects o f th e tran s fec-tion con d ition s w e re ev a lu a ted.T h e tran sfe ction e fficien cy o f L ipo fectam in e2000to H e la ce ll w a s abou t 72%and h igh e r th an o th e r 2k i n ds o f ce ll types ob-v iou sly ,bu t th e tran sfection e fficien cy o f D O T A P w a s low.C y to tox icity stu d ies su gge sted th a t tran sfection reagen ts h ad con side rably low er to x icity ;th e pe rcen tage o f v iab le ce lls w as h igh e r th an 90%i n 7721ce lls .K e y w o rd s C a tion ic liposom e ;T ran sfe ction e ffic ien cy ;M T T基金项目 国家自然科学基金资助项目(20876027);辽宁省科技厅博士启动基金资助项目(20031082)。
脂质体介导的hBMP-2基因转染兔骨髓间充质干细胞的实验研究
１ １ 主要 仪 器 多 通 道 Ｐ Ｒ 扩增 仪 （ Ｅ公 司， ． Ｃ Ｐ 美 国） 低温高速 离心 机 （ 因公 司 ， 国 ） 凝 胶 电泳成 ， 基 美 ， 像分 析系统 （ Ｉ ＢＯ—Ｒ Ｄ公 司， 国 ） 电泳仪 （ Ａ 美 ， 北京六
一
１５ １ 实验分 组 ． ．
将 兔 Ｂ Ｃ 细胞株 分为转染 重组 ＭＳ ｓ
发 生 蛋 白 一２ ｈｍ ｎ ｂｎ ｏ ｈｇｎｔ ｒ ｅ （ ｕ ａ ｏｅｍ ｒ ａｅｅ ｃｐｏ ｉ ｐ ｉ ｔ ｎ一２ ，
除未贴壁的血细胞 ， ８ｄ传第 １ ， ７～ 代 传至第 ３代（ Ｐ）
细胞时应。
ｈ ＭＰ一 ） Ｂ ２ 基因导人到 Ｂ Ｓ ｓ ， Ｍ Ｃ 中 使其 持续稳 定表达 ， 并发挥 其诱 导 成骨 作用 仍 是亟 待解 决 的问题 。２ ０ ０８ 年 ９月至 ２ １ 年 ６月我们进行 了相关研究 ， 果报告 ０１ 结
５ ０ ６０ ７ ０ ８０ Ｉ ／ Ｌ８个梯 度 。观察 细胞 生长 状 ０ 、 、０ 、０ ｇｍ ０ ￣
况， 以第 ８～ ０天细胞全 部死 亡为 最佳筛 选浓 度。结 １ 果为以最低致死 浓度 ４ ０Ｉ ／ Ｌ作为下一步筛选转基 ０ ｇｍ ￣
因细胞株的浓度 。
１ ５ ｐ Ｄ Ａ３ １一ｈ ＭＰ一２转 染 兔 Ｂ Ｃ ． ｃ Ｎ ． Ｂ ＭＳ ｓ
子细胞 … ， 而骨形 态发 生蛋 白 一２被认 为是 骨形 态发
静脉注射麻醉 ， ２ Ｌ注射器带 １ 用 ０ｍ ８号穿刺针 头 自胫 骨上端穿刺抽取 骨髓 ， 抽取 ４— Ｌ 直接 用 Ｄ Ｅ 共 ６ｍ ， ＭＭ 培养基冲洗入培养瓶 中。４ — ２ｈ后首次换液 。以去 ８ ７
脂质体转染原理及操作步骤
脂质体转染原理及操作步骤
脂质体转染是一种常用的基因传递方法，通过将目标基因以及负载该基因的脂质体添加到细胞培养物中，使其与细胞膜融合，并将基因导入到细胞内。
脂质体转染的操作步骤如下：
1. 提取脂质体：首先，从脱脂牛奶或其它来源中提取脂质体。
可以通过超声处理、离心等方法将脂质体分离出来。
2. 混合目标基因与脂质体：将目标基因与脂质体混合，目标基因可以是质粒DNA、RNA等。
将基因加入脂质体溶液中，进
行充分混合。
3. 孵育：将脂质体-基因混合物在室温下孵育一段时间，通常
为15-30分钟。
这一步主要是让脂质体与基因充分结合。
4. 加入细胞：将孵育好的脂质体-基因混合物加入需要转染的
细胞培养物中。
细胞种类可以是哺乳动物细胞、脊椎动物细胞、细菌等。
5. 孵育细胞：将细胞培养物保持在适宜的培养条件下，孵育一定时间，让细胞充分吸收脂质体-基因复合物。
6. 收获转染细胞：经过一定时间的孵育后，可从培养物中收获转染细胞。
可以根据实验需要进行后续分析。
需要注意的是，脂质体转染的效率与脂质体组分、浓度、孵育时间、细胞类型等因素密切相关，需要进行参数优化才能达到较高的转染效果。
脂质体介导抗乙脑病毒载体转染猪胎儿成纤维细胞条件的优化
（ 青 岛农 业 大 学 动 物 科 技 学 院 ，山 东 青 岛 ２ ６ ６ １ ０ ９ ） 摘要： 本 试 验 旨在 探 索 脂 质 体 Ｌ ｉ ｐ ｏ ｆ ｅ ｃ ｔ ａ ｍｉ ｎ ｅ ２ ０ ０ ０介 导 抗 猪 乙脑 病 毒 （ Ａｎ ｔ ｉ — Ｊ Ｅ Ｖ） 载体转染猪胎儿成纤维细胞 （ Ｐ Ｆ Ｆ ） 的 最适条 件 ， 为构 建 Ａｎ ｔ ｉ — Ｊ Ｅ ｖ 转 基 因 胚 胎 提 供 供 核 细胞 。从 妊 娠 大 白母 猪 获 取 １ Ｏ ～１ ５ ｅ ｍ猪胎儿 ， 采 集 背 部 皮 肤 用 于组 织 块 法 培养分 离 Ｐ Ｆ Ｆ 。结 果 显 示 ， 细胞 培 养 至 Ｐ ７ 代， 生 长 曲线 正 常 ； Ｐ ５ — ７代 细 胞 用 于 抗 猪 乙脑 病 毒 载体 转 染 ， 当质 粒 ＤＮ Ａ 量 设 定 为 ０ ． ３ ５ 、 ０ ． ７ 、 １ ． ０ ５ ｇ和 １ ． ４ ｇ时 ， 转染率分别 为 １ ２ ． ７ ５ 、 ３ ６ ． ８ ２ 、 ２ ４ ． １ ２ 和８ ． ８ ５ ； 当脂 质 体 量 设 定 为 ０ ． ７ 、 １ ． ４ 、 染 率 分别 为 １ ３ ． Ｏ ８ 、 ２ １ ． ７ １ 、 ３ ７ ． １ ５ 、 ２ ４ ． ２ １ 和 ９ ． ２ １ ； 当 转 染 时 间设 定 为 ２ ． ５ 、 ４ ． ５ 、 ６ ． ５ ｈ和 ８ ． ５ ｈ时 ， 转
染 率分别为 ３ ． ９ ７ 、 ３ ８ ． ４ ８ 、 １ ７ ． ５ ４ 和 １ ２ ． ４ ７ 。这 些 结 果 表 明 ， ２ ． １ Ｌ脂 质 体 介 导 ０ ． ７ ｇ质 粒 Ｄ ＮＡ 转 染 ４ ． ５ ｈ转 染 效 率
阳离子脂质体转染操作方法
阳离子脂质体转染操作方法
阳离子脂质体转染是一种常用的基因传递实验技术，可以将核酸载体有效地转染至细胞内。
下面是阳离子脂质体转染的基本操作方法：
1. 细胞培养：选择适合的细胞培养基及条件，将要转染的细胞在培养皿中培养至指定的生长状态，通常是80%～90%的细胞密度。
2. 制备DNA-脂质体复合物：将目标DNA与阳离子脂质体以适当比例混合，制备成DNA-脂质体复合物。
复合物的制备条件可以根据实际情况进行优化，一般来说，将DNA与脂质体按照质量比1:3～1:5混合，在无菌条件下保持15～30分钟使其充分结合。
3. 转染：将DNA-脂质体复合物均匀滴加至细胞培养皿中，注意避免产生气泡，插入培养皿中心。
轻轻摇晃培养皿使其均匀分布，然后将培养皿放回密闭的培养箱中，继续培养。
4. 代谢酶抑制：在培养细胞转染后的前24小时内，添加代谢酶抑制剂（如10 μg/mL的氨基葡萄糖苷或10 mM的2-脱氧-D-葡萄糖）来提高转染效率。
5. 培养：根据需要的实验设计，继续培养细胞，通常在转染后24～72小时进行下一步的实验。
需要注意的是，每个细胞系对阳离子脂质体的适应性不同，因此在实际操作中需要进行不同的试验优化。
同时，与脂质体浓度、DNA浓度、转染时间等因素也需要进行优化。
动物基因工程—目的基因导入受体细胞
目的基因导入受体细胞
二、基因导入方法
（1）显微注射法 利用显微注射仪，通过机械方法把外源DNA直接注入细胞质或细胞核的基因转化
方法。 一般是微管吸取供体DNA溶液，在显微镜下准确地插入受体细胞核中，并将
DNA注入进去。此法常用于转基因动物的基因转移。
将外源基因用微玻璃管在显微镜下注射入受精卵细胞核中
目的基因导入受体细胞
一、受体细胞（receptor cell）
作为基因工程的宿主细胞必须具备的条件： 便于重组DNA分子导入；能使重组DNA分子稳定 存在；便于便于重组体的筛选；遗传稳定性高，易于扩 大培养；安全性高，无致病性，不会对外界环境造成生 物污染；利于外源基因蛋白产物高效表达。
目的基因导入受体细胞
入的外源基因进行遗传分析。
目的基因导入受体细胞
一、受体细胞（receptor cell）
原核生物受体细胞缺点
原核生物细胞不具备真核生物的蛋白质折叠复性系统，即使真核生物基 因能得到表达，得到的多是无特异性空间结构的多肽链。
原核生物细胞缺乏真核生物的蛋白质加工系统，而许多真核生物蛋白质 的生物活性正是依赖于其侧链的糖基化或磷酸化等修饰作用。
二、基因导入方法
（4）基因枪法
又称微弹轰击法，是利用高速运行的金属颗粒（微弹，1um）轰击细胞时能进入细胞内的 现象，将包裹在金属颗粒（钨或金颗粒）表面的外源DNA分子随之带入细胞进行表达的基 因转化方法。
基本做法：先将外源DNA溶液与钨或金颗粒（直径0.5-um）共同保温，使DNA吸附于金 属颗粒表面，然后放电加速金属颗粒，使之以400m/s的速度直接喷射受体细胞，外源 DNA随金属颗粒进入细胞内部。
具有趋化性的农杆菌移向这类植物受伤细胞，并将其Ti质粒上的T-DNA转移至细 胞内部。根据这一性质，将待转移的目的基因组入Ti质粒载体，通过农杆菌介导进入 植物细胞，与染色体DNA整合，得以稳定维持或表达。
脂质体转染原理
脂质体转染原理
脂质体转染是一种常用的基因传递工具，可以将外源DNA有效地引导进入目标细胞。
其原理基于脂质体的特殊结构和细胞膜的特性。
脂质体是由疏水性和亲水性分子组成的结构，可以形成类似细胞膜的双层结构。
在细胞培养条件下，脂质体会与目标DNA 结合，形成脂质体/DNA复合物。
当脂质体/DNA复合物与目标细胞接触时，由于脂质体与细胞膜的亲和性，复合物可以通过与细胞膜融合的方式进入细胞。
一旦脂质体/DNA复合物进入细胞，复合物会被内吞作用包裹成内吞体，内吞体随后与溶酶体融合形成溶酶体内嘌呤体。
在溶酶体内，复合物会被酸性环境和溶酶体内含的酶分解，释放出DNA分子。
最后，释放出的DNA会进入到细胞核中，并与细胞核中的染色体相结合，启动目标基因的表达。
脂质体转染的原理可以归纳为三个步骤：脂质体与DNA结合形成复合物，复合物与细胞膜融合进入细胞，复合物在细胞内释放DNA并进入细胞核。
这个过程提供了一种可靠的手段，用于将外源DNA引导进入目标细胞，实现基因传递和表达。
脂质体介导转染法的原理与应用
６８ ７
４
Ｂｅ ｓＤ ａ Ｔ ｄ ￣ ｕ ｏ． ０ １ ２ ８ ４７ ｌ０ Ａ ｔ ￣ｎｓ ｌ ｎ １２０ ．２（ ）：５ 。
４ ６３
１ 脂 质 体 的 组 成 和 制 备 ． １ １ 组 成 脂 质 体 的 脂 类 ． 现 有 的商 业 化
脂质 体 均 为 阳离 子脂 类 与 中性 脂 类 的 复 合 体 ， Ｌｐ ｆｃＡ Ｎ Ｌｐｆｃｉ 等 ， 性 脂 如 ｉｏｅｔＭＩＥ、 ｉｏｅｔ ｎ 中 粪 多 为 二 油 酰 磷 脂 酰 乙 醇 胺 （ Ｐ 其 ＤＯ Ｅ） 中， 阳离子脂类 起 主要 作用 ， 过静 电作用 与 通 Ｄ Ａ形成 Ｄ Ａ 脂 复 合 体 并 引 导 Ｄ Ａ 进 入 Ｎ Ｎ 一 Ｎ 细胞 ； Ｐ ＤＯ Ｅ起 辅 助 作 用 ． 定 脂 质 和 胞 内促 稳 Ｄ ＮＡ释 放 ， 为 辅 助 脂 类 称 阳离子脂质 体 主要 分 ３类 ： １ （ ）人 工 合
关 键 词 ： 质 体 ； 离 子 脂 质 体 ； 染 脂 阳 转 中 图分 类 号 ： ８ ３ Ｑ １
脂 胺 Ｓ 为 已知 的 唯 一 纯 天 然 的 脂 类 阳离 Ａ，
子 脂 粪 根 据 所 转 的 细 胞 种 类 不 同 ， 在 细 胞 存 选 择 问 题 ， 可 能 与 细 胞 表 面差 异 有 关 这 １２ 脂 质 体 的 制 备 方 法 ． 磷 脂 在 水 中 能 与 水 相 互 作 用 自发 形 成 脂 膜 ， 此 制 备 脂 质 因 体 的 关 键 在 于 如 何 形 成 大 小 适 当 、 封 率 高 包 的 囊 泡 根 据 分 散 方 法 的 不 同 ， 备 方 法 分 制 为 机 械 分 散 法 （ 手 摇 法 、 声 波 法 等 ） 钙 如 超 、 融 合 法 、 机 溶 液 分 散 法 、 相 蒸 发 法 、 污 有 反 去 剂法等 。制备 的主要 步骤 为 ： １ （ ）将 脂 质 材 料溶于有 机相 中 ， 一 定条件下 去除溶剂 ， 在 使 脂 质 干 燥 形 成 薄 膜 ： ２）使 脂 质 分 散 形 成 所 （ 需 大 小 的 囊 泡 ； ３）包 裹 Ｄ Ａ； ４） 纯 化 脂 （ Ｎ （ 质 体 ；５ （ ）转 染 ： 为 了 获 得 满 意 的 脂 质 体 ， 需 要 综 合 利 用 上 述 方 法 手 摇 法 形 成 的 脂 质 体 是 多 层 囊 泡 ＭＬ Ｖ （ ｌｌｍ ｌ ｒｖｓ ｌ） 但 大 小 不 均 一 且 不 能 ｍｕｔａ ｅｌ ｅｉ ｅ ， ｉ ａ ｃ 保 护 Ｄ Ａ免受核 酸酶 的降解 。 Ｍ Ｖ经 超 声 Ｎ Ｌ 波 处 理 则 变 为 小 的 单 层 囊 泡 （ｍａｌ ｎｌｍｅ— ｓ ｌｕ ｉ ｌ ａ ｌｒｖｓ ｌｓＳ Ｖ） Ｕ ａ ｅｉ ｅ ，Ｕ 。Ｓ Ｖ体 积 小 ， 裹 效 率 低 ｃ 包 且 不 能 包 裹 较 大 分 子 量 的 核 酸 如 今 ， 用 运
脂质体介导DNA转染法
脂质体介导DNA转染法脂质体（LR）试剂是阳离子脂质体DOTMA和DOPE的混合物（1：1）。
它适用于把DNA转染入悬浮或贴壁培养细胞中，是目前条件下最方面的转染方法之一。
转染率高，优于磷酸钙法，比它高5-100倍，能把DNA和R NA转染到各种细胞。
用LR进行转染时，首先需要优化转染条件，应找出该批LR对转染某一特定细胞适合的用量、作用时间等，对每批LR都要做。
先要固定一个D NA的量和DNA/LR混合物与细胞相互作用的时间，DNA可从1-5ug和孵育时间6h，开始，按这两个参数绘出相应LR需用量的曲线，再选用LR和D NA两者最佳的剂量，确定出转染时间。
因LR对细胞有一定的毒性，转染时间以不超过24h为宜。
细胞种类：COS-7、BHK、NIH-3T3、Hela和Jurkat等任何一种细胞均可作为受体细胞。
1、操作步骤（方法一）：（1）细胞培养：取6孔培养板，向每孔中加入2ml含（1-2） x 105个细胞的培养基，37℃、18% CO2培养基40%-60%汇合时。
（2）转染液制备：在聚苯乙烯管中制备以下两液（为转染1个空细胞所用的量）。
A液：用不含血清培养基稀释DNA使浓度为1-10ug，终量100u。
B液：用不含血清培养基稀释LR，使终浓度为2-50ug，终量100u。
轻轻混合A液、B液，室温中置10-15min，稍后会出现微浊现象，但并不妨碍转染。
（3）转染准备：用2ml不含血清培养基漂洗2次，再加入1ml不含血清培养基。
（4）转染：把A/B复合物缓缓加入培养基中，摇匀，置37℃温箱中6-2 4h，吸除无血清转染液，换入正常培养基继续培养。
（5）其余处理：如观察、筛选、检测等与其他转染法相同。
（6）注意：转染时切勿加血清，血清对转染效率有很大影响。
2、快速脂质体转染法操作步骤（方法二）：将细胞以5 x 10^5个/孔接种于6孔板中培养24h，使其达到50%-60%板底面积。
在试管中配制DNA-脂质体复合物。
转染步骤
基因转染技术简介常用的基因转染技术是将外源基因导入靶细胞需要一定的载体和导入方法，基因转技术则是将纯化的含有靶基因的质粒DNA送入细胞内，常用的基因转染技术是将外源基因导入靶细胞需要一定的载体和导入方法，基因转技术则是将纯化的含有靶基因的质粒DNA送入细胞内，并在细胞内表达。
转染方法有多种，根据不同的细胞，贴壁或悬浮细所可选用不同的方法，其目的是要达到设置转染效率，影响转染产率的因素有多种，包括转染方法、操作技术、质粒DNA 的纯度、靶细胞的生长状态等，下面重点介绍向几种常用的转染技术：被用于作靶基因转染的细胞，其生长状态如何，将直接决定了基因转染效率。
如为贴壁生长的细胞，一般要求在转染前一日，必需应用胰酶处理成单细胞悬液，重新接种于培养皿或瓶，细胞密度以铺满培养器皿的60%为宜，转染当日，在转染前4小时换一将近新鲜培养液。
对于悬浮细胞，也需在转染前4小时换一次新鲜培养液。
用于转染的质粒DNA必须无蛋白质，无RNA和其了化学物质的污染，OD260/280比值应在1.8以上。
应用酚-氯仿抽提法制备的质粒DNA一般难以达到此标准，目前大多采用进口的术提取纯化试剂盒。
具体的基因转染技术有鳞酸钙介导的转染法、DEAE 葡聚糖介导转染法、脂质体介导转染法及电击基因转导尘等。
靶基因被导入细胞后，一般在转染后48小时，靶基因即在细胞内表达。
根据不同的实验目的，48小时后即可进行靶基因表达的检测等实验。
如若建立稳定的细胞系，则可对靶细胞进行筛选，根据不同基因载体中所含有的抗性标志选用相应的药物，最常用的直核表达基因载体的标志物有潮霉素（hygromycin）和新霉素（neomycin）。
常规转染技术可分为两大类，一类是瞬时转染，一类是稳定转染（永久转染）。
前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中，因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数，产生高水平的表达，但通常只持续几天，多用于启动子和其它调控元件的分析。
一般来说，超螺旋质粒DNA 转染效率较高，在转染后24-72小时内（依赖于各种不同的构建）分析结果，常常用到一些报告系统如荧光蛋白，β半乳糖苷酶等来帮助检测。
脂质体介导质粒DNA法转染藏鸡成纤维细胞的研究
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脂质体介导化学合成siRNA转染原代心肌细胞：筛选理想浓度
烈 益糟 课题资助惟一来源为国家 自然基金， 釜 无利益
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敲低 的一种有效方法 ，但 目 ｓ Ｎ 前 ｉ Ａ转 染原代 心肌 细胞 的 Ｒ 方法较 为复杂 不利 于众 多实验 的开展应用 ， 课题应用脂质体 转 染试剂 ｓＰ Ｔ Ｎｅ Ｆ Ｔ 介导化学合 成的 ｓ ｉＯＲ ｏＸ Ｍ ｉ ＲＮＡ可 以
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脂质体转染实验步骤和细胞转染技术总述
脂质体转染实验步骤和细胞转染技术总述
一、脂质体转染实验步骤
1）细胞处理：细胞培养，细胞脱落，细胞悬液浓缩；
2）添加脂质体：将DNA与相应脂质体混合，可以将DNA结合到脂质体上；
3）细胞接种：将脂质体/DNA混合物接种到细胞悬液中，使DNA能够被细胞吞噬；
4）转染放置：将接种混合物保持在室温静置一定的时间，从而使DNA能够被细胞吞噬；
5）细胞活化：在静置期间，DNA会被细胞内吞噬，当添加激活剂和营养培养基时，细胞会活化；
6）细胞培养：在细胞活化后，细胞会被培养，并进行观察，以评估DNA转染的效果；
7）细胞收集：在培养过程中，可以通过浓缩细胞悬液，将转染后的细胞收集起来，以便进行其他分析。
细胞转染是将外源DNA片段转染到细胞中，从而改变其基因表达的技术。
目前常用的细胞转染技术有电转染、磁珠转染、质粒转染、脂质体转染等。
1）电转染
电染是一种最常用的染技术，即通过将DNA片段置于细胞悬液中，然后用微电流刺激，使DNA片段直接进入细胞。
脂质体介导哺乳动物细胞转染的改良方法
Ｐ Ａ ｐ ａ ｍｉ ｙ ｍｏ ｉ ｅ ｔｏ ａ ７ ， ９ Ｓ ｌ ｓ ｄ ｂ ｄ ｆ ｄ ｍｅｈ ｄ ｗ ｓ７ ％ ６ ％ ａ ｄ ８ ％ ．Ｔ ｅ ｍｅ ｉ ｅ ｉ ｏｅ ｔ ． ｄ ａｅ ｅ ｅ ｔ ｎ ｆｒ ｍｅｈ ｄ ｃ ｕｄ ｅｆｃ ｉｅｖ ｉ ｎ ３ ｈ ｄ ｆ ｄ ｌ ｆｃ ｉ ｍｅ ｉ ｔ ｇ ｎ ｒ ｓ ｔ ｏ ｏ ｌ ｆ ｔ ｌ ｉ ｐ ｎ ｄ ａ ｅ ｅ ｖ
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中 国免 疫 学 杂 志 ２０ ０ ７年 第 ２ ３卷
脂 质体 介导 哺 乳 动物 细 胞 转 染 的 改 良方 法①
尹晓光 吴 秀丽② 万
中国图书分类号
敏② 王艳媚② 王丽颖② 于永利 ③
文献 标 识 码 Ａ 文章 编 号
（ 吉林大学基础 医学院免疫教研 室， 长春 １０ ２ ） ３０ １
胞， 表达报告蛋 白 Ｇ Ｐ的阳性百分率 （６ 、４ Ｆ ２ ％ ２ ％和 ４ ％ ） ０ 高于传 统法转 染 的细胞 （ ６ 、６ 和 １ ％ ） １％ １％ ８ 。改 良法转 染 的 Ｂ ６ １、
Ｒ 和 ＥＡ 经过 克 隆 筛 选 、 氮 冻 存 、 浴 复 苏 和 体 外 连 续 培 养 ２周 后 ， 源 基 因 报 告 蛋 白 Ｇ Ｐ表 达 的 阳 性 百 分 率 分 别 为 Ｍ１ Ｉ 液 水 外 Ｆ
７ ％ 、９ ７ ６ ％和 ８ ％ 。在转染流程上 ， ３ 通过改 良法获得单克隆转 染细胞 株 的时间 明显缩短 。结 论 ： 良的脂质体 转染方 法结合 改
细胞克隆技术 ， 能在 最 短 时 间 内获 得 高 表 达 外 源 基 因 的转 染 细 胞 株 。
［ 关键词 】 脂质体 ； 良方法 ；ｃ Ｎ — Ｆ —Ｓ 共聚焦显微镜 ； 改 ｐＤ Ａ Ｇ ＰＰ Ａ； 流式 细胞 术
脂质体转染法的原理及特点
脂质体转染法的原理及特点脂质体转染法是一种常用的转基因技术，通过利用脂质体作为载体将外源基因导入到细胞中，从而实现基因转染。
其主要原理包括以下几点：1. 脂质体结构：脂质体是一种由磷脂和胆固醇等成分组成的球形结构，其外层为亲水性头基团，内层为疏水性脂肪酸基团。
这种结构使得脂质体能够结合并包裹DNA，形成脂质体-质粒复合物。
2. 细胞摄取：脂质体-质粒复合物可以与细胞表面脂质脂质双层膜进行相互作用，导致脂质体被细胞摄取。
一旦摄取到细胞内，脂质体会与细胞内的膜融合并释放质粒DNA。
3. 质粒DNA释放：脂质体在细胞内融合后，会导致质粒DNA从脂质体中释放出来。
质粒DNA由于具有负电荷，会与细胞内的阳离子结合并进入细胞质中。
4. 核入侵：释放的质粒DNA需要穿越细胞核膜才能进入细胞核。
质粒DNA可以通过凝胶蛋白小孔或核膜内的核膜孔进行通过，进入细胞核。
5. 基因表达：一旦质粒DNA进入细胞核，可以与细胞的内源性转录因子结合并转录成mRNA。
mRNA会进一步被转化为蛋白质，从而实现外源基因的表达。
脂质体转染法的特点包括：1. 简单易行：脂质体转染法操作简单，不需要特殊的设备，适用于一般的实验室条件。
2. 高效率：相对于其他转染方法，脂质体转染法在一定程度上具有较高的转染效率，可以使较大数量的细胞获得外源基因。
3. 适用广泛：脂质体转染法可以应用于多种细胞类型，包括哺乳动物细胞、植物细胞、昆虫细胞等。
4. 低毒性：相对于病毒载体转染法，脂质体转染法的毒性较低，不会对细胞产生明显的损伤。
5. 稳定性较差：脂质体转染法所转染的外源基因在细胞中会存在过期的情况，需要进行适当的处理来维持外源基因的稳定表达。
脂质体转染操作步骤
脂质体转染操作步骤
（一）准备材料
1.质粒：一般是由受体细胞胞浆抽提的质粒，其中含有DNA操纵因子、胞质蛋白等；
2.抗体：主要由混合物或单一蛋白质组成，用于鉴定质粒抗原性以及
抑制免疫反应；
3.细胞培养液：一般为包含细胞培养基和生长因子的混合物；
4.转染试剂：也称转染缓冲液，主要由多种物质，如阿拉伯胞浆清酯、卡夫培糖、酚红、多数体核酸等组成，用于载体细胞的传感和质粒的迁移。
（二）脂质体转染操作
1.取出细胞培养液，将受体细胞倒入培养管中，用浓度为0.25%（体
积比）的牛血清添加至8-10%，以细胞膜生长抗性抑制剂（如抗生素或吲
哚美辛）等抑制细胞膜的分裂，加以培养；
2.将培养液中的受体细胞的数量控制在2×105/ml以上，用酚酞红法
检测，检测结果达到要求后，把受体细胞从培养管中放入6 ml的离心管中，进行6000 g的离心；
3.将离心液放入新的容器中，把细胞抽出，再加入细胞稀释缓冲液
（以PBS或缓冲液为主，加入百维素或多数体核酸）至1×106/ml，离心5000 g；
4.将离心液抽出，用转染试剂缓冲液把细胞洗涤，再分别加入DNase I, 抗体和质粒，放入摇床中。
DNA重组(DNA recombination)技术：DNA重组与鉴定-2
DNA重组（DNA recombination）技术：DNA重组与鉴定-2（1）CaCl2处理以后的转化: 当细菌处于0℃、二价阳离子（如Ca2+、Mg2+等）低渗溶液中时，细菌细胞膨胀成球形，处于感受态；此时转化混合物中的DNA形成抗D NA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，重组DNA在42℃短时间热冲击后吸附在细胞表面，在丰富培养基中生长数小时后，球状细胞恢复原状并繁殖，该方法的转化效率为每微克DNA可获得105-106转化子。
环状DNA比线状DNA分子转化效率高1000倍左右。
本法的关键是选用的细菌必须处于生长对数期，实验操作必须在低温下进行。
（2）电击法: 也称电穿孔法，电击法（electroporation）最早用于将DNA导入真核细胞，利用高压脉冲，在细菌细胞表面形成暂时性的微孔，重组DNA从微孔中进入，脉冲过后，微孔复原，在丰富培养基中生长数小时后，细胞增殖，重组DNA得到大量复制。
除需特殊仪器外，它比CaCl2操作简单，无需制备感受态细胞，适用于任何菌株。
其转化效率较高，每微克DNA可以得到109-1010转化子。
2.重组DNA分子导入真核细胞将噬菌体、病毒或或以它们为载体构建的DNA重组体导入真核细胞的过程称为转染（transfection）。
（1）CaCl2处理以后的转染：这是将重组的噬菌体DNA导入细胞的常规方法。
这时的真核细胞一定要经一定浓度的冰冷的CaCl2（50～100mmol/L）溶液处理以后成为感受态细胞，感受态细胞有摄取各种外源DNA的能力。
（2）电击法：利用脉冲电场将DNA导入受体细胞，它的导入效率受到很多因素的影响，如外加电场的强度：对大多数的哺乳动物细胞来说，一般控制在250～750v/cm 较适宜；工作温度：对不同类型的细胞要求有所不同，可在0℃至25℃的范围内选择；DNA的构象和浓度：线形DNA比环状DNA要好，浓度宜控制在1～40μg/ml。
此外，缓冲液的离子成分也对DNA的导入效率有一定影响，一般盐溶液的导入效果较好。
8、细胞转染(脂质体介导法)
细胞转染（脂质体介导法）细胞转染可以：（1）真核细胞可以掺入外源DNA而获得新的遗传标志；（2）应用于转基因动植物；（3）应用于生物制药、基因治疗、RNA干扰。
实验材料：293T细胞、MyoD表达质粒、EGFP表达质粒试剂、试剂盒：DMEM培养基、青霉素、FCS、PBS、EDTA、转染试剂、链霉素、小牛血清仪器、耗材：微量移液器、Tip头、涡旋振荡器、恒温水浴箱、台式离心机、培养皿、转染管、离心管、观察用倒置显微镜、荧光显微镜、CCD其他：研究进展1. 转染技术国际上推出了一些阳离子聚合物基因转染技术，以其适用宿主范围广，操作简便，对细胞毒性小，转染效转染试剂率高受到研究者们的青睐。
其中树枝状聚合物（Dendrimers）和聚乙烯亚胺（Polyethylenimine，PEI）的转染性能最佳，但树枝状聚合物的结构不易于进一步改性，且其合成工艺复杂。
聚乙烯亚胺是一种具有较高的阳离子电荷密度的有机大分子，每相隔二个碳个原子，即每“第三个原子都是质子化的氨基氮原子，使得聚合物网络在任何pH下都能充当有效的“质子海绵”(protonsponge)体。
这种聚阳离子能将各种报告基因转入各种种属细胞，其效果好于脂质聚酰胺，经进一步的改性后，其转染性能好于树枝状聚合物，而且它的细胞毒性低。
大量实验证明，PEI是非常有希望的基因治疗载体。
目前在设计更复杂的基因载体时，PEI经常做为核心组成成分。
2. 转染效率线型PEI（LinePEI,LPEI）与其衍生物用作基因转染载体的研究比分枝状PEI（BranchedPEI,BPEI）要早一些，过去的研究认为在不考虑具体条件，LPEI/DNA转染复合物的细胞毒性较低，有利于细胞定位，因此与BPEI相比应该转染效率高一些。
但最近研究表明BPEI的分枝度高有利于形成小的转染复合物，从而提高转染效率，但同时细胞毒性也增大。
超高分枝的、较柔性的PEI衍生物含有额外的仲胺基和叔胺基，在染实验中发现这种PEI的毒性低，但转染效率却较高。
答辩论文-脂质体介导的CHO细胞转染
（二）脂质体制备
1.脂质体简介 脂质体是由脂质双分子层组成的，不同组成的脂质体其表面电性会 不同，表面电荷为阳性、阴性和中性的脂质体对细胞的转染频率也 会有差别。其中阳离子脂类起主要作用，通过静电作用与DNA形成 DNA-脂复合体，并引导DNA进入细胞
2.脂质体的制备方法 脂质体的制备主要有超声波法、磷脂酰丝氨酸Ca2+离子融合法和逆 相蒸发等，用超声波法可制备的单层或多层脂质小体能向细胞内引 入的物质量少，故常用后两种方法制备大的脂质体。 3.脂质体介导转染的机制 阳离子脂质体表面带正电荷，能与核酸的磷酸根通过静电作用，将 DNA分子包裹入内，形成DNA-脂复合体，也能被表面带负电荷的细 胞膜吸附，再通过融合或细胞内吞食、作用进入溶酶体。 内吞后DNA-脂复合体在细胞内形成包涵体，在DOPE作用下，细胞 膜上的阴离子脂质因膜的不稳定而失去原油的平衡扩散进入复合体， 与阳离子脂质中的阳离子形成中性离子对，使原来与脂质体结合的 DNA游离出来，进入细胞质，进而通过核孔进入细胞核，最终进行 转录并表达。 4.增加转染效率的添加剂 脂质体-DNA复合体中加入一些阴离子物质促进复合体与细胞膜的融 合或DNA的释放。DNA与脂质体混合前预先用磷酸盐缓冲液处理。 硫酸精蛋白通过精蛋白分子中精氨酸残基浓缩质粒DNA来增加转染 率。Ca2+能促进膜对DNA-脂质体的吸收。
脂质体介导的CHO细胞转染
——脂质体介导的基因真核细胞转染
指导老师：XX 班级：生物2班 姓名：XX
一
二
三
四 五
内容简介 实验材料 实验方法 实验结果分析 结论
一 内容简介
转染就是让外源核酸进入真核细胞中。如今广义的转染不单包括了 DNA、RNA，还有蛋白质等生物大分子。核酸转染技术在21世纪60年 代末和70年代初期已经建立。 常用的转染方法有:磷酸钙法、DEAE一葡聚糖法、电穿孔法(电击基 因导人法)、脂质体转染法，另外还有细胞核的直接微注射法、Pol 沙rene介导的外源DNA导入培养细胞可分为瞬时转染和稳定转染。 本实验将采用脂质体转染法转染宿主细胞。 Lipofectamine™ 2000转染试剂是一种阳离子脂质体,在体外可以转 染许多种哺乳动物细胞，对各类细胞系都可提供最高的转染效率， 具有高效性和操作步骤简单的优点。
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(4) 转染：把A/B复合物缓缓加入培养液中，摇匀，37℃温箱置6～24小时，吸除无血清转染液，换入正常培养液继续培养。
(5) 其余处理如观察、筛选、检测等与其它转染法相同。注意：转染时切勿加血清，血清对转染效率有很大影响。
用LR进行转染时，首先需优化转染条件，找出该批LR对转染某一特定细胞适合的用量及作用时间等，对每批LR都要做到：第一，固定一个DNA的量和DNA/LR混合物与细胞相互作用的时间，DNA可从1～5μg和孵育时间6小时开始，按这两个参数绘出相应LR需用量的曲线，再选用LR和DNA两者最佳的剂量，确定出转染时间(2-24h)。因LR对细胞有一定的毒性，转染时间以不超过24小时为宜。
(6) 用细胞刮或消化法收集细胞，备分析鉴定。
稳定脂质体转染法操作步骤：
(1) 接种细胞同前，细胞长至50%板底面积可用于转染；
(2) DNA/脂质体复合物制备及转染细胞同前(2)、(3)步骤；
(3) 在每孔中加入1mL 20%FBS的DMEM，37℃培养48小时；
(4) 吸出DMEM，用G418选择培养液稀释细胞，使细胞生长一定时间，筛选转染克隆，方法参照细胞筛选法进行。
脂质体(lipofectin regeant, LR)试剂是阳离子脂质体N-[1,2,3-Dioleyoxy Propyl]-n,n,n-Trimethylammonium Chloride(DOTMA)和Dioleoyl photidye-thanolamine(DOPE)的混合物[1:1(w/w)]，用于把DNA转染入悬浮或贴壁培养的细胞中，是目前最方便的转染方法之一，转染效率高，优于磷酸钙法，能把DNA和RNA转染到各种细胞。
细胞种类：COS-7、BHK、NIH3T3、Hela和Jurkat等任何一种细胞均可作为受体细胞。
操作步骤：
(1) 细胞培养：取6孔培养板(或用35mm培养皿)，向每孔中加入2mL含1～2×105个细胞悬液，37℃、5%CO2培养至40%～60%汇合(汇合过分，转染后不利于筛选细胞)。
(2) 转染液制备：在聚苯乙稀管中制备以下两种液体(为转染每一个孔细胞所用的量)——A液：用不含血清培养基稀释1-10μg DNA，终量100μL；B液：用不含血清培养基稀释2-50μgLR，终量100μL。轻轻混合A、B液，室温中置10-15分钟，稍后会出现微浊现象，但并不妨碍转染(如出现沉淀可能因LR或DNA浓度过高所致，应酌情减量)。
快速脂质体转染法操作步骤：
(1) 以5×105细胞/孔接种6孔板(或35mm培养皿)培养24小时，使其达到50～60%板底面积。
(2) 在试管中配制DNA/脂质体复合物方法如下：
①在1mL无血清DMEM中稀释PSV2-neo质粒DNA或供体DNA；
②旋转1秒钟，再加入脂质体悬液，旋转；
③室温下放置5～10分钟，使DNA结合在脂质体上；
(3) 弃去细胞中的旧液，用1mL无血清DMEM洗细胞一次后弃去，向每孔中直接加入1mL DNA/脂质体复合物，37℃培养3～5小时；
(4) 再于每孔中加入20%FBS的DMEM，继续培养14～24小时；
(5) 吸出DMEM/DNA/脂质体混合物加入新鲜10%FBS的DMEM，2mL/孔，再培养24～48小时；