乳酸菌菌种地分离筛选方法

乳酸菌菌种的分离筛选方法

乳酸细菌是一类能利用发酵糖产生大量乳酸的细菌通称。为兼性厌氧菌，杆状或球状，革兰氏阳性菌，无芽抱，不运动。营养要求高，需要提供丰富的肽类氨基酸维生素。在琼脂表面或内层形成较小的白色或淡黄色的菌落。

通常用作为有益微生物的菌种有乳酸乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、粪肠球菌、乳酸片球菌、双歧杆菌、屎肠球菌、戊糖片球菌等。

乳杆菌常用MRS琼脂作半选择培养基。当乳杆菌仅是复杂区系中的部分菌类时，SL培养基常用作为选择性培养基。对于芽抱乳杆菌常用GYP培养基，链球

菌有TYC培养基、MS培养基。M17培养基被用作乳球菌的分离培养基。

嗜酸乳杆菌属于乳杆菌属的一个种。其特性为：杆菌，两端圆，不运动，无鞭毛。粪肠球菌为革兰氏阳性，圆形或椭圆形。

乳酸片球菌细胞呈球状，直径 0.6~1.0卩m,在直角两个平面交替形成四联状，一般细胞成对生，单生者罕见，不成链状排列。革兰氏阳性，不运动，兼性厌氧。在MRSW养基上菌落小，呈白色。沿洋菜穿刺线的生长物呈丝状。

乳酸菌在一般琼脂培养基上形成微小菌落，不易观察，所以分离时先富集培养并选择合适的培养基。分离培养基一般添加西红柿、酵母膏、吐温 -80等物质，也常常加入醋酸盐，因醋酸盐能抑制部分细菌生长，对乳酸菌无害。

培养基中添加碳酸钙，乳酸溶解培养基中的碳酸钙形成透明圈，作为分离鉴别的依据，通过对生成的乳酸量进行性能鉴定。

乳酸菌生长繁殖时需要多种氨基酸，维生素及微氧，一般菌落比较小。分离培养基一般可添加西红柿酵母膏油酸吐温等物质，均具有促进生长作用。也常常添加醋酸盐抑制有些细菌的生长，对乳酸菌无害。

一.筛选方法：

1.溶钙圈法：

利用一些产酸类细菌在含CaC03勺培养基上产生CaCO3溶解圈，从而筛选出这些产酸类细菌，可用于乳酸菌的筛选。

其中培养基中加入CaCO3勺作用是：①鉴别能产生酸的细菌；②中和产生的酸，

以维持培养基的PH

筛选过程：样品预处理一梯度稀释至 10-6 一选择合适的稀释度涂布一 37 C培养

48h-挑选产生溶钙圈的菌落反复在 MRS9养基上划线一挑起单菌落染色，经镜

检确认为纯种-挑选革兰氏阳性单菌落一试管穿刺4C冰箱保存。

2.溴甲酚绿指示剂法：

培养基: MRS培养基（含溴甲酚绿酒精溶液）

筛选过程：同上，不同之处是稀释涂布后长出菌落，挑取使溴甲酚绿变色的菌

落。

二.菌种的分离筛选

1.培养基：

★ 1.1麦芽汁碳酸钙培养基：麦芽汁（10BX 1L预先灭菌碳酸钙5-10g/L PH

自然（分离用）

★★ 1.2牛肉膏10g/L蛋白胨10g/L酵母膏10g/L番茄汁200g/L 葡萄糖 10g/L 吐温

0.05% CaCO315-20g/L 溴甲酚绿 0.01% PH6.0-6.5 （分离用）★ 1.3番茄汁碳酸钙培养基：

酵母膏7.5 g/L 葡萄糖10 g/L 番茄汁100mL蛋白胨7.5g/L KH2PO4.0 g/L 吐温 0.5 mL PH 6.0-6.5 （分离用）

1.4葡萄糖 20g/L 酵母膏 10g/L PH 6.0-6.5

1.5蛋白胨 8- 10 g/L 酵母膏 3- 5g/L 葡萄糖 13- 15g/L KH2PO4 1.5-

2.0g/L MgSO0.3-0.5 g/L MnSO 4 0.2-0.25g/L NaAC

3.0-5.0g/L PH 5.5-6.5

1.6蛋白胨 0.8- 1.0g/L 糖蜜 3.0-5.0g/L 酵母膏 3-5g/L 玉米浆 0.5- 1.0g/L KH2PO4 0.1- 0.3g/L MgSO4 0.3-0.5g/L NaC13-5g/L 葡萄糖 8-10g/L

PH5.5-6.5 （发酵或种子培养基）

★★ 1.7 MRSS养基（分离培养计数用）蛋白胨10.0g、牛肉膏10.0g、酵母膏5.0g、柠檬酸氢二铵2.0g、

葡萄糖20.0g、吐温80 1.0mL、乙酸钠5.0g、磷酸氢二钾2.0g、硫酸镁

0.58g、硫酸锰0.25g、琼脂18.0g、蒸馏水1L, pH 6.5。（分离培养基），

当MRSS养基冷却至45〜50C时,加入已灭菌的碳酸钙,充分混匀，倒平板。

1.8 BCP 培养基（溴甲酚紫培养基）

乳糖5.0g 蛋白胨5.0g酵母膏3.0g 0.5 %溴甲酚紫10ml自来水1000ml

PH6.5-7.0 （分离用）

1.9 BC倂乳营养琼脂：脱脂奶粉10g，溶于50ml水中，加入1.6 %溴甲酚绿酒精溶液0.07ml, 0.075Mpa 20min。另取琼脂

2.0 g,溶于50ml水中，加酵母膏

1.0 g溶解后调pH6.5-6.8，0.1 Mpa 20min.趁热在无菌操作下两者混合均匀，

倒平板，37°C培养24h,检查是否有杂菌。

2.分离筛选：

2.1富集培养：取1.0g (1.0ml)于无菌细口瓶中，加入无菌麦芽汁液体培养液于瓶口处，密闭，25-32 C培养48h。若培养基表内出现绢丝波纹物，镜检杆状，革兰氏阳性，初步定为乳酸菌。以同样方法转接2-3次，接种量3-5 % .

2.2菌种分离纯化：

溶钙圈法：

富集菌液或样品适当稀释至10-7，混菌法分离，先加入10-12ml MRS培养基或麦芽汁培养基，凝固后再注入4-5ml水琼脂培养基，制成厌氧环境，30C或37C 培养2-3天(温度低时间稍长)，可出现针头状或圆形稍扁菌落，周围形成透明圈。挑取透明圈大，培养基变黄的菌落，反复划线纯化2-3次，所得单菌落编

号，经镜检后，疑似乳酸菌落接种于MRS培养基培养后保存备用。或接入液体培养基中，25-32 C培养24-48h，然后穿刺于MRS培养基或麦芽汁碳酸钙半固体培养基中，25-32 C 培养48h保存备用。

2.3性能测定：

乳酸菌定性试验：

不同条件下的产酸速率试验：将分离菌种接种于MRS液体培养基中25 C 37 C温度下培养测不同菌株不同温度的pHo

方法1.吸取发酵液10ml，注入空试管中，加入10%硫酸1.0ml，在加入2.0

%高锰酸钾约1.0ml，此时乳酸转化成乙醛。取滤纸一条，在含氨的硝酸银

溶液中浸湿，横搭在试管口上，将试管徐徐加热至沸腾，使乙醛挥发，若管口滤纸变黑，证明有乳酸生成。