实验设计论文

第四届“探密生命”实验设计大赛

课 题：纳米材料介导的目的基因在肿瘤细胞上的表达

负责人：王 璞 生物科学类 2009级

组 员：杜 爽 生物科学类 2009级

武梦菲 生物科学类 2009级

柳善达 生物科学类 2009级

崔 桐 生物科学类 2010级

一、实验基本构思

（一）实验背景

在日新月异的今天，肿瘤仍是严重威胁人类健康的重大疾病之一。目前，其发病率呈逐年上升趋势，2020年全世界癌症（恶性肿瘤）发病率将比现在增加50%，全球每年新增患者人数将达到1500万人。近20年来，癌症居死亡原因之首，我国的癌症死亡率上升了29%。所以，如何走出肿瘤治疗的瓶颈，仍需要我们继续探索。

制疗癌症的传统方法有三种：手术治疗，放射治疗及化学治疗。基因治疗则是近年来兴起的一种新的治疗热点，被认为是治疗恶性肿瘤最有希望的治疗方案之一。它的基本思路是将正常的遗传物质导入病人的体细胞并使之表达，产生有治疗作用的蛋白质．从而达到治疗疾病的目的。这种方法直接应对造成疫病的本质——损伤的基因，而不是解决由损伤基因造成的疾病症状，因而有可能从根本上对疾病进行治疗。而介导目的基因的载体一直是基因治疗研究领域中最至关重要的核心问题之一。纳米材料自被发现之初就一直备受青睐，近年来将纳米材料分散于聚合物中以提高高分子材料性能的研究也日益活跃，并取得了许多可观的成果。

（二）实验意义

随着人们对p53基因与肿瘤发生机制研究的深入，以及对纳米材料性能作用的不断发现，利用纳米材料介导p53基因及其相关因子对肿瘤的预防、治疗将更加有针对性，对人类攻克肿瘤具有重要的参考意义。然而纳米材料作为基因介导的载体虽具有发展前景，但目前仍有许多未知问题尚待解决。通过这个实验，可以初步验证纳米材料作为载体介导目的基因（野生型P53基因）在肿瘤细胞中可有效表达。并通过实验中相关量的对比设置，对纳米材料运用有更一步的认识，提供理论依据。

（三）实验目的

1、验证所选纳米材料能否与目的基因结合实现复合——转染的过程，并分析各溶液条件对复合率、

转染率的影响。

2、选取标记基因，检测目的基因的转入，并观察目的基因表达部位与数量。

3、设计实验证明目的基因正常表达。

4、观察肿瘤细胞的各项指标，研究肿瘤细胞转染后对肿瘤细胞的抑制作用。

5、整理分析，并与预期进行比较，发现问题，得出结论。

二、实验材料与方法

（一）实验材料：

1.聚乙烯亚胺-聚谷氨酸苄酯[PEI—PBLG(10KD)]

2.野生型P53基因

3、绿色荧光蛋白(GFP)基因

4．人宫颈癌细胞株Hela

5. 其它材料：DMEM培养基

PBS工作液：取贮存液50ml 加三蒸水450ml即成，高压灭菌，4℃保存。

细胞裂解液

灭活新鲜小牛血清内切酶BamHI Tris．HC1缓冲液

0.8%的琼脂糖凝胶多聚甲醛(粉末状) 中性树胶

聚丙烯酰胺凝胶（PAGE） SDS缓冲溶液四甲基乙二胺（TEMED）

硝酸纤维膜 TBS溶液 P53抗体（小鼠单克隆抗体）

二抗（碱性磷酸酶偶联的羊抗小鼠lgG） DAB显色试剂盒

0.5%MTT溶液二甲基亚砜胰蛋白酶

70%冷乙醇 200目尼龙网碘化丙啶(PI 50ug/l)

（二）实验仪器：

磁力搅拌器、无菌滤器、Eppendorf管、恒温孵育箱、水平电泳槽、电泳仪、凝胶成像分析系统、微波炉、微量移液器、透明胶带、点样板或parafilm、紫外灯、荧光显微镜、基因枪、恒温水浴箱、玻璃研磨器、Mini Trans-Blot的冷却装置、ELC检测试剂盒、Mini-PROTEAN 3、电转移系统、酶联免疫检测仪、流式细胞仪

烧杯、1000ml容量瓶、100 ml或250 ml锥形瓶、量筒、吸头、接种板、三角锥瓶、载玻片、盖玻片、夹板盒、底片、压片盒、印记膜

（三）实验步骤：

1、受体细胞的培养

1.1 受体细胞的培养

取人宫颈癌细胞株Hela，DMEM培养基加10%灭活小牛血清，培养于37℃、饱和湿度含5% CO2细胞培养箱。

2、野生型P53基因与 PEI—PBLG的复合

2.1 实验原理：分子末端带有阳离子的PEI—PBLG，可通过其表面氨基团正电荷与核苷酸分子的磷酸根负电荷发生静电作用，从而，与DNA形成复合物，并导致载体DNA的浓缩。

2.2 实验方法

2.2.1 野生型P53基因的提取

取含1．8kb p53 C-DNA的pc53．SN质粒,经用内切酶BamHI消化后，获得1．8 kb p53 C-DNA；

2.2.2 wtp53/PGFP融合基因的合成

运用PCR技术将野生型P53基因进行扩增，利用新型分子探针绿色荧光蛋白基因（GFP），运用基因重组技术与野生型P53基因融合成wtp53/PGFP融合基因；

2.2.3 融合基因在无菌管中的培养

取三支Eppendorf管，在每管中将1μg wtp53/PGFP融合基因稀释在50μl 不含灭活新鲜小牛血清的DMEM培养基，分别标记上A、B、C，振荡均匀。

2.2.4各条件对复合物形成的影响

规定PEI—PBLG与野生型P53基因的质量比分别为0.5/1，1/1，1.5/1，分别加入到标有A、

B、C的三个无菌管中，将相对应的无菌管溶液混合。

2.2.5 复合结果的观察与分析

室温孵育15min，形成复合物，用0.8%的琼脂糖凝胶100V电泳20min，进行凝胶电泳分析，在紫外灯下鉴定复合结果，并筛选出复合程度最高的一组备用，经酒精沉淀保存。对观测结果截图并进行分析。

3、外源基因的介导

3.1实验原理：PEI—PBLG通过其表面所携带的正电荷阳离子与细胞膜表面带有负电荷的糖蛋白及磷脂结合，以胞吞机制进入细胞质。

3.2实验方法：

3.2.1 Hela细胞的接种

转染前24h,将Hela细胞以1×104个细胞每孔接种在96板上培养24h，待细胞丰度50％～80％。在转染前4h，用PBS洗涤1次，用不加灭活新鲜小牛血清的DMEM培养基置换培养液，然后把其吸走。

3.2.2 Hela细胞与复合物的转染