人类外周血中提取基因组DNA方法的探索
外周血白细胞中DNA提取与检测
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四、操作步骤
1、破碎细胞：
吸去血清，混匀含有EDTA Na2的抗凝全血→取0.3mL至EP管（1）→加1mLSTMT，混 匀→离心（12000rpm 1-2min），弃上清→加1mL0.9% NaCl洗涤离心,弃上清 （12000 rpm 1-2min）→加460 μ L NE ,充分吹散沉淀→加35 μ L 10%SDS，轻 轻混匀。
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谢 谢 各 位
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一、实验目的
1.掌握真核细胞中DNA制备原理。
2.熟悉从外周血白细胞中提取DNA的方法。
3.掌握紫外分析仪检测DNA的原理。
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二、实验原理
STMT破碎红细胞及白细胞的细胞膜→离心收 集白细胞核→SDS破膜
破碎细胞
DNA提取
苯酚氯仿抽提、乙醇沉淀洗涤
检测
琼脂糖凝胶电泳，紫外分析仪检测
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三、仪器试剂
加样：DNA样品10 μ L +载样缓冲液2 μ L，混匀，取10 μ L点样
电泳：点样端接负极，100V，40min
紫外分析仪下观察结果
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电泳结果图
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五、注意事项
1、注意安全（苯酚具有强腐蚀性），操作戴手套； 2、所用玻璃器皿及溶液需经高压灭菌处理； 3、混匀试剂、吸取上清等操作时应动作要轻柔,避免动作剧烈； 4、离心分离两相时，应保证一定的转速和时间，且吸取上清时 注意不要吸取到中间层及有机相； 5、沉淀后注意不要将DNA沉淀倒掉。
2、DNA提取：
加等体积苯酚，轻摇1min→离心（12000rpm 3-5min）→吸取上层水相于另一EP管（2） →加1/2体积苯酚+1/2体积氯仿-异戊醇，轻摇1min →离心（12000rpm 1min）→取上 层水相于另一EP管（3）→加等体积氯仿-异戊醇→离心（12000rpm 1min） →取上层 水相于另一EP管（4）
外周血DNA简易提取法
logo.gif (2519 bytes)广西医科大学学报JOURNAL OF GOUNGXI MEDICALUNIVERSITY 1999年 第16卷 第2期 Vol.16 No.2 1999qklogo.gif (1030 bytes)外周血DNA简易提取法周小玲 林伟雄 从人血液中或组织中提取DNA是现代分子生物学研究获得大分子DNA的普遍方法，我们对经典［1～4］的DNA提取法进行了一些改进和简化，获得了较好的效果，现介绍如下。
1 方法与结果 取ACD抗凝血2ml，加入等量质量浓度为3%明胶生理盐水(含0.5%EDTA-Na2)，混匀后置37℃水浴(若气温较高可免水浴)，约5～10 min红细胞沉降分层，可在上层液还残留少许红细胞时尽可能多地吸取上层液(甚至可吸取少量界面上的红细胞)，上层液(富含白细胞)3500 r/min离心5min，弃上清液，沉淀的白细胞加入2ml TES(15 mmol/L Tris-HCl pH8.0、15 mmol/L EDTA pH8.0、15 mmol/L NaCl)混匀，加质量浓度为10%SDS 至终浓度0.5%，待细胞充分裂解(液体由混浊变清和粘稠)，加等体积饱和酚，用吸管抽吸使酚水两相充分混合成乳浊液，若太粘稠可加适量TES再抽提，3500 r/min离心10 min后吸上清液至另一管，重复酚抽提一次，加等体积氯仿/异戊醇(24/1,V/V)抽提一次，将最后离心获得的上清液吸出后加入2.5倍体积的无水乙醇，轻轻摇动使纤维状的DNA析出，DNA用体积分数为75%乙醇洗涤一次，于有盖锥形离心管中开盖风干，加适量TE(10 mmol/L Tris-HCl pH8.0、1mmol/L EDTA-Na2 pH8.0)溶解即可用于PCR等分子生物学实验，表1是简易法与经典方法(中分子右旋醣酐悬浮加上蛋白酶K水解)提取的DNA比较(血液标本每份2 ml)，图1是用简易法提取的DNA进行PCR-SSP检测人HLA 基因型的PCR产物电泳图谱。
人类外周血中提取基因组DNA方法的探索
F [4’’1/Q 等 （ "DEC ） 的方法改进而成( 取 Z>R= 抗凝的人外周血 G W’， 离心分离血浆和血球( 血球倒入 G* W’ 大离心管 "( !( ! # 改进方法： 中， 倒入 G ? "* 倍体积的消毒蒸馏水， 混匀， 冰浴静置 G ? "* W70( "( !( C# 离心 （ G*** /YW "* W70 $] ） ， 弃去上清液， 倒入消毒生理盐水至终体积为 !* ? C* W’， 配平混
参考文献(5条) 1.萨姆布鲁克 J;弗里奇 E F;曼尼阿蒂斯 T;金冬雁, 黎孟枫 分子克隆实验指南 1999 2.王龙武;石柯;彭爱红 一种快速微量外周血基因组DNA提取方法[期刊论文]-中国现代医学杂志 2004(02) 3.赵铁军;韩瑞;春华 三种全血基因组DNA提取方法的比较[期刊论文]-张家口医学院学报 2003(04) 4.逄洪波;陈永燕;张恒庆 从动物血液中提取基因组DNA方法的比较研究[期刊论文]-辽宁师范大学学报(自然 科学版) 2005(04) 5.史艳萍;钟晓红 两种全血基因组DNA提取方法的比较[期刊论文]-第一军医大学分校学报 2005(02)
（ 责任编辑8 赛罕其其格）
万方数据
人类外周血中提取基因组DNA方法的探索
作者： 作者单位： 刊名： 英文刊名： 年，卷(期)： 被引用次数： 黄亚凤， 强欣， 张丽伟， HUANG Ya-feng， QIANG Xin， ZHANG Li-wei 内蒙古民族大学,临床医学院,内蒙古,通辽,028000 内蒙古民族大学学报（自然科学版） JOURNAL OF INNER MONGOLIA UNIVERSITY FOR NATIONALITIES(NATURAL SCIENCES) 2006，21(4) 3次
外周血DNA提取方法的比较及改良
文章编号: 1007-6611(2006)01-0012-02外周血D NA提取方法的比较及改良赵嘉惠, 张华屏 (山西医科大学医学实验中心分子生物学实验室, 太原 030001)摘要: 目的 对3种提取外周血的实验方法进行了比较,并建立一种简便、快速、有效的外周血基因组DNA的提取方法。
方法 采用常规酚/氯仿提取法、碘化钾法和外周血液DNA提取法。
结果 外周血液DNA提取方法提取外周血基因组DNA的纯度高,通过电泳图明显可见。
结论 外周血液DNA提取简便、快速、有效适用于临床标本的研究。
关键词: 外周血; 基因组DNA; 提取中图分类号: R349.61 文献标识码: A 快速经济地从外周血提取高产量高纯度的DNA,对于分子水平的研究非常重要。
目前,外周血DNA的提取方法较多,如:常规酚/氯仿提取法、碘化钾法等,为适应临床检验工作的需要,我们经过长期的实验摸索了一种外周血提取DNA的有效方法。
1 材料与方法1.1 仪器 紫外分光光度计:英国CECIL公司生产的CE1020型;PCR扩增仪:美国MJ Research Ine 公司生产的PTC2100型;离心机:美国Heraeus公司生产的Biofuge PrinmoR;电泳仪:日本Hoefer公司生产的PS3000;紫外凝胶成像系统:德国UVP公司生产的G DS7500。
1.2 方法1.2.1 DNA的提取1.2.1.1 常规酚/氯仿提取法 取枸橼酸钠抗凝血80μl,操作方法见参考文献[1]。
1.2.1.2 碘化钾提取法 取100μl ED TA2Na2抗凝血,提取法见参考文献[2]。
1.2.1.3 T KM2血液DNA提取法 取2ml含抗凝剂的全血加入2ml已配制好的溶液Ⅰ缓冲液(10 mmol Tris2HCl p H7.4,10mmol KCl10mmol Mg2 Cl22mmol ED TA)和50μl NP240,旋涡振荡器上充分混匀,3000r/min室温离心10min,弃上清,细胞沉淀中再加溶液Ⅰ缓冲液,混匀后再离心,如此反复3-5次,直至上清由红色变为无色。
人类外周血基因组DNA提取方法的比较分析
［ ５ ］ 傅峥 军 ， 蔡锡顶 ， 顾 承萍． 常规 剂量静 脉滴注 丙种球蛋 白早 期 重症 手 足 Ｅ ｌ 病３ ０例 ［ Ｊ ］ ． 中 国药业 ， ２ ０ １ ２， ２ １
（ ２ ３ ） ： ６ ９— ７ ０ ．
［ ６ ］ 卫生部． 手足 口病诊疗 指南 （ ２ ０ １ ０年 版 ） ［ Ｊ ］ ． 国际呼
为重 型和危 重型 ， 常见 病原 学类 型 为肠道病 毒 ７ ｌ 型 （ Ｅ Ｖ ７ １型 ） 、 科 萨奇病 毒 Ａ １ ６型 （ Ｃ ｏ ｘ Ａ １ ６ ） Ｈ 。Ｅ Ｖ ７ １ 型感染 患 者脑膜 炎 并 发症 发 生 率 较 高 、 重 症 病 例较 多， 而手 足臀 部 皮 疹 较 少 ； Ｃ ｏ ｘ Ａ１ ６皮 肤 黏 膜 损 伤 较 重， 且手 足臀 部皮 疹 及 口腔 内疱 疹 较 多 ＿ ８ Ｊ 。重 症 手 足 口病 的高 发人 群 为 ２岁 以下 儿童 ＿ ９ ｊ ， 危 重 症 病 例 通 常于 发病第 １ ｄ一 ５ ｄ出现 相关 临床症 状体 征 ， 当患 者 并发 肺水 肿时 ， 主要 表 现 为 呼 吸 困难 、 呼 吸浅 促 、
尼龙联合机械 通气治 疗重症 手足 １ ３病 疗效 观察 ［ Ｊ ］ ． 中国实用神经疾病杂志 ， ２ ０ １ ０ ， １ ３ （ ２ ２ ） ： ３ ５ ．
病 常规治 疗措 施 主要为 对症 治 疗 。一般 来 说 ， 抗 病 毒治疗 在 发病 ２ ４ ｈ一 ４ ８ ｈ可起 到较好 的临床疗 效 ，
一种外周血基因组dna快速提取方法与流程
一种外周血基因组dna快速提取方法与流程外周血基因组dna快速提取方法主要包括细胞裂解、蛋白质沉淀、dna沉淀、洗涤、溶解等步骤。
Cell lysis is the first step,which breaks open the cells and releases the DNA.细胞裂解后，使用蛋白质沉淀剂使蛋白质凝聚沉淀，分离dna。
After cell lysis, a protein precipitation reagent is used to precipitate the proteins, separating them from the DNA.接着，用酒精使dna沉淀，加速dna的分离和提取。
Then,alcohol is used to precipitate the DNA, facilitating its separation and extraction.洗涤步骤可以去除杂质和污染物，提高dna的纯度。
Washingsteps can remove impurities and contaminants, increasing the purity of the DNA.最后，使用溶解液将dna溶解，得到纯净的基因组dna。
Finally, a dissolution solution is used to dissolve the DNA, obtaining pure genomic DNA.这种方法简单快捷，适用于大规模的外周血样品提取。
This method is simple and fast, suitable for large-scaleextraction of peripheral blood samples.与传统方法相比，该提取方法省时、高效。
Compared with traditional methods, this extraction method is time-savingand efficient.这种提取方法对于分子生物学研究和临床诊断具有重要意义。
人类基因组DNA的提取_2014
人类基因组DNA的提取【实验目的】1.学习和掌握从人全血中提取基因组DNA的方法。
【实验原理】全血中含有白细胞，可从白细胞中获得基因组DNA。
非离子去污剂如Triton X-100可直接破裂血中红细胞和白细胞的细胞膜，释出血红蛋白及细胞核，反应体系中含一定浓度蔗糖，维护核膜内外的渗透压，以防止核膜破裂，通过离心等手段即可获得白细胞的细胞核。
核悬液中加入核裂解液破坏核膜，并使DNA从核蛋白中解离，裂解液中的EDTA能抑制细胞中DNase的活性，保护DNA暂时不被降解。
再经异丙醇沉淀即可获得基因组DNA。
基因组DNA提取应遵循以下原则，1、尽量保证核酸一级结构的完整性。
2、排除其它分子(如蛋白质、多糖、脂类、有机溶剂等)的污染，使下游试验顺利进行。
【实验用品】1.材料：外周血2.器材：水浴锅、离心机、微量移液器、Tip头、Eppendorf管3.试剂：（1）细胞裂解液：（2）核裂解液（3）蛋白沉淀液（4）DNA溶解液（5）RNA酶（6）异丙醇（7）70%乙醇（8）TE缓冲液【实验步骤】1. 1.5ml离心管中加入300ul经抗凝处理的人全血，加入900ul细胞裂解液翻转5-6次混匀。
2.室温保存10分钟（其间翻转2-3次）裂解红细胞。
室温13000*g离心20秒，弃上清（会有约20ul残留液）。
3.涡旋震荡10-15秒（使细胞核充分重悬）。
加入300ul核裂解液，移液器抽吸5-6次混匀（此时溶液会变粘稠）。
37℃温浴10分钟。
4.加入100ul 蛋白沉淀液，涡旋震荡10-20秒。
5.室温13000*g离心3分钟。
可见到深褐色的蛋白沉淀。
6.将上清转移至1.5ml离心管中，加入300ul室温异丙醇。
7.轻柔翻转离心管，可观察到白色丝状物（即DNA）8.室温13000*g离心1分钟。
可见离心管底部有DNA白色沉淀物。
弃上清。
9.加入300ul 70%乙醇，轻柔翻转清洗DNA，室温13000*g离心1分钟。
试验九、外周血提取DNA
4、加0.9%生理盐水300 μL,450 μL氯仿：异戊醇（24:1），边加边摇， 20s后10000rpm离心10min。
5.取上层液400 μL ，加入另一新EP管中，加 800 μl无水乙醇，摇匀20s，10000rpm离心 10min，使沉淀紧贴EP管壁。
三、实验材料
1.器材 （1）高速冷冻离心机。 （2）自动移液器。 （3）枪头、1.5ml离心管（高压灭菌） 2.试剂 5mol/LKI 氯仿/异戊醇（24:1V/V） 无水ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ醇 70%乙醇 双蒸水（高压灭菌） 0.9%生理盐水 TE缓冲液（PH8.0）高压灭菌
血样的采集
吸取0.2ml 1%0.6ml EDTA抗凝剂 （10mmol/L Tris～Cl，0.2mmol/L EDTA， PH 8.0）于已灭菌的2ml一次性注射器中， 从每只鸡的翅静脉采集血样1ml，转移到已 灭菌的1.5ml Eppendorf管中，置冰瓶带回实 验室，-20℃保存。
二、 实验原理： 从全血制备白细胞DNA，可用双蒸水溶胀红 细胞及白细胞膜，释放出血红蛋白及细胞核， 使核酸处于易提取状态，加KI破核膜并使DNA 从核蛋白中解离，用氯仿/异戊醇抽提使蛋白 质沉淀完全，DNA存在于上层水相中，以异丙 醇沉淀DNA，离心弃去异丙醇，并重复操作一 次，即可获得白细胞DNA。
6.弃无水乙醇，加800 μL 70%乙醇（不振动）， 以10000rpm离心3min。
7.弃去上清，离心1分钟，将残液用移液枪取出， 自然干燥，加20 μl无菌双蒸水，混匀溶解备用。
样本裂解
↓ 纯化去蛋白
↓ 沉淀核酸
↓ 洗涤去盐
血液中DNA提取的原理
血液中DNA提取的原理：如果以外周血为DNA提取材料，在外周血中提取DNA就是从有核的白细胞中提取DNA。
因此，从外周血中提取DNA包括以下几个关键步骤：第一，破坏红细胞，通常利用红细胞与白细胞膜结构的差异，先使红细胞裂解，经离心后收集白细胞；第二，白细胞裂解：使膜蛋白和核蛋白变性，游离DNA，通常是采用离子型表面活性剂使蛋白质变性；第三，除去变性蛋白质：通常采用蛋白沉淀剂沉淀变性蛋白质，使DNA留在上清液中；第四，在高盐环境下使DNA从有机溶剂如无水乙醇中析出。
取材取外周血5ml，EDTA抗凝1.新鲜抗凝血，离心弃去上清液；2.取出4℃冰箱预冷的ELS裂解液，按1:6-10的比例向细胞沉淀中加入ELS裂解液（1ml 细胞压积加入6-10ml裂解液），轻轻吹打混匀；红细胞裂解液ELS配方：NH4Cl:4.15克加双蒸水500ml,取450ml;Tris:1.0297克加双蒸水50ml,再加上上面的450ml,共计500ml,高压灭菌,用时加10-20ml3.800-1000rpm离心5-8分钟，离心弃去上层红色清液；4.收集沉淀部分，加入Hank’s液或无血清培养液离心洗2-3次；5.如裂解不完全可重复步骤2和3；6.重悬细胞，用于后续实验；提取DNA，最好是于步骤4开始使用DEPC水配制的溶液进行.酚氯仿方法提取DNA在DNA提取过程中应尽量避免使DNA断裂和降解的各种因素，以保证DNA的完整性，为后续的实验打下基础。
是采用在EDTA以及SDS等试剂存在下用蛋白酶K消化细胞，随后用酚抽提而实现的。
这一方法获得的DNA不仅经酶切后可用于Southern分析，还可用于PCR的模板、文库构建等实验。
原则：（1）防止和抑制DNase对DNA的降解；（2）尽量减少对溶液中DNA的机械剪切破坏。
一、试剂准备1．TE: 10mM Tris-HCl (pH 7.8); 1mM EDTA (pH 8.0)。
2．TBS: 25mM Tris-HCl (pH 7.4); 200mM NaCl; 5mM KCl。
一种快速微量外周血基因组DNA的提取方法
文章编号:1005-8982(2004)02-0070-03一种快速微量外周血基因组DNA的提取方法王龙武1,2,石 柯3,彭爱红2,张 志2,徐克前1(1.中南大学湘雅医学院检验系,湖南长沙410008;2.湖南省临床检验中心,长沙410008;3.中南大学湘雅医院,湖南长沙410008)摘要:目的 建立一种简便、快速、有效、微量外周血基因组DNA的提取方法。
方法 采用NaI作细胞裂解剂裂解细胞和细胞核,用氯仿∶异戊醇(24∶1)直接提取基因组DNA。
结果 该方法提取外周血基因组DNA 的纯度高A260nm/A280nm=(1.87±0.11),提取效率每毫升外周血可得DNA(31±3.12)μg。
结论 该法简便、快速、有效,适应于批量临床标本的处理。
关键词: 基因组DNA;碘化钠;外周血;提取中图分类号: R446.61 文献标识码: AA rapid and simple method for extracting hum an genomicDNA from peripheral bloodW ANGLong-wu1,2,SHI ke3,PE NG Ai-hong2,ZH ANG zhi2and X U K e-quan1(1.Department o f Clinical Lab,Xiangya Medical College,Changsha,Hunan410008,China;2.Departmet o f Clinical Lab o f Hunan Province,Changsha,Hunan410003,China;3.Xiangya o f Central South Univer sity,Changsha City,Hunan410008,China)Abstract: Objective:T o establish a rapid,sim ple,efficient method for extracting human genomic DNA from periph2 eral blood.Methods:peripheral blood is lysed by adding a chaotropic agent NaI,then genomic DNA is directly extracteded with chloroform:is oamyl alcohol(24∶1).R esults:The G enomic DNA extracted with this method is of large m olecular weight and A260/280=(1.87±0.11),(31±3.12)μg DNA can be gained from per milliliter peripheral blood.The results of PCR and restriction endonucleases digestion for the DNA are g ood.Conclusions:The me thod is sim ple,rapid,efficient and could be used to handle a largenumber of clinical sam ples.K ey w ords: G enomicDNA;s odium iodide;Peripheral blood;extractionC LC number: R446.61 Document code: A 基因分析的关键步骤,即基因组DNA提取和纯化一直是耗时,繁琐的过程,且自动化程度不高[1]。
外周血DNA提取技术
外周血DNA提取技术方法一：1. 标本预处理：将1ml EDTA抗凝贮冻血液于室温解冻后移入5ml离心管中，加入1ml 磷酸缓冲盐溶液（PBS），混匀，3500g离心15min,倾去含裂解红细胞上清。
重复一次。
用0.7ml DNA提取液混悬白细胞沉淀，37℃水浴温育1h。
2. 消化：上述DNA提取液混悬白细胞，37℃水浴温育1h后，加入1mg/ml蛋白酶K 0.2ml,至终浓度为100-200ug/ml,上下转动混匀，液体变粘稠。
50℃水浴保温3h，裂解细胞，消化蛋白。
保温过程中，应不时上下转动几次，混匀反应液。
3. 酚抽提纯化DNA：上述反应液冷却至室温后，加入等体积的饱和酚溶液，温和地上下转动离心管5-10min，直至水相与酚相混匀成乳状液。
5000g离心15min，用大口吸管小心吸取上层粘稠水相，移至另一离心管中。
重复酚抽提一次。
加等体积的氯仿﹕异戊醇（24﹕1），上下转动混匀，5000g离心15min，用大口吸管小心吸取上层粘稠水相，移至另一离心管中。
重复一次。
4. 加入1/5体积的3mol/L NaAc及2倍体积的预冷的无水乙醇，室温下慢慢摇动离心管，即有乳白色云絮状DNA出现。
用玻璃棒小心挑取云絮状的DNA，转入另一1.5 ml离心管中，加70%乙醇0.2ml，5000g离心5min洗涤DNA，弃上清，去除残留的盐。
重复一次。
室温挥发残留的乙醇，但不要让DNA完全干燥。
加TE液20ul溶解DNA,置于摇床平台缓慢摇动，DNA完全溶解通常需12-24小时。
5. DNA的浓度测定及纯度判定：取DNA溶液用TE液做适量稀释，以TE液作空白对照，在紫外分光光度计上读取A260和A280的光密度值。
按下面公式计算浓度：DNA浓度(ug/ul)= A260*50*稀释倍数/1000DNA纯度的判定：A260/A280 比值应介于1.7-2.0之间。
方法二：分别采集外周静脉血5ml，2%乙二胺四乙酸二钠(EDTA)抗凝待用(要求采血至分离白细胞之间隔时间在室温下放置不超过2h，4℃放置不超过5h，以防白细胞自溶)。
外周血提取DNA及DNA电泳检测
外周血提取DNA及DNA电泳检测DNA电泳是一种常用的分子生物学技术，用于分析DNA样本的大小和纯度。
而外周血提取DNA则是从外周血样本中获取DNA的过程。
本文将介绍外周血提取DNA的步骤，并详细讲解DNA电泳的原理和操作方法。
一、外周血提取DNA外周血提取DNA是一种常用的DNA样本获取方法，适用于临床与实验室研究。
以下将按步骤介绍外周血提取DNA的过程。
1. 收集外周血样本：首先，使用抗凝剂处理外周血样本，以防止凝结。
通常使用EDTA作为抗凝剂，将其加入到试管中。
然后，用注射器采集外周血样本，并将其轻轻倒入带有抗凝剂的试管中。
2. 破坏红细胞膜：外周血样本中富含红细胞，需要将其破坏以释放DNA。
可以使用红细胞裂解液，如红细胞溶解液或混合液，加入到试管中，并轻轻摇晃样本混匀。
红细胞膜破坏后，红细胞内的DNA会被释放出来。
3. 沉淀DNA：通过离心过程，将DNA从样本中分离出来。
将试管放入离心机中，进行适当的离心操作，使DNA沉淀在离心管底部。
然后，将上清液去除，留下沉淀的DNA。
4. 洗涤DNA：使用酒精洗涤DNA，以去除杂质和残余污染物。
将酒精加入到含有DNA沉淀的离心管中，轻轻摇晃样本混匀，然后进行再次离心。
去除上清液，重复这个步骤。
5. 溶解DNA：最后，使用适量的溶解液将DNA溶解。
常用的溶解液为Tris-EDTA缓冲液。
加入适量的溶解液到离心管中，并轻轻摇晃样本混匀，使DNA完全溶解在溶液中。
二、DNA电泳检测DNA电泳是一种常用的DNA分析方法，可用于测量DNA分子的大小和纯度。
本节将介绍DNA电泳检测的原理和操作方法。
1. 准备电泳胶：首先，准备琼脂糖电泳胶。
将适量的琼脂糖加入到缓冲液中，加热搅拌溶解。
然后，将溶解的琼脂糖缓冲液倒入电泳槽中，并插入电极。
2. 加载DNA样本：取一定量的DNA样本，并将其与DNA标记物混合。
然后，将混合物缓慢地加入到电泳槽中的样本槽中。
注意不要漏掉样本，以避免结果的偏差。
外周血提取DNA及DNA电泳检测
实验材料
1.器材 （1）高速冷冻离心机。 （2）自动移液器。 （3）枪头、1.5ml离心管（高压灭菌） 2.试剂 （1）6mol/LNaI (2)氯仿/异戊醇（24:1V/V） (3)纯异丙醇（AR） （4）37%异丙醇 （5）双蒸水（高压灭菌） （6）TE缓冲液（PH8.0）高压灭菌
思考：每个步骤的作用？） 实验步骤（思考：每个步骤的作用？）
实验二十五 NaI法提取外周血白细胞 DNA 法提取外周血白细胞
教学目的:掌握NaI法提取外周血白细胞DNA的原理和方法。 教学目的 教学重点:实验原理与过程 教学重点 教学难点:实验原理与方法 教学难点 使用教具:多媒体 使用教具 教学方法:互动式、讨论式教学法 教学方法 讲授内容纲要、 讲授内容纲要、要求及时间分配
从全血制备白细胞dna可用双蒸水溶胀红细胞及白细胞膜释放出血红蛋白及细胞核使核酸处于易提取状态加nai破核膜并使dna从核蛋白中解离用氯仿异戊醇抽提使蛋白质沉淀完全dna存在于上层水相中以异丙醇沉淀dna离心弃去异丙醇并重复操作一次即可获得白细胞dna
实验二十五 真核基因组DNA分离纯化 真核基因组DNA分离纯化 DNA ─外周血白细胞提取DNቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ 外周血白细胞提取DNA NaI法 （NaI法）
真核基因组DNA的分离纯化 真核基因组DNA的分离纯化 DNA
回忆理论知识 1.真核生物的核酸类型和分布 真核生物的核酸类型和分布 2.真核生物 真核生物DNA的结构 真核生物 的结构
核酸的分离纯化
（一）原则：保证核酸一级结构的完整；排除蛋 原则：
白质、脂类、多糖等其他分子的污染；无其他 核酸分子的污染。
引言： 引言：1min
美国好莱坞电 侏罗纪公园》 影《侏罗纪公园》 总票房超过3 总票房超过3亿美 元同时也创造了一 种大胆的科学设想： 种大胆的科学设想： 一只蚊子吸取了恐 龙的血液， 龙的血液，蚊子恰 巧又被琥珀完美保 存至今日， 存至今日，科学家 因此获取了恐龙的 DNA， DNA，再现了恐龙 时代。 时代。
外周血单核细胞基因组DNA的提取方法[发明专利]
![外周血单核细胞基因组DNA的提取方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/b14184e76c85ec3a86c2c55e.png)
专利名称：外周血单核细胞基因组DNA的提取方法专利类型：发明专利
发明人：辛竹
申请号：CN201310537799.3
申请日：20131105
公开号：CN103614364A
公开日：
20140305
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了外周血单核细胞基因组ＤＮＡ的提取方法，其特征在于，步骤如下：首先，取目的淋巴细胞，其中注入所需缓冲液GA，震荡至彻底悬浮；加入PA，100毫升，高速离心振荡至少半分钟，然后在35摄氏度的环境下静置3-5分钟；加入蛋白酶，颠倒混匀，放置10分钟后，再次颠倒混匀，反复三到四次；加入缓冲液，吹打混匀；加入纯无水乙醇；注入离心管中，高速离心，去除沉淀物；将沉淀物吸附出来；沉淀物种加入漂洗也，然后弃上清；采用分光光度计即可进行测定ＲＮＡ纯度；在进行鉴定浓度之前，需要在先在零下十度的环境下放置三到五分钟；所述测定浓度之前，可以向其中央滴入三到四滴洗脱缓冲液。
本发明的有益效果是：操作简单，成本较低，为肿瘤免疫治疗提供新的思路、方法和途径，同时可以促进免疫杀伤作用。
申请人：辛竹
地址：116000 辽宁省大连市西岗区中山路222号血液净化中心
国籍：CN
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一种外周血基因组DNA快速提取方法[发明专利]
![一种外周血基因组DNA快速提取方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/8cef18cec9d376eeaeaad1f34693daef5ff7135f.png)
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201811175820.9(22)申请日 2018.10.10(71)申请人 南通中科基因医学检验所有限公司地址 226100 江苏省南通市海门市临江新区生物医药科技创业园A9号(72)发明人 陆军 姜昕 刘慧君 董新波 (74)专利代理机构 南京正联知识产权代理有限公司 32243代理人 卢海洋(51)Int.Cl.C12N 15/10(2006.01)(54)发明名称一种外周血基因组DNA快速提取方法(57)摘要本发明提供了一种外周血基因组DNA快速提取方法，包括如下步骤：1）取100-150μL血液样品，加入200-250μL Lysis Buffer和20-35μLProteinase K的预混溶液，充分颠倒混匀，60℃放置10min，95℃放置10min，期间颠倒混匀数次；2）室温放置2-5min后，12000rpm离心2min，取50μL左右上清；3）将90-92μL磁珠加入至装有上述上清的PCR管中，轻轻吹打混匀6次，室温静置孵育5-10min，将PCR管置于磁力架上3-5min。
本发明具有如下技术效果：1）本发明在整个DNA的提取过程中只涉及了3种试剂，且试剂使用量和样品需求量均较低，因此成本较低；2）整个提取过程耗时较短，每一个步骤简单明确，对PCR的扩增效果影响较小；3）通过实际项目验证，采用该方法提取的DNA ，符合绝大部分PCR反应以及MassARRAY平台的检测。
权利要求书1页 说明书3页CN 109207474 A 2019.01.15C N 109207474A1.一种外周血基因组DNA快速提取方法，其特征在于，包括如下步骤：1）取100-150μL血液样品，加入200-250μL Lysis Buffer和20-35μL Proteinase K的预混溶液，充分颠倒混匀，60℃放置10min，95℃放置10min，期间颠倒混匀数次；2）室温放置2-5min后，12000rpm离心2min，取50μL左右上清；3）将90-92μL磁珠加入至装有上述上清的PCR管中，轻轻吹打混匀6次，室温静置孵育5-10min，将PCR管置于磁力架上3-5min；4）移除上清，将PCR管继续放置于磁力架上，向PCR管中加入300-350μL 75%乙醇溶液，静置30S；5）移除上清，再向PCR管中加入300-350μL 75%乙醇溶液，静置30S后彻底移除上清；6）室温静置2-5min，使残留乙醇彻底挥发；7）加入10-12μL的Nuclease free water ，把PCR管从磁力架取下，轻轻吹打重悬磁珠，避免产生气泡，室温静置2-3min；8）将PCR管置于磁力架上2min；9）用移液器吸取10-11μL上清液，转移到新的PCR管中，在反应管上标记样本编号。
外周血DNA的提取
掉含有红细胞碎片的上清液，重复裂解一次，留取白细胞沉淀。Fra bibliotek实验步骤
DNA细胞裂解液(pH 8.0)： 150mmol/L NaCl、10 mmol/L Tris-HCl、 10 mmol/L EDTA、0.5%SDS DNA细胞裂解液中SDS的是表面活性剂，主要作用 裂解细胞膜、核膜，使核膜里与蛋白质结合的核酸释 放到溶液里面。另外，Tris盐的作用是使抽提的出来 的DNA容易进入水相，减少在蛋白质层的滞留。
2.加入0.5mL的DNA细胞裂解 液来悬浮白细胞沉淀。
实验步骤
细胞膜裂解以后，细胞中含有的蛋白质和 DNA酶等释放到溶液中，而蛋白酶K 具有 水解蛋白质和DNA酶的作用，并且在EDTA 和SDS存在的条件下仍保持较高的活性。
3. 悬浮后的溶液中添加蛋白酶
K 20µL ， 65℃水浴 0.5h ，期间
实验原理
此方法提取得到的DNA可能会有RNA杂质，但是RNA极易
降解。而且少量的RNA对DNA的后续操作没有大的影响，如
有必要可以加入不含DNA酶的RNA酶去除RNA的污染。
实验步骤
1.首先取EDTA抗凝的人外周血2mL, 按照1:5～1:10的 比例加入去离子水裂解8min，然后1700rpm/min离心，去
轻缓地倒转几次。
在苯酚/氯仿加入少量的异戊 醇，可以减少实验中气泡的 产生，而且有利于分层，保 持分层的稳定性。
4. 室温下，添加0.5mL的苯酚 /氯仿/异戊 醇混合抽提液，剧烈地震荡混合 10min ，然 后 8000rpm/min 离心 10 分钟，然后将水相移 至新的离心管中。
实验步骤
加入无水乙醇可以吸收水相中的 水分，使得DNA沉淀析出。
外周血中DNA的提取与鉴定
一种碘化钾提取外周血基因组DNA的方法
一种碘化钾提取外周血基因组DNA的方法
赵书平;张俊洁;尤建
【期刊名称】《中华医学遗传学杂志》
【年(卷),期】1999(016)006
【摘要】目的建立外周血基因组ＤＮＡ的快速提取方法。
方法用碘化钾直接从外周血中提取基因组ＤＮＡ。
结果用该方法的取的ＤＮＡ为大分子量ＤＮＡ；Ａ２６０／Ａ２８０为１．８５，Ａ２６０／Ａ２３０为２．２；提取效率大于９０％；ＤＮＡ体外扩增结果良好。
结论该方法简便，快速，经济，可用于大量临床标本的研究。
【总页数】1页(P395)
【作者】赵书平;张俊洁;尤建
【作者单位】解放军第88医院中心实验室;上海长海医院妇产科
【正文语种】中文
【中图分类】R394－33
【相关文献】
1.改良碘化钾法提取冻存外周血基因组 DNA 的方法探讨
2.酚/氯仿法和盐析法提取人类外周血基因组DNA方法的比较
3.经济、有效提取外周血基因组DNA的方法
4.人类外周血基因组DNA提取方法的比较分析
5.一种快速微量外周血基因组DNA的提取方法
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人类外周血DNA提取
人类外周血DNA提取实验四人类基因组DNA 提取【目的】掌握人基因组DNA的抽提方法。
【原理】从不同组织细胞或血细胞中提取高质量的DNA是进行基因诊断的先决条件。
基因组DNA可以从任何有核细胞中提出，人外周血中的淋巴细胞是抽提基因组DNA最方便的材料。
由于DNA在细胞核内是与蛋白质形成复合物的形式存在的，因此提取过程中必须将其中的蛋白质除去，SDS可将细胞膜、核膜破坏，并将组蛋白从DNA 分子上分离，使核蛋白上的核酸游离。
EDTA可抑制细胞中DNase 活性。
蛋白酶K可以用于消化细胞核膜以及核内蛋白质，RNase除去核酸中的RNA。
再用苯酚氯仿抽提可进一步使蛋白质变性而与核酸分开，再经无水乙醇沉淀，最后可得到比较纯净的DNA。
【试剂】外周血基因组DNA提取试剂盒【操作步骤】1.取200ul新鲜、加入抗凝剂的血液。
2.加入20ul蛋白酶K（20mg/ml），混匀。
3.加入200ul缓冲液GB，充分颠倒混匀，70度放置10分钟，溶液应变清亮，简短离心以除去管盖内壁的水珠。
4.加200ul无水乙醇，充分振荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以除去管盖内壁的水珠。
5.将上一步所得的絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管），12000rpm离心30秒，倒掉废液，吸附柱CB3放回收集管中。
6.向吸附柱CB3中加入500ul去蛋白液GD，12000rpm离心30秒，倒掉废液，吸附柱CB3放回收集管中。
7.向吸附柱CB3中加入700ul漂洗液PW，12000rpm离心30秒，倒掉废液，吸附柱CB3放回收集管中。
8.向吸附柱CB3中加入500ul漂洗液PW，12000rpm离心30秒，倒掉废液。
9.将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm离心2分钟，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。
将吸附柱置于室温或50度水浴锅数分钟，以彻底凉干吸附材料中残余的漂洗液。
10.将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜中间部位悬空滴加50-200ul经56度水浴预热的洗脱缓冲液TE，室温放置2-5分钟，12000rpm离心30秒。
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( 但目前关于 >)= 提取方法很多， 不同的方法有不同的 优 缺 点， 其使用的分析技术有所不 ( 为了找一种提取方法简单、 高效的方法， 我们在传统的酚、 氯抽提法的基础上摸索出了改良方
法( 为今后的科研工作提供较好的 >)= 提取方法(
"# 材料和方法
"( " # 材料# 人外周血一式 ! 份， 每份 GW’ 用 Z>R= 抗凝( "( ! # 方法
（ 内蒙古民族大学 临床医学院， 内蒙古 通辽# *!,*** ）
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摘# 要： 目的： 传统的酚、 氯抽提法的基础上进一步改进 >)= 提取方法， 为分子遗传学研究打下基础( 方法： 人 类基因组 >)= 提取传统方法和改进方法( 结果： 改进的方法可以得到大量的较完整的基因组 >)=， 并且纯度 本改良法提取的 >)= 总量明显较高， 提取效率高， @AB 扩增的效果好， 是外周血基因组 达到 "( , ? !( *( 结论： >)= 提取中首选考虑的方法( 关键词： 基因组 >)= ； 酚、 氯抽提法 中图分类号： BCD$( !# # 文献标识码： =# # 文章编号： "+E" F *",G （ !**+ ） *$ F *$", F *!
第 !" 卷# 第 $ 期 !**+ 年 , 月
内蒙古民族大学学报 （ 自然科学版） -&./01’ &2 3004/ 5&06&’71 80794/:7;< 2&/ )1;7&01’7;74:
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人类外周血中提取基因组 >)= 方法的探索
黄亚凤， 强# 欣， 张丽伟
相似文献(4条) 1.期刊论文 史艳萍.钟晓红.SHI Yan-ping.ZHONG Xiao-hong 两种全血基因组DNA提取方法的比较 -第一军 医大学分校学报2005,28(2)
目的比较两种不同的DNA提取方法提取人全血基因组DNA,对DNA提取率、纯度以及PCR扩增的效果影响.方法分别用传统的酚、氯抽提法和改 良法两种不同的方法,提取人全血基因组DNA.结果两种方法提取的DNA纯度用光吸收比值为指标检测A280/260值为:1.45和1.82,提取DNA总量分别 为187μg/ml和260 μg/ml.用0.8%琼脂糖凝胶电泳鉴定改良法制备的DNA效果较好,PCR扩增效果有差异.结论用改良法提取的DNA总量明显较高 ,提取效率高,PGR扩增的效果好,是全血基因组DNA提取中首选考虑的方法.
!**+ F *! F *E ! 收稿日期： 作者简介： 黄亚凤 （ "DGD F ） ， 女， 内蒙古开鲁县人， 实验师， 从事医学病学技术研究(
万方数据
第! 期
黄亚凤等： 人类外周血中提取基因组 "#$ 方法的探索
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3.期刊论文 王强.刘芳.赫崇波.木云雷.王丽梅.尚德静.WANG Qiang.LIU Fang.HE Chong-bo.MU Yun-lei. WANG Li-mei.SHANG De-jing 4种海水鱼线粒体DNA大片段的PCR-RFLP分析 -水产科学2006,25(5)
用蛋白酶k酚氯抽提法从圆斑星鲽、高眼鲽、大菱鲆和真鲷4种海水鱼的肌肉组织中提取基因组DNA, 根据金枪鱼、牙鲆及相关鱼类的线粒体 DNA(mtDNA)序列保守片断设计出扩增引物, 扩增从16SrRNA到ND4之间约9400bp的mtDNA长片段.用10种限制性内切酶(Hinf I, Hind III, EcoR V, EcoT22 I, Mun I, EcoT14 I, Apa I, Bln I, Ava II, Dra I)对扩增得到的mtDNA长片段进行限制性酶切和分析, 其中8种酶有酶切位点.利 用Nei-Li的片断法计算出单倍型的片断共享度,根据片断共享度计算出4种鱼之间的遗传距离,用Mega3.1软件构建NJ系统关系树,同时探讨利用线 粒体大片断PCR-RFLP方法进行鱼类系统发生研究的特点.
28 结论
从上述结果分析， 传统的酚、 氯抽提法提取 "#$ 不仅操作过于繁琐， 费时间， 标本需要量大以外 所得 "#$ 的纯度、 "#$ 的总量，G@H 的扩增效果的影响上都存在欠缺, 所以根据需要改进是有必要 的 , 我们探索的基因组 "#$ 提取改进方法操作简单、 节时， 对于微量标本也能获得所需的 "#$， 同时 结果更为稳定， 是一种值得推广的抽提 "#$ 的好方法,
18 结果
1, ’8 琼脂糖电泳检测结果 用 (, F3 的琼脂糖凝胶电泳分别检测两种方法提取的 "#$ 模板， 在紫外灯可见用改良法制备的 "#$ 电泳带整齐， 荧光较强； 用传统的酚、 氯抽提法制备的 "#$ 电泳带欠整齐， 有拖尾现象， 荧光较 弱, 1, 18 G@H 扩增效果 在相同的模板浓度， 用相同的反应体系， 反应条件及引物， 在同一 G@H 仪上分别用两种方法提取 的 "#$ 为模板进行扩增， 结果用 I3 聚丙烯酰氨凝胶电泳检测， 用银染法显色, 结果用改良法提取的 "#$ 为模板时， G@H 的扩增效果明显较用传统的酚、 氯抽提法 "#$ 好， 而且这种差异随着扩增产物 的片段的增加而更为明显,
! "#$ %#&’() *(+ ,"! -.&+/0&1(2 3+(4 5#+16’#+/7 87(()
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〔 G〕 "( !( " # 传统的提取 >)= 按照 《 分子克隆实验指南》 进行 ， 该法由 [’70 和 \;122&/Q （ "DE+ ） 根据 I/&::
F [4’’1/Q 等 （ "DEC ） 的方法改进而成( 取 Z>R= 抗凝的人外周血 G W’， 离心分离血浆和血球( 血球倒入 G* W’ 大离心管 "( !( ! # 改进方法： 中， 倒入 G ? "* 倍体积的消毒蒸馏水， 混匀， 冰浴静置 G ? "* W70( "( !( C# 离心 （ G*** /YW "* W70 $] ） ， 弃去上清液， 倒入消毒生理盐水至终体积为 !* ? C* W’， 配平混
2.期刊论文 张子波.杨康鹃.金艳花.金雄吉.ZHANG Zi-bo.YANG Kang-juan.JIN Yan-hua.JIN Xiong-ji 延 边朝鲜族人群趋化因子受体5△32基因突变的检测 -延边大学医学学报2002,25(2)
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参考文献(5条) 1.萨姆布鲁克 J;弗里奇 E F;曼尼阿蒂斯 T;金冬雁, 黎孟枫 分子克隆实验指南 1999 2.王龙武;石柯;彭爱红 一种快速微量外周血基因组DNA提取方法[期刊论文]-中国现代医学杂志 2004(02) 3.赵铁军;韩瑞;春华 三种全血基因组DNA提取方法的比较[期刊论文]-张家口医学院学报 2003(04) 4.逄洪波;陈永燕;张恒庆 从动物血液中提取基因组DNA方法的比较研究[期刊论文]-辽宁师范大学学报(自然 科学版) 2005(04) 5.史艳萍;钟晓红 两种全血基因组DNA提取方法的比较[期刊论文]-第一军医大学分校学报 2005(02)
参8 考8 文8 献 〔’〕 史艳萍， 钟晓红, 两种全血基因组 "#$ 提取方法的比较 〔 J〕 , 第一军医大学分校学报， 1((% ， 1F （1） ： ’2( K ’21, 〔1〕 逄洪波， 陈永燕， 张恒庆， 等, 从动物血液中提取基因组 "#$ 方法的比较研究 〔 J〕 , 辽宁师范大学学报， 1((% ， 1F （!） ： !%9 K !I(, 〔2〕 赵铁军， 韩瑞， 春华, 三种全血基因组 "#$ 提取方法的比较 〔 J〕 , 张家口医学院学报， 1((2 ， 1( （!） ： !I K !9, 〔!〕 王龙武， 石柯， 彭爱红, 一种快速微量外周血基因组 "#$ 提取方法 〔 J〕 , 中国现代医学杂志， 1((!， ’! （1） ： 9( K 91, 〔%〕 萨姆布鲁克 J， 弗里奇 / L， 曼尼阿蒂斯 ., 分子克隆实验指南 〔 M〕 , 第二版, 北京： 北京科学出版社， ’NNN, !I% K !I9,