periodical__zgmzmjyyzz__zgmz2009__0922pdf__092208

・１２・

中国民族民间医药

ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＥｔｈｎｏｍｅｄｉｅｉｎｅａｎｄＥｔｈｎｏｐｈａｒｍａｃｙ

药物研究

Ｔｈｅｍｅｄｉｃｉｎｅｓｔｕｄｙ

冬虫夏

～－—叶；Ｊ‘－草的遗传学研究进展

雷呈祥张阵阵

（海军医学研究所，上海，２００４３３）

【摘要】冬虫夏草是传统的名贵中草药，近年来由于需求旺盛导致自然资源枯竭，故其遗传学研究日益引起重视。已经

开展了冬虫夏草的全基因序列分析、基因文库构建、特征ＤＮＡ区段鉴别和功能基因的克隆与表达研究等，这对冬虫夏草遗传信

息的保护、菌株的鉴定和保存、人工培养技术及资源应用等具有重要的指导意义。

【关键词】冬虫夏草；ＤＮＡ分子标记；基凼组学；活性成分

ｌ中图分类号】Ｒ２８２．７【文献标识码】ＡＩ文章编号】１００７—８５１７（２００９）２２—００１２—０２

冬虫夏草菌是真菌，属麦角菌科虫草菌属，又名中华虫草的分离和鉴定。传统的鉴定方法有多途径多批次分离确定、菌，藏语谓之牙儿札更布，拉丁语为Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓｓｉｎｅｎｓｉｓ。作为微循环产孢确认和在特定的人工栽培培养基ｆ：诱发虫草有性青藏高原的特有物种，冬虫夏草主要分布在西藏、青海、四川、子实体来确认等，已报道的从冬虫夏草中分离所得无性型菌云南、甘肃等省区海拔３０００ｍ～５０００ｍ的高寒地区的草甸、株已达１０个属１１个种之多。传统的鉴定方法周期长且不能灌丛、山坡、谷地等高雪线附近。冬虫夏草和人参、鹿茸一样完伞排除感染其它菌株的可能性，故又发展了ＤＮＡ分子标记被誉为“中药三大宝”之一。虽然早在１６９４年就有了“冬虫（ＤＮＡｍｏｌｅｃｕｌａｒｍａｒｋｅｒ）技术，该技术可从分子水平上快速、夏草”这个名称，但是我们对冬虫夏草的了解还有待深入。高效、可靠地鉴定冬虫夏草无性型，且与传统经典分类学相互冬虫夏草菌寄生于鳞翅目蝙蝠科昆虫虫草蝙蝠蛾（Ｈｅｐｉ．印证。

ａｌｕｓａｒｍｏｒｉｃａｎｕｓ）幼虫上，或其它种别的蝙蝠科昆虫幼虫上。１．１ＤＮＡ分子标记技术ＤＮＡ分子标记即ＤＮＡ水平上进在自然界，蝙蝠蛾自产卵到幼虫期感染冬虫夏草菌至转变成行遗传分析的分子标记技术，是以个体间遗传物质内核苷酸真正的冬虫夏草，前后大概需要３年以上的时间。真菌子座序列变异为基础的遗传标记，它可以反映牛物个体或种群基生长时，渐渐变大呈椭圆形，基部留在土中与幼虫头顶相连，因组的差异。基本方法是将基因组ＤＮＡ进行ＰＣＲ扩增、限幼虫因体内充满菌丝体而死亡，因此冬虫夏草实际上是真菌制性片段长度多态性（ＲＦＬＰ）分析或ＤＮＡ随机多态型和幼虫尸体的复合体。（ＲＡＰＤ）分析等技术在凝胶电泳上检测出来。利用ＤＮＡ分１ＤＮＡ分子标记与冬虫夏草鉴定子标记可以进行冬虫夏草与其它虫草间的亲缘关系研究及遗由于受自然条件限制，冬虫夏草资源稀少且过度采挖又传多样性分析，从而鉴定冬虫夏草菌种、确定不同虫草问的遗会严重破坏生态环境，产量有限，满足不了国内外日益增长的传距离等。

需要。人们于是探索冬虫夏草的人工栽培或发酵技术。人工ＤＮＡ分子标记技术的重要靶标是位于核糖体１６Ｓ一２３Ｓ栽培虫草面临的首要问题就是冬虫夏草菌种（虫草无性型）ｒＤＮＡ之间的内转录间隔区（ＩｎｔｅｒｎａｌＴｒａｎｓｃｒｉｂｅｄＳｅｑｕｅｎｃ，

÷・夺・・争・ｔ争－夺・夺・夺・夺・夺・ｔ争・夺－÷・争・弓，・・争・・争・专・夺・・｝・・争・・｝・夺・夺・・｝・夺・夺・÷・・争・・争・夺・・争・．争・・｝・夺・÷・专・夺・夺・．｛，・夺・．争・÷・夺・夺・夺・夺・－—争・

较易见，结节状，棕黄色，基部节较粗，达５０～１６０１ｘｍ；顶端圆钝，较细。⑦丝状短节易见，黑色，半透明，表面光滑，长短不一。⑧油滴少量，大小不一，直径１８～５５ｐ．ｍ，浅黄色，单个散在。见图１。

１．体壁碎片；２．足碎片；３．透明带状物：４．深棕色团块

５．棕黄色团块；６．触角碎片；７．丝状短节；Ｂ．油滴

图１竹虱粉末图

３结果与讨论

通过生物学考察及对原动物形态的观测，证实了同翅目扁蚜科竹茎扁蚜Ｐｓｅｕｄｏｒｅｇｍａｂａｍｂｕｓｉｃａｌａ（Ｔａｋｈａｓｈｉ）的无翅孤雌虫即为《本草纲目》上所记载之竹虱¨卜【４］：密集于竹节间成簇存在，体呈椭圆，长１～４ｍｍ，宽１—２ｍｍ，形大如虱，被白色蜡粉而旱苍灰色。通过实验研究，首次观测并描述了竹虱的药材性状特征及显微鉴别特征，为其生药鉴定提供了依据。在样品采收及调查中发现，竹虱作为竹类常见害虫之一，其有分布广，数量大的特点，如果能将竹虱开发成治疗哮喘的新药，变废为宝，将产生绝大的社会和经济效益。

参考文献

［１］李时珍．本草纲目［Ｍ］．中医古籍出版社，１９９４：１４０６．

［２］陈存仁．中国药学大词典［Ｍ］．世界书局，１９７９：５２４．

［３］于炜，曾新宇，徐芸茜，等．竹茎扁蚜生物学特性与防治［Ｊ］．湖北植保，２００６，５．

（收稿日期：２００９．０８．１５）万方数据

药物研究Ｔｈｅｍｅｄｉｃｉｎｅｓｔｕｄｙ

中国民族民间医药

ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＥｔｈｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅａｎｄＥｔｈｎｏｐｈａｒｍａｅｙ・１３・

ＩＴＳ）。核糖体ＲＮＡ（ｒＲＮＡ）是细胞中最古老的分子之一，编码ｒＲＮＡ前体的基因即ｒＤＮＡ．是基因组ＤＮＡ中中等重复并有转录活性的基因家族。ＩＴＳ包括进化ｆ：高度保守的５．８ＳｒＤＮＡ和包含有ｒＤＮＡ前体加工信息的两个间隔区ＩＴＳ一１，ＩＴＳ一２。在ｒＤＮＡ多基因家族成员中，ＩＴＳ区是多拷贝，以串连重复方式出现在一个或多个染色体｜：；而且ＩＴＳ区两侧有高度保守序列存在，可以作为冬虫夏草遗传分析的主要靶标。Ｉ．２冬虫夏草菌种鉴定到底哪类菌藻类是真正的冬虫夏草。一直是有争议的。赵锦等采用特异引物扩增冬虫夏草（有性阶段）、中国被毛孢（无性阶段）、中国拟青霉（无性阶段）、古尼拟青霉（无性阶段）ＩＴＳｌ区的伞部序列和５．８ＳｒＤ－ＮＡ的部分序列。经ＰＣｇｅｎｅ和Ｐｈｙｌｉｐ软件分析计算不同种间的遗传距离序数，得出冬虫夏草与中国被毛孢的序列相似性为９７．８％，与中国拟青霉、古尼拟青霉的种间相似性分别为７２．６％和７２．９９％，这一结果从分子水平证明了中国被毛孢是冬虫夏草的无性型。李增智等以ＲＡＰＤ为分子指标，研究冬虫夏草和中国被毛孢的ＤＮＡ，发现其相似率为９６％，也提示中国被毛孢是冬虫夏草的无性型。事实上，冬虫夏草的有性型和无性型是冬虫夏草发育过程中的不同阶段，它们的ＤＮＡ是一致的，形态不同只是由于ｍＲＮＡ不同时期的表达不同所致。通过ＤＮＡ分子标记技术，可以快速、准确地确证冬虫夏草的无性型。

基因分析和比较也发现，青藏高原上各地产的冬虫夏草基因序列差别约为２％，冬虫夏草与中国被毛孢基因序列差别亦约２％，有趣的是冬虫夏草与虫草属其他虫草基因序列差别＞２０％，这与前述是一致的。基因序列差别＞２０％的两个生物物种相差有多远？用“相差十万八千里”形容并不过分。比如说，人与狗基因序列差别约为４％，而人与老鼠基因序列差别也只有约１０％。

１．３遗传学差异ＲＡＰＤ可以揭示野牛虫草群体遗传结构的差异，也能从分子水平上提供一些虫草的分类、起源及进化方面的依据。张云武等应用ＲＡＰＤ技术对滇西北地区冬虫夏革、阔孢虫草和蛹虫草的遗传分化研究。根据１８个随机引物获得的ＲＡＰＤ谱带进行的遗传距离分析表明，冬虫夏草与阔孢虫草和蛹虫草之间存在显著的遗传差异，云南虫草的不同地理群体间也存在着遗传分化。陈永久等对来自青藏高原三个区域的１３个冬虫夏草样本进行了ＲＡＰＤ分析，发现受试的１３个冬虫夏草样本中，来自同一地方的样本问遗传差异甚微，同一区域不同地方的样本问遗传差异较大，不同区域样本间的遗传差异最大。

１．４菌种的退化人工栽培虫革的另一个重要难题是菌种的退化。一般来说选育的菌种通常在使用半年到一年左右就有退化现象发牛。实际上，菌种退化是一个普遍性问题。李美娜等曾利用ＰＣＲ、ＲＦＬＰ和ＲＡＰＤ方法对野生驯化北东冲夏草（蛹虫草）及其退化菌种进行了基因水平的分析。ＰＣＲ、ＲＦＬＰ实验对两个菌种ＩＴＳ分析发现共有１３个位点发生碱基突变，且都为Ｃ转换为Ｔ。ＲＡＰＤ实验也表明所有供试个体均存在明显差异的引物。结果提示退化菌株较野牛驯化菌株在ＤＮＡ水平上发生了频率较高的突变。

２基因组学

有报道说已对冬虫夏草进行了全基因测定，但尚未见到正式公开的全序列。我国部分科学家通过对冬虫夏草遗传物质ＤＮＡ进行测序，共获得１００多条相关的特异ＤＮＡ序列，并建立起冬虫夏草ＤＮＡ数据库和分子鉴定体系。

ｃＤＮＡ文库是生物体表达基因信息的一个集合体，是获取未知功能基因的一种重要文库，是系统研究一种生物的基因结构和功能的基础。考虑到冬虫夏草是寄牛的复合体，刘燕南等分别构建了’冬虫夏草真菌子座部分及所寄生虫体部分的ｃＤＮＡ文库。其中冬虫夏草虫体部分的ｃＤＮＡ文库含有１．２８×１０６重组子、子座部分的ｃＤＮＡ文库含有１．０×１０６重组子，插入片断长度均在Ｏ．５ｋｂ～２ｋｂ之间。ｅＤＮＡ的构建可以通过现代基因组学的方法保存冬虫夏草的生物学信息，进而研究其有效组份并对其功能基因进行分析。

３活性成分与相关基因

冬虫夏草是我国传统名贵中药，多年来对其化学成分及药理作用研究甚多，但其作为中药应用的确切生物活性成分及相关的毒理、药理作用原理和分子生物学作用机制仍不清楚。目前已有多个活性物质的相关基因获得克隆及特征分析。

虫草素（３’一脱氧腺苷）是冬虫夏草和蛹虫草（又名北冬虫夏草）的重要活性成分之一，据国内外相关文献披露，具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤及降ｍ脂等功效。不过虫草素在天然冬虫夏草中含量极低，通过人工技术培育高产虫草素菌株也是一个很好的思路。中炬高新技术实业（集团）股份曾开展《冬虫夏草功能基因应用开发的研究》项目。通过人工诱变筛选，运用基因工程技术，培育出高产虫草素的菌株，虫草素含量高出普通虫草１３倍。并从该菌株中克隆到７个虫草素生物合成相关基因。

冬虫夏草还具有较强的抗氧化能力，这可能与超氧化物歧化酶（Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅｄｉｓｍｕｔａｓｅ，ＳＯＤ）有关。ＳＯＤ是牛物体内抗氧化的重要酶类，存在于粒线体和细胞质中，在真核生物中多与铜ｃｕ和锌ｚｎ离子结合，它可清除或减少超氧自由基。因此，ＳＯＤ具有调节牛理机能、青春永驻、养颜美容等延长人体寿命的功能。利用分子生物学技术从北冬虫夏草（蛹虫草）中首次克隆到活性成分ＳＯＤ的基因。

Ｚｈａｎｇ等从冬虫夏草中也克隆了２个糜蛋白酶样丝氨酸蛋白酶Ｃｓｐｌ和ｃｓｐ２的基因。Ｃｓｐｌ和Ｃｓｐ２属同一蛋白酶家族，在ｃＤＮＡ和氨基酸水平上的差异分别是７２．９％和６８．９％。这两种酶均可降解蝙蝠科昆虫幼虫表皮蛋白。

４结语

由于近年来人为的过度采挖，作为我国特有的中药材冬虫夏草的前景堪忧，应加大对冬虫夏草的保护，一方面限制采挖或禁采，另一方面应加强冬虫夏草的遗传学研究，构建冬虫夏草的遗传图谱、ｃＤＮＡ库并进行全序列测定，大力开展人工栽培或发酵技术，对部分特异活性成分应用基因工程技术进行扩大牛产。这样既能保护野生冬虫夏草资源，又能提高虫草资源的利用价值。

参考文献

［１］梁宗琦．我国虫草属真菌研究开发的现状及思考［Ｊ］．食用菌学报，２００１，８．

［２］凌建亚，彭俊峰，张晗星，等．核糖体ＤＮＡＩＴＳ区应用于虫草属无性型鉴定的初步研究［Ｊ］．山东大学学报（理学版），２００３，３８．［３］宋敦伦，张军，陈建新．ＤＮＡ分子标记及其在冬虫夏草研究中的应用［Ｊ］．食用菌学报２００２，９．

（收稿日期：２００９．０８．１５）

万方数据