Protein G层析填料说明书
Protein A G免疫沉淀磁珠使用说明书
Protein A/G免疫沉淀磁珠Figure 1. General Protocol for ImmunoprecipitationcomplexSDS-PAGE loading buffer Neutralize bufferMagnetic Beads antibodyMagnetic Separator Remove supernatant Pipette Repeat45产品组分产品参数：磁珠粒径100 nm，浓度10 mg/mL，结合量>400 μg human IgG/mL2-8℃保存，保质期2年。
储存方法实验步骤1. 抗原样品制备本操作说明书提供以下三种样品处理方法。
2. 磁珠预处理将磁珠漩涡振荡1 min，使其充分混悬；取25~50 µL磁珠悬液置于1.5 mL EP管中。
加入200 µL结合缓冲液洗涤，进行磁性分离（将离心管置于磁力架上，管底对准①卡口压紧，静置2分钟或待磁珠吸附于管壁），吸弃上清。
抽出②磁条，加入200 µL结合缓冲液重复洗涤一次，插回②磁条，磁性分离并吸弃上清。
加入200 µL结合缓冲液重悬磁珠备用。
血清样品处理：若目标蛋白丰度较高， 建议用结合缓冲液稀释血清样品至目标蛋白终浓度为10~100 µg/mL，置于冰上备用（或置于-20℃长期保存）。
悬浮细胞样品处理：离心收集细胞（4℃, 500 g, 10 min），弃上清后称重，按每毫克细胞50 µL的比例用1×PBS洗涤2次；按每毫克细胞5~10 µL的比例加入结合缓冲液，同时加入蛋白酶抑制剂，混匀后置于冰上处理10 min；离心收集上清液（4℃, 14000 g, 10 min），置于冰上备用（或置于-20℃长期保存）。
贴壁细胞样品处理：移去培养基，按每1.0×105个细胞150 µL的比例用1×PBS洗涤两次；用细胞刮棒刮脱细胞，收集至1.5 mL EP管内，按每1.0×105个细胞20~30 µL的比例加入结合缓冲液，同时加入蛋白酶抑制剂，混匀后置于冰上处理10 min；离心收集上清液（4℃, 14000 g, 10 min），置于冰上备用（或置于-20℃长期保存）。
Protein G Agarose 说明书
Protein G Agarose产品编号产品名称包装Agarose 2ml P2009 ProteinG产品简介：¾本Protein G Agarose为进口分装，主要用于免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP)或免疫共沉淀(Co-IP)，也可以用于抗体的纯化。
¾Protein G Agarose适合于免疫沉淀mouse IgG1，IgG2a, IgG2b, IgG3, rat IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG2c, rabbit and goat polyclonal Abs, 以及human IgG1, IgG2, IgG3和IgG4。
¾Protein G共价交联到4% agarose beads上，2ml Protein G Agarose中共含有约2mg重组的Protein G。
2 ml Protein G Agarose共可以结合约11mg human IgG。
¾Protein G Agarose配制在TBS溶液中，含0.05%叠氮钠，2ml中共含有0.5ml Agarose beads。
¾本Protein G Agarose如果用于常规的免疫沉淀，可以免疫沉淀100次。
包装清单：产品编号产品名称包装Agarose 1ml/管，共2管GP2009 Protein—说明书1份保存条件：4℃保存，一年有效。
注意事项：¾请勿冷冻保存本产品。
¾Protein G Agarose使用前一定要充分重悬，即充分颠倒若干次使混合均匀。
¾从蛋白样品收集开始，所有步骤中蛋白样品都必须在4℃或冰上操作。
¾为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
使用说明：1.免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP)：A.蛋白样品的准备：A1. 对于10厘米细胞培养皿中的贴壁细胞，吸除细胞培养液，PBS洗涤一次，然后加入500微升至2毫升细胞裂解液裂解细胞。
层析填料选择
A = Macroprep High Q B = Fractogel EMD, TMAE 650 C = SuperQ 650 D = Q HyperD E = STREAMLINE Q XL F = Q Sepharose XL
19 / GE /
MacroCap SP
－－专为较大的生物分子设计的阳离子交换填料 •特别适合PEG修饰后的蛋 白的纯化
10 / GE /
Sepharose 系列填料
－快速大分子凝胶过滤首选 • Sepharose的结构：
β-D-半乳糖和3,6-脱水-L-半乳糖交替结合所形成的线 性多聚糖。 在形成过程中由单独的多糖链先形成双螺旋，然后聚 集成胶束，胶束之间形成微孔，其大小取决于胶束的 多少，即琼脂糖的浓度。 pH为4-9之间稳定。 琼脂糖凝胶对样品的吸附 作用很小，并且机械强度 和孔穴稳定性都很好。 Sepharose: Separation Pharmacia agrose
Mono P：专为层析聚焦设计的弱阴离子交换填料
21 / GE /
Capto基架系列离子交换填料
－－新一代快流速高载量填料
+
基架 • • • • 表面延伸剂
+
O
SO
3
配基:磺酸乙烷基
改良交联琼脂糖---刚性更强、传质速度更快 线状葡聚糖表面延伸剂---载量提高 颗粒大小：平均90um,75um,40um 配基：Q、S、DEAE、Adhere、MMC、ImPres
7
2 4 5 3 6
100,000 1,000,000 10,000,000
1. Superdex™ Peptide 2. Superdex 75 3. Superdex 200 4. Sephacryl™ S-100 HR 5. Sephacryl S-200 HR 6. Sephacryl S-300 HR 7. Sephacryl S-400 HR
rProtein A层析填料说明书
rProtein A Sepharose Fast Flow原理蛋白质A来自金黄色葡萄球菌属，包含5个区域，可以用来结合IgG的Fc区域。
作为一个亲和配基，蛋白质A偶联到Sepharose上，似的这些区域可以结合游离的IgG分子。
一份子的蛋白质A可以至少结合两分子的IgG。
尽管蛋白质A主要是与人类免疫球蛋白IgG进行结合，一些其他类型的免疫球蛋白也显示出能够结合蛋白质A。
蛋白质A能够与人初乳IgA发生相互作用，同时也可以和人类的骨髓瘤IgA2发生反应，但是不能与IgA1发生反应。
一些人类的单抗IgMs和一些来自正常的和巨球蛋白血症血清中的IgMs能够结合蛋白质A。
进行一个分离操作结合缓冲液：20mM磷酸纳，pH7.0洗脱缓冲液：100mM柠檬酸-柠檬酸钠，pH3~6中和缓冲液：1M Tris-HCl，pH9.01，用5倍柱体积的蒸馏水冲洗柱子。
2，用5倍柱体积的结合缓冲液平衡柱子。
3，上样，流速为1-4ml/min（1ml的柱子），或者5ml/min（5ml的柱子）。
收集流穿片段。
4，用5-10倍柱体积的结合缓冲液平衡分离柱，直到基线，即所有未结合物质都被冲洗出柱子（紫外检测器在280nm波长检测）。
5，用5倍柱体积的洗脱缓冲液进行洗脱。
洗脱液立即用中和缓冲液（0.06ml~0.2ml 1M Tris-HCl，pH9.0每毫升馏分）中和至中性。
6，立即用5-10倍体积的结合缓冲液重新平衡柱子。
使用注意1，样品需要离心（10000g/20min）去除细胞和细胞碎片。
离心下来的上清经过一个0.45μm 的滤膜过滤。
2，来自多数物种的IgGs和亚类，在接近生理pH值和离子强度的条件下，可以结合到蛋白质A上。
如果蛋白质和配基之间的互相作用较弱，应该避免过度冲洗，因为这样可能会减少最终的产量。
3，对于一些抗体，比如小鼠IgG，当使用蛋白质A进行纯化时，可能需要向结合缓冲液中加入3M的氯化钠，达到最有效的结合，例如1.5M的甘氨酸和3M的氯化钠，pH为8.9。
实验室层析填料应用指南
咨询热线：800-810-9118 400-810-9118 网址：
3
层析介质应用
2、分子筛技术：是利用多肽分子大小、形状差异来分离 纯化多肽物质。Superdex peptide 专门分离多肽类产品 的高分辨率分子筛凝胶，分离的分子量范围为 100-7000 Da。高化学稳定性 , pH 1-14, 兼容有机溶剂 ( 乙腈 +TFA)。
• 如果反相和离子交换技术都效果不好，原因可能是溶解 性的问题。
• 使用凝胶过滤如 Superdex peptide，Sephadex LH20 都 很好的用在多肽纯化中。
• 需要增加选择性，载量和稳定性：用多维纯化方法，可 以将离子交换，分子筛和反相层析等多种技术结合，而 代替一步反相或反复用反相柱子纯化。
常见的重组细胞因子有：干扰素（Interferon,IFN）、肿瘤 坏死因子（tumor necrosis factor, TNF）、集落刺激因子 （colony-stimulating factor）、趋化因子（chemokine）、 生长因子（growth factor, GF）、白细胞介素系列（interleukin, IL) 等。
4
咨询热线：800-810-9118 400-810-9118 网址：
GE 生命科学部层析技术应用部
二、多肽分离技术的综合运用
对于大多数的多肽来说，仅仅一步纯化或一种技术应用 是不够的，通常会将反相，离子交换和凝胶过滤这三种 技术综合起来进行多步纯化，最终达到高的分辨率。 例 1 、PY574a 多肽，14aa，pI>10, 在酸性条件下不溶。
一、原核表达细胞因子的纯化工艺
1、重组人干扰素 α2b(rh-IFNα2b) 的纯化：
大肠杆菌发酵
蛋白质层析新填料应用与选择
mPAI-1-(his)8
secreted
into
GIBCO™
CD
CHO
RESULTS
Blue – Ni Sepharose excel packed in Tricorn ™ 5/50:
Purity >98%
Green - Ni Sepharose 6 FF packed in Tricorn 5/50:
-目标物穿透
-进入孔内的小分子被捕捉 -通过CIP再生
Capto Core 700 优点:
• 高纯度和高回收率 • 高载样量和更短的接触时间 • 操作灵活适合工艺放大
高生产能力的同时提高工艺 的经济性
Capto Core 700 vs Gel Filtration
LAIV virus purification
蛋白质层析新填料应用与选择
Imagination at work.
做好分离纯化需要什么？
层析设备
控制软件
技术方案
填料
生物分子特性
Ion exchange chromatography (IEX) 离子交换层析
净电荷 生物学亲和性 Tag, PTM
疏水性 大小/体积
Affinity chromatography (AC) 亲和层析
Ni Sepharose™ excel EDTA的耐受性
Ni Sepharose excel 可耐受100 mM EDTA 2 h
Column: HisTrap™ excel 1 ml
Smaemdipulme:,2p5H06m.8l,plaroteCrPsUu-p(hpilse)8mseenctreedtewdiitnhto0
Conventional workflow
ProteinA and ProteinG 简单说明
Protein A与Protein G一、Protein A和Protein G应用蛋白A、蛋白G是微生物来源的天然蛋白质，可以和哺乳动物的免疫球蛋白结合,基于这一特性，蛋白A、蛋白G的主要应用是在：1 纯化抗体: 将这些蛋白偶联于支持物上，提供了纯化抗体的有效方法。
2 免疫沉淀(immunoprecipitation): 利用蛋白A、蛋白G和免疫球蛋白的Fc段的结合，把Ag-Ab复合物分离出来，从而达到从蛋白复合物中分离出特定蛋白进行下一步的研究分析或者研究蛋白质-蛋白质之间的相互作用。
3 去除或减少非特异性背景：如免疫沉淀技术中在加入特异性抗体前加protein A/G beads到细胞裂解液中，以减低背景。
蛋白A、蛋白G与不同的免疫球蛋白的结合能力并不一样，它们受到后者的来源及亚类的影响。
目前，绝大多数的IgG纯化使用Protein A、Protein G亲和层析，它们是来自于不同微生物的蛋白质，对于IgG具有特异性的亲和作用，而对于其他杂蛋白没有或者只有很弱的结合，因此具有极高的选择性。
通常，仅凭Protein A、Protein G一步亲和层析就可达到90%的纯度。
Protein A和Protein G的多个结构域可与IgG结合二、它俩跟免疫球蛋白结合的情况Protein A :Protein A是一种金黄色葡萄球菌细胞壁蛋白质，与多数哺乳动物的IgG Fc段结合（主要是IgG，包括：人、山羊、绵羊、兔、豚鼠、马、猪、猴、小鼠等），不与狗IgG结合、不结合人IgM、IgD、和IgA。
因而，将Protein A 与琼脂糖凝胶以一定的方式结合，可制备用于抗体纯化的亲和填料。
天然的Protein A，42kDa，含有四个Ig Fc结合位点，其中2个是有活性的，A，无动物来源组分，载量约30mg人IgG/ml。
而用于纯化抗体的，一般是重组的protein A，含有4个Ig Fc区域结合位点。
Protein G：是由G群链球菌株产生的一种细胞壁成分，可结合很多种免疫球蛋白的Fc部分。
rProtein G Beads使用说明
样品在上样前建议离心或用 0.22μm 或 0.45μm 滤膜过滤，减少杂质，提高蛋白纯化效率和
防止堵塞柱子。
3、 样品纯化
1)将 rProtein G Beads 装入合适的层析柱，层析用 5 倍柱体积的结合 Buffer 进行平衡，
使填料处于与目的蛋白相同的缓冲体系下，起到保护蛋白的作用。
2)将样品加到平衡好的 rProtein G Beads 中（保证目的蛋白与 rProtein G Beads 充
Protein G — — —
IgG1
++++
++++
IgG2
++++
++++
IgG3
—
++++
IgG4
++++
++++
IgM
varible
—பைடு நூலகம்
Avianeggyolk
IgY
—
—
Cow
++
++++
Dog
++++
++
Goat
—
++++
Guineapig
IgG1
往往造成流速和结合载量都下降，严重影响柱子的性能，这时需要对树脂进行清洗。
去除一些沉淀或变性物质:
用 2 倍柱体积的 6M 盐酸胍溶液进行清洗，然后立即用 5 倍柱体积的 PBS,pH7.4 清洗。
Protein A G MagBeads 技术手册说明书
Protein A/G MagBeads Cat. No. L00277Technical Manual No. TM0249 Version 08212013 Index1.Product Description2. Instruction For Use3.Troubleshooting4. General Information1.Product Description1.1Intended UseGenScript Protein A/G MagBeads are ideal for small‐scale antibody purification and immunoprecipitation (IP) of proteins, protein complexes or other antigens.1.2PrincipleThe sample containing antibody is added to the Protein A/G MagBeads. The antibody will bind to beads during a short incubation. Then the beads‐bound antibody may be eluted from the beads by using a magnetic separation rack, or used for immunoprecipitation (IP). A cross‐linking procedure may be needed before IP to prevent co‐elution of the primary antibody. Magnetic separation eliminates the changes of micro tubes, minimizes the loss of sample and removes excessive steps of traditional centrifugation method.1.3Description of MaterialMaterial SuppliedGenScript Protein A/G MagBeads are super paramagnetic beads of average 40 μm in diameter, covalently coated with recombinant Protein A/G. The beads are supplied as 25% slurry in phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4, containing 20% ethanol. The Protein A/G MagBeads have a binding capacity of more than 10 mg Goat IgG per 1 ml settled beads (e.g. 4 ml 25% slurry).Protein A/G is a genetically engineered protein (MW≈43 kDa) that combines the IgG binding sites of both Protein A and Protein G. 6×His‐tag was attached to its N‐terminal to facilitate the purification. The secreted Protein A/G contains four Fc‐binding domains from Protein A and two from Protein G, making it a more universal tool to bind and purify immunoglobulins.Cat. No. L00277 Size: 2 ml.Additional Material RequiredMixing/Rotation DeviceMagnetic Separation RackTest tubes and pipettesBuffers and solutions (see below)Additional Buffers NeededBinding/Wash Buffer: 20 mM Na2HPO4, 0.15 M NaCl, pH 7.0Elution Buffer: 0.1 M glycine, pH 2‐3Neutralization Buffer: 1 M Tris, pH 8.51×SDS Sample Buffer: 62.5 mM Tris‐HCl (pH 6.8 at 25°C), 2% w/v SDS, 10% glycerol, 50 mM DTT,0.01% w/v bromophenol blue2.Instruction For UseThe protocol uses 100 μl Protein A/G MagBeads, this may be scaled up or down accordingly.2.1Preparation of the MagBeadspletely resuspend the beads by shaking or vortexing the vial.2.Transfer 100 μl beads into a clean tube.3.Place the tube on a magnetic separation rack to collect the beads. Remove and discard the supernatant.4.Add 1 ml Binding/Wash Buffer to the tube and invert the tube several times to mix. Use the magnetic separationrack to collect the beads and discard the supernatant. Repeat this step twice.2.2Separation of Target IgG1.Resuspend the beads in 100 μl Binding/Wash Buffer.2.Add the sample containing target IgG to the tube and gently invert the tube to mix.3.Incubate the tube at room temperature with mixing (on a shaker or rotator) for 30 – 60 minutes.e the magnetic separation rack to collect the beads and discard the supernatant. If necessary, keep thesupernatant for analysis.5.Add 1 ml Binding/Wash Buffer to the tube and mix well, use the magnetic separation rack to collect the beads anddiscard the supernatant. Repeat the wash step three more times.6.Proceed to elution of isolated IgG (Section 2.3).2.3Elution of Isolated IgG1.Add 100 μl Elution Buffer to the tube and mix well. Incubate for five minutes at room temperature with occasionalmixing.e the magnetic separation rack to collect the beads and transfer the supernatant that contains the eluted IgG intoa clean tube.3.Repeat Step 1 and 2 twice.4.Add 10 μl of Neutralization Buffer to each 100 μl eluate to neutralize the pH. If needed, perform a buffer exchangeby dialysis or desalting.2.4ImmunoprecipitationBound IgG will be co‐eluted along with the target when using elution methods. If the presence of IgG does not disturb desired detection system, go directly to section 2.4.2 below. For applications where co‐elution of the IgG is not desired, the primary IgG can be cross‐linked to the Protein A/G MagBeads as described in section 2.4.1 below.2.4.1Cross‐linking IgG to the Beads1.Add 1 ml 0.2 M triethanolamine, pH 8.2 to the Protein A/G MagBeads with immobilised IgG. Wash twice using themagnetic separation rack with 0.2 M triethanolamine, pH 8.2 as the washing buffer.2.Resuspend the beads in 1 ml of 20 mM dimetyl pimelimidate dihydrochloride (DMP) in 0.2 M triethanolamine, pH 8.2(5.4 mg DMP/ml buffer). This cross‐linking solution must be prepared freshly.3.Incubate the beads with rotational mixing for 30 minutes at room temperature. Use the magnetic separation rack tocollect the beads and discard the supernatant.4.Resuspend the beads in 1 ml of 50 mM Tris, pH 7.5 to stop the reaction and incubate for 15 minutes at roomtemperature with rotational mixing.e the magnetic separation rack to collect the beads and discard the supernatant.6.Wash the cross‐linked beads three times with 1 ml PBS, pH7.4.2.4.2Binding Antigen to the IgG Cross‐linked Beads1.Add sample containing target antigen to the beads. For a 100 kD protein, use a volume containing approximate 25 µgtarget antigen/ml beads to assure an excess of antigen. If dilution of antigen is necessary, PBS or 0.1 M phosphate buffer (pH 7‐8) can be used as dilution buffer.2.Incubate with tilting and rotation for one hour at room temperature.3.Place the tube on the magnetic separation rack for 2 minutes to collect the IgG‐coated Beads‐target complex. Forviscous samples, double the time on the rack. Discard the supernatant.4.Wash the beads 3 times using 1 ml PBS.2.4.3Elution of Target ProteinA.Denaturing elution1.Place the tube from section2.4.2 on the magnetic separation rack to collect the beads and discard the supernatant.2.Add 100 µl 1XSDS Sample Buffer to the tube and mix well.3.Heat the tube at 100°C for five minutes.e the magnetic separation rack to collect the beads and transfer the supernatant containing desired sample into anew tube.5.Analyze the sample by SDS‐PAGE followed by Western blot analysis.B.Non‐denaturing elution1.Place the tube from section2.4.2 on the magnetic separation rack to collect the beads and discard the supernatant.2.Add 100 µl Elution Buffer to the tube and mix well. Incubate for five minutes at room temperature with occasionalmixing.e the magnetic separation rack to collect the beads and transfer the supernatant into a new tube.4.Repeat Step 2 and 3 twice.5.Add 10 μl Neutralization Buffer to each 100 μl of eluate to neutralize the pH.3.TroubleshootingReview the information below to troubleshoot your experiments using the GenScript Protein A/G MagBeads. Problem Possible Cause SolutionThe beads are difficult toimmobilize using the magneticseparation rack.Too many beads are used.Decrease the volume of MagBeadssuspension.A considerable amount of samplehas been added, but very fewspecific antibody of interest isdetected.The antibody of interest is at verylow concentration.Use a serum‐free medium for cellsupernatant samples.Affinity‐purify the antibody using itsspecific antigen coupled to anaffinity supporting material.The antibody of interest is purified,but it is degraded (as determined byloss of function in downstreamassay).The antibody is sensitive to low‐pHelution buffer.The downstream application issensitive to the neutralized elutionbuffer.Try another elution reagent, such as3.5 M MgCl2, 10 mM phosphate, pH7.2.Desalt or dialyze the eluted sampleinto a suitable buffer.No antibody is detected in anyeluate.The antibody in the sample cannotbind to Protein A/G.Try GenScript Protein A MagBeadsor Protein G MagBeads.4.General Information4.1Storage and StabilityThis product is stable until the expiration date stated on the COA, when stored unopened at 2–8°C. Do not freeze the product. Keep the MagBeads in liquid suspension during storage and all handling steps. Drying will cause loss of binding capacity and result in reduced performance. Resuspend the beads well before use. Be careful to avoid bacterial/fungal contamination.4.2Technical SupportPlease contact GenScript for further technical information (see contact details). Certificate of Analysis/Compliance is available upon request. The latest revision of the package insert/instructions for use is available on .4.3Warning and LimitationsThis product is for research use only. Not intended for any animal or human therapeutic or diagnostic use unless otherwise stated. This product contains 20 % EtOH as a preservative. Flammable liquid and vapor. Flash point 38°C. R‐10 flammable. Material Safety Data Sheet (MSDS) is available at .4.4Related MagBeads ProductsCat. No. Product NameL00273 Protein A MagBeadsL00274 Protein G MagBeadsL00295 Ni‐Charged MagBeadsL00327 Glutathione MagBeadsL00275 Mouse Anti‐His mAb MagBeadsL00336 Mouse Anti‐GST mAb MagBeadsGenScript USA Inc.860 Centennial Ave.,Piscataway, NJ 08854Toll‐Free: 1‐877‐436‐7274Tel: 1‐732‐885‐9188, Fax: 1‐732‐210‐0262Email: *********************Web: 。
纳微科技NMabTM Pro Protein A 亲和层析介质使用说明书
NMab TM Pro Protein A亲和层析介质产品使用说明书文件编号：NM-W-DF-0603版本号：A2NMab TMPro 层析介质使用说明产品简介Protein A 亲和层析是利用Protein A 配基与目标抗体具有专一结合力作用从而达到分离纯化抗体的目的。
Protein A 亲和层析大大简化抗体下游分离纯化工艺，成为抗体分离纯化的标准。
目前市场上的Protein A 亲和层析介质主要分为以多糖（琼脂糖、葡聚糖、纤维素）为基质和以合成高分子（聚丙烯酸酯，丙烯酰胺）为基质两大类。
琼脂糖基质在溶胀状态下具有网状结构，比表面积大，因而亲和载量比较高，但机械强度不高、耐压低。
随着上游发酵技术的进步，抗体表达量越来越高，下游亲和捕获成为抗体生产瓶颈，因此对下游Protein A 亲和层析介质的载量要求越来越高。
为了因应这一需求，纳微科技以琼脂糖为基球，利用特有的微球改性技术以增强其机械强度，并结合自主产权的Protein A图1. NMab TM Pro Protein A 亲和层析介质电镜图配基技术，在NMab TM Protein A 的基础上成功开发出比其具有更高载量的NMab TM Pro Protein A 亲和层析介质。
除了高载量外，NMab TM Pro 延续了其优良的结合特异性、耐碱性以及压力-流速特性，是抗体客户降低单抗纯化成本的最佳选择。
下表1是NMab TM Pro Protein A 层析介质的基本性质参数。
相较市场同类产品有如下独特优势：(a) 载量高：一般单抗项目平均动态载量约60-80 mg/mL ；(b) 耐碱性强：0.5 M NaOH 浸泡下24小时载量只下降20%；(c) 配基脱落低：小于20 ppm ；(d) 宿主蛋白（HCP ）残留低：一般在1000 ppm 以内，表现不亚于Prism A ； (e) 回收率高：大于90%；(f) 纯度高：亲和洗脱液纯度99 %以上；(g) 压力流速好：明显强于传统4FF/6FF 系列介质；表1. 纳微科技NMab TM Pro Protein A 亲和层析介质技术参数压力流速曲线测试不同流速下压力变化如下，此压力-流速特性可满足工业生产上对填料流速要求，优于传统4FF/6FF 软胶系列填料。
层析填料选择
27 / GE /
Capto MMC
－－耐高盐浓度的弱阳离子交换凝胶
SOURCE Capto sepharo新se一代填料是 什么呢？
1960
1970
1980
1990
2000
填料的基本特点
• 五大类层析技术 – 凝胶过滤 (GF) – 离子交换 (IEX) – 亲和层析 (AC) – 疏水层析 (HIC) – 反相层析 (RPC)
• 基架 - 颗粒越细、大小越均匀，分辨率越高，但反压亦较高 (SOURCE基架例外)
－－新一代快流速高载量填料
+
基架
表面延伸剂
+O
-
SO3
配基:磺酸乙烷基
• 改良交联琼脂糖---刚性更强、传质速度更快 • 线状葡聚糖表面延伸剂---载量提高 • 颗粒大小：平均90um,75um,40um • 配基：Q、S、DEAE、Adhere、MMC、ImPres
22 / GE /
Capto基架刚性更强
mg BSA/ml
250
200
150
100
50
0 ABCDEF
A = Macroprep High Q B = Fractogel EMD, TMAE 650 C = SuperQ 650 D = Q HyperD E = STREAMLINE Q XL F = Q Sepharose XL
19 / GE /
Sephacryl S系列填料
ProteinG层析填料说明书
ProteinG层析填料说明书Protein G Sepharose Fast Flow原理蛋白质G ，来自G 链球菌组的细胞表面蛋白，是III Fc-受体型蛋白。
蛋白质G 通过非免疫机制结合抗体的Fc 区域。
蛋白质G 特异性的结合IgG 的Fc 区域，但是对于一些多克隆抗体IgGs 对人源的IgG 抗体能够有更强的结合。
在标准缓冲液条件下，蛋白质G 能够结合所有的人源性的亚类抗体和所有鼠源性的IgG 亚类抗体，包括鼠的IgG ，或者兔的IgGa 和IgGb 。
进行一个分离操作结合缓冲液：20mM 磷酸纳，pH7.0洗脱缓冲液：100mM 甘氨酸，pH2.7中和缓冲液：1M Tris-HCl ，pH9.01，用5倍柱体积的蒸馏水冲洗柱子。
2，用5倍柱体积的结合缓冲液平衡柱子。
3，上样，流速为1-4ml/min （1ml 的柱子），或者5ml/min （5ml 的柱子）。
收集流穿片段。
4，用5-10倍柱体积的结合缓冲液平衡分离柱，直到基线，即所有未结合物质都被冲洗出柱子（紫外检测器在280nm 波长检测）。
5，用5倍柱体积的洗脱缓冲液进行洗脱。
洗脱液立即用中和缓冲液（0.06ml~0.2ml 1MTris-HCl ，pH9.0每毫升馏分）中和至中性。
6，立即用5-10倍体积的结合缓冲液重新平衡柱子。
使用注意1，样品需要离心（10000g/20min ）去除细胞和细胞碎片。
离心下来的上清经过一个0.45μm的滤膜过滤。
2，来自多数物种的IgGs 和亚类，在接近生理pH 值和离子强度的条件下，可以结合到蛋白质G 上。
对于特别物种IgG 的最佳结合条件，应该查阅近期的文献。
3，当pH 值为2.7或者低于2.7时，大多数种类的免疫球蛋白能从蛋白质G 上被洗脱下来。
4，洗脱完成后，立即用5-10倍体积的结合缓冲液重新平衡柱子非常重要。
在通常使用的水溶性缓冲液中都是稳定的。
储存用20%的乙醇在中性pH值的条件下冲洗介质和柱子，在4°~8°条件下储存。
大鼠免疫球蛋白g(lgG)说明书北京驰明瑞生物
大鼠免疫球蛋白G(IgG)酶联免疫分析试剂盒使用说明书本试剂盒仅供研究使用产品编号：CSB-E07981r检测范围：15.6 ng/ml - 1000 ng/ml最低检测限：3.9 ng/ml特异性：本试剂盒可检测大鼠的IgG，与其他相关蛋白无交叉反应。
有效期：6 个月预期应用：ELISA法定量测定大鼠血清、血浆或其它相关生物液体中IgG 含量。
说明1. 试剂盒保存：-20℃（较长时间不用时）；2-8℃（频繁使用时）。
2. 浓洗涤液低温保存会有盐析出，稀释时可在水浴中加温助溶。
3. 中、英文说明书可能会有不一致之处，请以英文说明书为准。
4. 刚开启的酶联板孔中可能会含有少许水样物质，此为正常现象，不会对实 验结果造成任何影响。
实验原理用纯化的IgG 包被微孔板，制成固相载体，往包被有IgG 的微孔中依次加入标本或标准品、HRP 标记的抗IgG 特异性抗体，混匀后温育。
经过彻底 洗涤后用底物TMB 显色。
TMB 在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸 的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的IgG 呈负相关。
用酶标 仪在450nm 波长下测定吸光度（OD 值），计算样品浓度。
试剂盒组成及试剂配制1. 酶联板(Assay plate )： 一块（48孔）。
2. 标准品（Standard）： 1 瓶(冻干品)。
3. 样品稀释液(Sample Diluent)： 1×20ml/瓶。
4. 辣根过氧化物酶标记抗体稀释液（HRP- antibody Diluent）1×10ml/瓶。
5. 辣根过氧化物酶标记抗体（HRP-antibody）： 1×30μl/瓶（1：100）。
6. 底物溶液（TMB Substrate）： 1×10ml/瓶。
7. 浓洗涤液（Wash Buffer） 1×20ml/瓶，使用时每瓶用蒸馏水稀释25 倍。
8. 终止液（Stop Solution）： 1×10ml/瓶。
Protein G亲和介质说明书
国家生化工程技术研究中心（北京）地址：北京市海淀区中关村北二条1号中国科学院过程工程研究所西区 电话/传真：010- 82544957 邮编：100190Protein A 亲和介质（Protein G QZT 4FF ）产品说明书1. 产品简介Protein G 能特异性地与抗体的Fc 区结合，所以Protein G 亲和介质可用于抗体（单抗和多抗）的分离纯化，经过一步亲和层析，即可从腹水、血清和培养液等样品中得到高纯度的抗体。
Protein G QZT 4FF 亲和介质以自制的琼脂糖凝胶为基质，以重组Protein G 为配基，具有很高的物理化学稳定性，配基不易脱落，寿命长，使用方便，应用广泛。
2. 产品特性3. 使用方法Protein G QZT 4FF 广泛用于各种抗体的分离纯化。
层析操作通常包括装柱、平衡、进料、淋洗、洗脱、再生等步骤。
平衡：用5~10CV 的平衡缓冲液（20 mM PB+0.15M NaCl ，pH 7.0，添加适当浓度的NaCl 抑制非特异性吸附）平衡层析柱，至流出液电导和pH 不变（与平衡液一致）。
进料：样品缓冲液应尽可能与平衡液一致。
固体样品可用平衡液溶解配制；低浓National Engineering Research Center forBiotechnology (Beijing)Add ：No.1 Bei er tiao, Zhongguancun, Haidian District, Beijing, ChinaTel/Fax ： 010- 82544957 Post code ：100190度样品溶液可用平衡液透析；高浓度样品溶液可用平衡液稀释。
为了避免堵塞层析柱，样品应经离心或微滤（0.45μm ）处理。
进料量根据介质的载量和料液中目标蛋白的含量计算。
淋洗：上样完毕后继续用平衡缓冲液淋洗至基线。
洗脱：用洗脱缓冲液（20 mM 柠檬酸，pH 2.5-3.5；或0.1M 甘氨酸，pH 3.0；或20 mM 乙酸钠，pH 3.0；具体洗脱条件与抗体的结合强度和稳定性密切相关，效果不好时应进行洗脱缓冲液（种类和pH 或添加剂）的优化）洗脱，收集流出液。
P5286ProteinG亲和层析预装柱使用说明
脂质结合（疏水性结合）
提示：不论哪一种清洗方法，推荐采用反向冲洗以驱赶柱中微粒，防止柱子下部分受到污染。 消毒 消毒的目的是降低柱子中微生物的污染。所有的柱子都应定期进行消毒，方法如下： • • 用含 0.1 M 醋酸的 20%乙醇洗柱子并保持 1 小时，然后用无菌 PBS 或平衡缓冲液冲洗至 少 5 个柱体积。 用 70%乙醇洗柱子， 并保持 12 小时， 然后用无菌 PBS 或平衡缓冲液冲洗至少 5 个柱体积。
Protein G ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ + ++ + ++ – + –
Protein A ++ ++ – ++ ++ + – + ++ – ++ ++ – + –
缓冲液的准备 推荐采用下列缓冲液： 上样缓冲液：20 mM 磷酸盐缓冲液，含 0.15 M NaCl，pH 7.0~7.5 洗脱缓冲液：0.1 M 甘氨酸盐酸盐缓冲液，pH 2.5~3.6 注意： 配制缓冲液所用的水及各种试剂必须为高纯度的，并且使用前需经过 0.22 μm 或 0.45 μm 滤膜 过滤。 样品准备 如果需要，可采用下列方法调整样品至上样缓冲体系中： • 用上样缓冲液稀释样品 • 通过凝胶色谱法进行缓冲液置换 样品在进样前需经过 0.45 μm 滤膜过滤或者离心，以避免微粒杂质堵塞柱子，延长柱子使用寿 命。 纯化步骤 1 2 3 4 取下预装柱顶端堵头，将其接入色谱系统中或注射器上，操作时应避免空气进入柱中； 取下预装柱底部堵头，用至少 5 个柱体积的纯水或上样缓冲液将柱子中乙醇冲洗出； 用 10 个柱体积的上样缓冲液平衡柱子，流速 1ml/min（1ml 预装柱）或 5ml/min（5ml 预 装柱） ； 通过泵或者注射器上样；
M5 Protein G Sepharose 使用说明书
101422-186M5Protein G Sepharose 使用说明书产品名称单位货号M5Protein G Sepharose 1ml MF099-G-01【STORAGE 】Store at 4°C.Stable for one year from the date of shipment.【产品简介】本产品为重组Protein G 与Sepharose 偶联后产物，可从血清，腹水，细胞培养上清和细胞抽提物中分离和纯化多种哺乳动物不同亚型的抗体或包含抗体Fc 片段的基因工程重组蛋白。
Protein G 是链球菌(group C 和G)细胞表面蛋白。
它与Protein A 类似，通过与免疫球蛋白的Fc 区相互作用，可结合大多数哺乳动物的IgG 。
但两者结合特异性有所不同，Protein G 对人IgG3、小鼠IgG1以及大鼠IgG2a 等具有高亲和力。
天然Protein G 具有白蛋白和细胞表面结合域，重组Protein G 去除了白蛋白和细胞表面结合域，以减少非特异性结合。
本产品具有广谱IgG 结合、高Fc 段结合活性、高抗体吸附量和性能稳定等特点，可重复多次使用。
【注意事项】1．凝胶从冷室或冰箱中取出后在室温下缓慢振摇恢复到室温后装柱，避免产生气泡影响柱效。
2．装柱时尽可能维持凝胶长径比为5:3-2:1，长径比过大将导致洗脱峰拖尾，洗脱体积增大；长径比过小将导致样品与填料接触时间短，吸附不充分，填料吸附蛋白量小。
3．若上样液中抗体浓度过高，应使用平衡缓冲液稀释至1-2mg/ml ，以免上样浓度过高影响柱效。
4．可以采用降低上样时的流速来增加样品与填料接触时间从而提高纯化抗体量。
5．凝胶用低pH 缓冲液洗脱时间应尽可能短，洗脱后用中性缓冲液尽快中和至pH 中性，以延长亲和介质的使用寿命。
6．洗脱后，应立刻用如中和缓冲液将收集到的抗体溶液中和到中性（pH7.4左右），以利于维持抗体的生物活性，避免抗体失活。
免疫球蛋白G放免药盒
核准日期：修改日期：免疫球蛋白G放射免疫分析药盒说明书【药品名称】通用名称：免疫球蛋白G 放射免疫分析药盒英文名称：Immunoglobulin G Radioimmunoassay Kit汉语拼音：Mianyiqiudanbai G Fangshemianyifenxi Yaohe简称：免疫球蛋白G放免药盒【成份】[药盒组成、试剂配制及贮存条件]1.人免疫球蛋白G标准品6瓶，冻干品，使用前每瓶加蒸馏水1.0ml溶解，其对应浓度为1、2、5、10、20、50µg/ml。
2.125I-免疫球蛋白G 1瓶，溶液（红色）50管：每瓶放射性小于2.5μCi。
100管：每瓶放射性小于5μCi。
3.免疫球蛋白G抗体1瓶，悬浮液，固相微球羊抗人IgG抗体。
4.缓冲液1瓶。
5.质控品使用方法及参考值见附页。
以上试剂均在2～8℃下贮存。
[操作步骤]待试剂充分溶解、混匀，血样稀释（尿和脑脊液不用稀释）后，即可按下表顺序加样。
免疫球蛋白G放免分析操作程序表管别T管零标准管标准管样品管试剂缓冲液100人免疫球蛋白G标准品100待测样品100 125I-免疫球蛋白G 100 100 100 100免疫球蛋白G固相微球200 200 200 抗体充分摇匀，37℃温育1小时3500转/分离心20分钟，弃上清液后，测各管放射性计数60秒。
血样稀释：2601倍稀释，取20μl血清，加入缓冲液lml混匀，再取稀释的血样20μl，加入缓冲液lml混匀，即可用于测定。
[结果计算]零标准管（CPM）—本底（CPM）零管结合率（B0/T%）= ————————————————— ×100%T管（CPM）—本底（CPM）标准管或样品管（CPM）—本底（CPM）B/ B0%= ——————————————————— ×100%零标准管（CPM）—本底（CPM）以标准品浓度为横坐标，B/ B0％为纵坐标，在半对数坐标纸上绘制标准曲线，根据样品的B/ B0％，从标准曲线上查得相应浓度（血样要乘以稀释倍数,即得出免疫球蛋白G的实际含量）。
BPG 层析柱标准装柱流程规范之欧阳文创编
操作标准目的：为了使BPG300层析柱装柱过程可重复，并能够得到较好的柱效，故建立此操作规范。
范围：配合ÄKTA process 系统进行有效的蛋白质纯化操作。
责任人：层析工序操作人员标准操作程序：1基本术语概念填料因子（Packing Factor, PF ）：指在在装柱过程中，用低流速（如60cm/h ）对填料进行沉降压缩得到的调料高度GEHC生产的各种常见填料的PF 参见《GEHC AxiChrom 300-1000 columns User Manual 28-9562-89 Edition AA 》； 线性流速（linear flow rate ）：单位时间内液体流经的直线距离，常用cm/h 表示；体积流速（volume flow rate）：单位时间内液体流经的空间容积，常用ml/min表示；22.1矫正），是否清洁（如有污染应进行清洗）。
2.2 确定所用填料及其特性、浓度等以DEAE Sepharose Fast Flow填料为例，其填料因子（PF）为1.15，新填料（slurry）浓度为75%（保存于20%乙醇中），耐压3bar。
2.3 确定放大后的工艺参数以XX生化制药股份有限公司的放大工艺为例，中试工艺参数：柱高h=10cm；体积流速v1=3ml/min；柱内径d=1.6cm.即，线性流速v2=v1/s柱=3/(3.14×0.82) cm/min=1.5cm/min；样品与填料接触时间t=h/v2=10/1.5min=6.67min；在工艺的线性放大中h、v2和t均不变，则可保证样品出峰的位置（洗脱时间）和形状不变。
使用BPG300层析柱进行放大的工艺参数：装柱体积V柱= S柱h=3.14×1.52×1L=7L；装柱需要slurry体积Vslurry=V柱×PF/Cslurry以DEAE Sepharose Fast Flow为填料，则，Vslurry=7×1.15/0.75L=10.73L；装入柱中的slurry高度Lslurry=Vslurry/S柱=10.73/(3.14×1.52)dm=1.52dm=15.2cm.3管路安装3.1 层析柱管道和配件安装3.1.1卸下柱子顶部和底部的盲堵垫圈，旋松密封调节器，用纯水或20%乙醇充分浸润柱内壁和柱头O型圈；3.1.2 用扳手对称卸下支持杆连接到法兰的螺丝，并通过旋转高度调节手柄将柱头旋至最高处，在柱头顶部依次安装压力表和四路二通阀，在柱底安装四路二通阀；3.1.3在顶部四路二通阀上横向连接一根细管，另一端连至ÄKTAprocess上端连接口COLUMN TOP，同时从柱底四路二通阀横向接出一根细管至ÄKTAprocess的下端连接口COLUMN BOTTOM。
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Protein G Sepharose Fast Flow
原理
蛋白质G ，来自G 链球菌组的细胞表面蛋白，是III Fc-受体型蛋白。
蛋白质G 通过非免疫机制结合抗体的Fc 区域。
蛋白质G 特异性的结合IgG 的Fc 区域，但是对于一些多克隆抗体IgGs 对人源的IgG 抗体能够有更强的结合。
在标准缓冲液条件下，蛋白质G 能够结合所有的人源性的亚类抗体和所有鼠源性的IgG 亚类抗体，包括鼠的IgG ，或者兔的IgGa 和IgGb 。
进行一个分离操作
结合缓冲液：20mM 磷酸纳，pH7.0
洗脱缓冲液：100mM 甘氨酸，pH2.7
中和缓冲液：1M Tris-HCl ，pH9.0
1， 用5倍柱体积的蒸馏水冲洗柱子。
2， 用5倍柱体积的结合缓冲液平衡柱子。
3， 上样，流速为1-4ml/min （1ml 的柱子），或者5ml/min （5ml 的柱子）。
收集流穿片段。
4， 用5-10倍柱体积的结合缓冲液平衡分离柱，直到基线，即所有未结合物质都被冲洗出柱
子（紫外检测器在280nm 波长检测）。
5， 用5倍柱体积的洗脱缓冲液进行洗脱。
洗脱液立即用中和缓冲液（0.06ml~0.2ml 1M
Tris-HCl ，pH9.0每毫升馏分）中和至中性。
6， 立即用5-10倍体积的结合缓冲液重新平衡柱子 。
使用注意
1， 样品需要离心（10000g/20min ）去除细胞和细胞碎片。
离心下来的上清经过一个0.45μm
的滤膜过滤。
2， 来自多数物种的IgGs 和亚类，在接近生理pH 值和离子强度的条件下，可以结合到蛋白
质G 上。
对于特别物种IgG 的最佳结合条件，应该查阅近期的文献。
3， 当pH 值为2.7或者低于2.7时，大多数种类的免疫球蛋白能从蛋白质
G 上被洗脱下来。
4， 洗脱完成后，立即用5-10倍体积的结合缓冲液重新平衡柱子非常重要。
在通常使用的水溶性缓冲液中都是稳定的。
储存
用20%的乙醇在中性pH值的条件下冲洗介质和柱子，在4°~8°条件下储存。