qRT-PCR实验操作流程
qPCR实验操作流程
Q-PCR实验流程一、①实验前准备,每天早上到实验室后，先把超净工作台的紫外灯打开15-20分钟。
②超净台前做实验，需佩戴干净的橡胶手套/一次性薄膜手套,RNA抽提需带口罩。
③取EP管/枪头时需用镊子，不可以用使用过的手套直接取用.取完EP管/枪头后，袋子及时封好。
④橡胶手套须放入超净台照射紫外，实验操作过程中不得带出超净台，移液器在一天工作结束后调至最大量程，并用75％乙醇清洁移液器，枪头盒及超净台面。
⑤实验进行的过程中或观看实验时，没有带口罩不要在超净台前讲话。
二、总RNA抽提1）细胞培养皿中细胞样品用1＊PBS洗两次后,用1ml枪将PBS吸干净，加入1ml Trizol （Invitrogen)溶液，吹打混匀，并吸至1.5ml RNase free EP 管中使细胞充分裂解，室温静置5min；组织样品用液氮充分研磨,加入1ml Trizol (Invitrogen）溶液，混匀，室温放置5min使其充分裂解；(管盖与管壁都需标记样品名称)2）加入200μl氯仿，剧烈振荡混匀30s,使水相和有机相充分接触,室温静置3—5min;（离心时离心管按顺序排放，离心完毕，离心管的顺序也按顺序排好，与第一步的顺序一致）3) 4℃下，14,000g离心15min，可见分为三层，RNA在上层水相，移至另一个新的RNase free EP管；(用20-200ul的枪吸取上清，吸上清时，枪头应沿着液面上层吸取上清，枪头不可碰到、吸到中间层）4）沉淀RNA：加入等体积异丙醇，轻柔地充分混匀(颠倒6-8次）(不应用振荡器混匀），室温静置10min;5）4℃下，14,000g离心10min，收集RNA沉淀（如离心后仍不见EP管底部有沉淀，应将EP管放置在-80度冰箱过夜,继续在4℃下，14，000g 离心10min，收集RNA沉淀），去上清;6）用75%乙醇洗涤两次(12,000g离心5min)(加入乙醇后只需轻轻颠倒EP 管即可,不用振荡器震荡或枪头吸打沉淀),超净台风干；沉淀不能过干或过湿，过干则不易溶解，过湿则乙醇残留。
qrt-pcr操作流程
qrt-pcr操作流程qRT-PCR操作流程引言qRT-PCR（quantitative reverse transcription polymerase chain reaction）是一种广泛应用于基因表达研究的技术，通过逆转录将RNA转化为cDNA，再利用聚合酶链反应（PCR）技术进行扩增和检测。
本文将详细介绍qRT-PCR的操作流程。
1. 实验前准备在进行qRT-PCR实验之前，需要准备以下材料和设备：- RNA样本：提取需要研究的组织或细胞中的总RNA。
- 逆转录试剂盒：包括逆转录酶、随机引物、dNTPs等。
- PCR试剂盒：包括聚合酶、引物、dNTPs等。
- qRT-PCR仪器：包括逆转录仪和实时荧光定量PCR仪。
- 实验耗材：包括离心管、PCR管、PCR板等。
2. RNA逆转录a. 将RNA样本与逆转录试剂混合，并在逆转录仪中进行反应。
通常情况下，逆转录反应体系包括RNA样本、逆转录酶、随机引物、dNTPs等。
b. 根据逆转录试剂盒的说明书，设置逆转录反应的温度和时间。
一般来说，逆转录反应的温度范围为42-55°C，反应时间为30-60分钟。
3. cDNA合成a. 将逆转录反应得到的cDNA样品与PCR试剂混合，并在PCR仪器中进行扩增反应。
通常情况下，PCR反应体系包括cDNA样品、聚合酶、引物、dNTPs等。
b. 根据PCR试剂盒的说明书，设置PCR反应的温度和时间。
一般来说，PCR反应包括初始变性步骤（95°C，3-5分钟）、循环扩增步骤（95°C，15-30秒；引物退火温度，30-60秒；72°C，15-30秒）、终止步骤（72°C，5-10分钟）等。
c. 根据所需的扩增产物大小，设置PCR反应的循环次数。
一般来说，循环次数在25-40次之间。
4. 实时荧光定量PCRa. 将PCR反应产物与实时荧光定量PCR试剂混合，并将混合物加入PCR板中。
qPCR实验操作流程
qPCR实验操作流程`Q-PCR实验流程一、①实验前准备，每天早上到实验室后，先把超净工作台的紫外灯打开15-20分钟。
②超净台前做实验，需佩戴干净的橡胶手套/一次性薄膜手套，RNA抽提需带口罩。
③取EP管/枪头时需用镊子，不可以用使用过的手套直接取用。
取完EP管/枪头后，袋子及时封好。
④橡胶手套须放入超净台照射紫外，实验操作过程中不得带出超净台，移液器在一天工作结束后调至最大量程，并用75%乙醇清洁移液器，枪头盒及超净台面。
⑤实验进行的过程中或观看实验时，没有带口罩不要在超净台前讲话。
二、总RNA抽提1）细胞培养皿中细胞样品用1*PBS洗两次后，用1ml枪将PBS 吸干净，加入1ml Trizol （Invitrogen）溶液，吹打混匀，并吸至RNase free EP管中使细胞充分裂解，室温静置5min；组织样品用液氮充分研磨，加入1ml Trizol （Invitrogen）溶液，混匀，室温放置5min使其充分裂解；（管盖与管壁都需标记样品名称）2）加入200μl氯仿，剧烈振荡混匀30s，使水相和有机相充分接触，室温静置3-5min；（离心时离心管按顺序排放，离心完毕，离心管的顺序也按顺序排好，与第一步的顺序一致）3）4℃下，14,000g离心15min，可见分为三层，RNA在上层水相，移至另一个新的RNase free EP管；（用20-200ul的枪吸取上清，吸上清时，枪头应沿着液面上层吸取上清，枪头不可碰到、吸到中间层）4）,5）沉淀RNA：加入等体积异丙醇，轻柔地充分混匀（颠倒6-8次）（不应用振荡器混匀），室温静置10min；6）4℃下，14,000g离心10min，收集RNA沉淀（如离心后仍不见EP管底部有沉淀，应将EP管放置在-80度冰箱过夜，继续在4℃下，14,000g离心10min，收集RNA沉淀），去上清；7）用75％乙醇洗涤两次（12,000g离心5min）（加入乙醇后只需轻轻颠倒EP管即可，不用振荡器震荡或枪头吸打沉淀），超净台风干；沉淀不能过干或过湿，过干则不易溶解，过湿则乙醇残留。
组织miRNA提取和qRT PCR
组织miRNA提取和qRT PCR组织mirna提取和qrt-pcr组织miRNA提取（e.z.n.a.mirnakit）器具和耗材e、 Z.n.a.mirna试剂盒、一套取样器、旋涡、离心机、离心管架、各种规格的离心管（15ml、1.5ml）、各种规格的无核糖核酸酶吸盘（1ml、200ul、10ul）、镊子、砂浆、研磨棒、保温杯（用于液氮）：氯仿、75%乙醇、100%乙醇、rnase-free水操作步骤：准备工作1.实验前一天，将研钵和研磨棒浸入84消毒剂中24小时，并在实验前30分钟加入液氮冷却。
2.实验前清洁试验台，用75%乙醇擦拭2张试验台，并在试验台和使用的仪器盒上喷洒不含RNase的水；3.将15ml离心管在液氮中提前预冷。
4.向RWBwash缓冲液中加入48ml无水乙醇。
5.将冻存样品从-70℃冰箱转移至装有液氮的保温杯中。
组织研磨和均质1.取冰冻组织材料50－100mg置于放有液氮的研钵中，在研钵中加液氮研磨成粉末（尽量细），注意持续补充液氮；2.用在液氮中预冷的1ml吸头转移组织粉末至提前预冷的15ml离心管中3.待液氮完全蒸发后加入1mlrna-solv试剂，室温下孵育2-3min4.向每1ml RNA溶剂试剂中加入200ul氯仿，盖上试管，剧烈摇匀，在冰中培养10min，12000g，在4℃下离心15min5.将不超过80%的上清液转移到新的2ml离心管中，加入1/2体积的无水乙醇，涡旋震荡。
除去largerna6.将硅胶柱放入2ml集液管中，从第5步的混合液中抽出700ul，加入Hibindmaic柱（如果量大，混合液可多次通过柱过滤），将所有液体移入柱内，旋涡振动。
收集管和硅胶柱在室温下离心30-60s，每次10000g。
将离心后的流出物放入新的2ml收集管（用于提取小RNA）7.将剩余混合液重复第6步，流出液转移到相同的收集管中。
纯化的miRNA8.估计6和7步中流出液的总量，加入0.9倍体积的无水乙醇，涡旋震荡混匀。
qPCR实验操作流程
Q-PCR实验流程一、①实验前准备，每天早上到实验室后，先把超净工作台的紫外灯打开15-20分钟。
②超净台前做实验，需佩戴干净的橡胶手套/一次性薄膜手套，RNA抽提需带口罩。
③取EP管/枪头时需用镊子，不可以用使用过的手套直接取用。
取完EP管/枪头后，袋子及时封好。
④橡胶手套须放入超净台照射紫外，实验操作过程中不得带出超净台，移液器在一天工作结束后调至最大量程，并用75%乙醇清洁移液器，枪头盒及超净台面。
⑤实验进行的过程中或观看实验时，没有带口罩不要在超净台前讲话。
二、总RNA抽提1）细胞培养皿中细胞样品用1*PBS洗两次后，用1ml枪将PBS吸干净，加入1ml Trizol （Invitrogen）溶液，吹打混匀，并吸至1.5ml RNase free EP管中使细胞充分裂解，室温静置5min；组织样品用液氮充分研磨，加入1ml Trizol （Invitrogen）溶液，混匀，室温放置5min使其充分裂解；（管盖与管壁都需标记样品名称）2）加入200μl氯仿，剧烈振荡混匀30s，使水相和有机相充分接触，室温静置3-5min；（离心时离心管按顺序排放，离心完毕，离心管的顺序也按顺序排好，与第一步的顺序一致）3）4℃下，14,000g离心15min，可见分为三层，RNA在上层水相，移至另一个新的RNase free EP管；（用20-200ul的枪吸取上清，吸上清时，枪头应沿着液面上层吸取上清，枪头不可碰到、吸到中间层）4）沉淀RNA：加入等体积异丙醇，轻柔地充分混匀（颠倒6-8次）（不应用振荡器混匀），室温静置10min；5）4℃下，14,000g离心10min，收集RNA沉淀（如离心后仍不见EP管底部有沉淀，应将EP管放置在-80度冰箱过夜，继续在4℃下，14,000g 离心10min，收集RNA沉淀），去上清；6）用75％乙醇洗涤两次（12,000g离心5min）（加入乙醇后只需轻轻颠倒EP管即可，不用振荡器震荡或枪头吸打沉淀），超净台风干；沉淀不能过干或过湿，过干则不易溶解，过湿则乙醇残留。
qPCR实验操作流程
qPCR实验操作流程Q-PCR实验流程一、①实验前准备，每天早上到实验室后，先把超净工作台的紫外灯打开15-20分钟。
②超净台前做实验，需佩戴干净的橡胶手套/一次性薄膜手套，RNA抽提需带口罩。
③取EP管/枪头时需用镊子，不可以用使用过的手套直接取用。
取完EP管/枪头后，袋子及时封好。
④橡胶手套须放入超净台照射紫外，实验操作过程中不得带出超净台，移液器在一天工作结束后调至最大量程，并用75%乙醇清洁移液器，枪头盒及超净台面。
⑤实验进行的过程中或观看实验时，没有带口罩不要在超净台前讲话。
二、总RNA抽提1）细胞培养皿中细胞样品用1*PBS洗两次后，用1ml枪将PBS吸干净，加入1ml Trizol （Invitrogen）溶液，吹打混匀，并吸至1.5ml RNase free EP管中使细胞充分裂解，室温静置5min；组织样品用液氮充分研磨，加入1ml Trizol （Invitrogen）溶液，混匀，室温放置5min使其充分裂解；（管盖与管壁都需标记样品名称）2）加入200μl氯仿，剧烈振荡混匀30s，使水相和有机相充分接触，室温静置3-5min；（离心时离心管按顺序排放，离心完毕，离心管的顺序也按顺序排好，与第一步的顺序一致）3）4℃下，14,000g离心15min，可见分为三层，RNA在上层水相，移至另一个新的RNase free EP管；（用20-200ul的枪吸取上清，吸上清时，枪头应沿着液面上层吸取上清，枪头不可碰到、吸到中间层）4）沉淀RNA：加入等体积异丙醇，轻柔地充分混匀（颠倒6-8次）（不应用振荡器混匀），室温静置10min；5）4℃下，14,000g离心10min，收集RNA沉淀（如离心后仍不见EP管底部有沉淀，应将EP管放置在-80度冰箱过夜，继续在4℃下，14,000g离心10min，收集RNA沉淀），去上清；6）用75％乙醇洗涤两次（12,000g离心5min）（加入乙醇后只需轻轻颠倒EP管即可，不用振荡器震荡或枪头吸打沉淀），超净台风干；沉淀不能过干或过湿，过干则不易溶解，过湿则乙醇残留。
qPCR实验操作流程学习资料
Q-PCR实验流程一、①实验前准备，每天早上到实验室后，先把超净工作台的紫外灯打开15-20分钟。
②超净台前做实验，需佩戴干净的橡胶手套/一次性薄膜手套，RNA抽提需带口罩。
③取EP管/枪头时需用镊子，不可以用使用过的手套直接取用。
取完EP管/枪头后，袋子及时封好。
④橡胶手套须放入超净台照射紫外，实验操作过程中不得带出超净台，移液器在一天工作结束后调至最大量程，并用75%乙醇清洁移液器，枪头盒及超净台面。
⑤实验进行的过程中或观看实验时，没有带口罩不要在超净台前讲话。
二、总RNA抽提1）细胞培养皿中细胞样品用1*PBS洗两次后，用1ml枪将PBS吸干净，加入1ml Trizol （Invitrogen）溶液，吹打混匀，并吸至1.5ml RNase free EP管中使细胞充分裂解，室温静置5min；组织样品用液氮充分研磨，加入1ml Trizol （Invitrogen）溶液，混匀，室温放置5min使其充分裂解；（管盖与管壁都需标记样品名称）2）加入200μl氯仿，剧烈振荡混匀30s，使水相和有机相充分接触，室温静置3-5min；（离心时离心管按顺序排放，离心完毕，离心管的顺序也按顺序排好，与第一步的顺序一致）3）4℃下，14,000g离心15min，可见分为三层，RNA在上层水相，移至另一个新的RNase free EP管；（用20-200ul的枪吸取上清，吸上清时，枪头应沿着液面上层吸取上清，枪头不可碰到、吸到中间层）4）沉淀RNA：加入等体积异丙醇，轻柔地充分混匀（颠倒6-8次）（不应用振荡器混匀），室温静置10min；5）4℃下，14,000g离心10min，收集RNA沉淀（如离心后仍不见EP管底部有沉淀，应将EP管放置在-80度冰箱过夜，继续在4℃下，14,000g 离心10min，收集RNA沉淀），去上清；6）用75％乙醇洗涤两次（12,000g离心5min）（加入乙醇后只需轻轻颠倒EP管即可，不用振荡器震荡或枪头吸打沉淀），超净台风干；沉淀不能过干或过湿，过干则不易溶解，过湿则乙醇残留。
RT-PCR的操作方法(终极版)
qRT-PCR实验步骤一、试剂准备1. 自备试剂：75%乙醇（以去RNAase H₂O配置）、氯仿、异丙醇、无RNAase H₂O。
2. 相关试剂盒（给出货号）等。
3. 无菌的epp管、PCR管、tip头等耗材。
二、注意事项1. 全称佩戴手套、口罩，穿白大褂。
女生需将长发扎起。
2. 自2.3至3.1步骤，必须使用无RNAase耗材（包括枪头和epp管）。
3. 所有试剂专用，不得与其他实验混用。
三、实验步骤1. 样品准备1.1. 动物组织：取新鲜或-70°C冻存组织，每30-50 mg 组织在液氮中充分研磨，也可以加入1 ml TotalRNAExtractor，用匀浆器匀浆处理。
样品体积一般不要超过TotalRNAExtractor 体积的10%。
1.2 单层培养细胞的收集：可直接在培养容器中裂解（培养面积不超过10 cm2，细胞不超过1×107），或者使用胰蛋白酶处理后离心收集细胞沉淀。
a. 直接裂解法：吸弃培养液，PBS清洗一次。
直接在培养板中加入TotalRNAExtractor 裂解细胞，每10 cm2面积加1-2ml TotalRNAExtractor（6孔板一般使用500-1000ul)。
用移液器吹打混匀。
TotalRNAExtractor 加量根据培养板面积决定，而不是由细胞数决定，如果加入的量不够，将导致提取的RNA 中有基因组DNA 污染。
b. 胰蛋白酶处理法：收集细胞并大致确定细胞数量，用PBS 洗涤细胞后，向细胞中加入含有0.1-0.25%胰蛋白酶的PBS 处理细胞，当细胞脱离容器壁后，加入含有血清的培养基失活胰蛋白酶，将细胞溶液转移至无RNase 的离心管中，5000 rpm 离心 5 min，收集细胞沉淀，去除上清，PBS重悬，清洗一次，离心去上清。
每10 cm2面积加1 ml TotalRNA Extractor。
用移液器吹打混匀。
收集细胞时一定要将细胞培养液去除干净，否则裂解不完全，降低RNA 得率。
qPCR实验操作流程
Q-PCR实验流程一、①实验前准备，每天早上到实验室后，先把超净工作台的紫外灯打开15-20分钟。
②超净台前做实验，需佩戴干净的橡胶手套/一次性薄膜手套，RNA抽提需带口罩。
③取EP管/枪头时需用镊子，不可以用使用过的手套直接取用。
取完EP管/枪头后，袋子及时封好。
④橡胶手套须放入超净台照射紫外，实验操作过程中不得带出超净台，移液器在一天工作结束后调至最大量程，并用75%乙醇清洁移液器，枪头盒及超净台面。
⑤实验进行的过程中或观看实验时，没有带口罩不要在超净台前讲话。
二、总RNA抽提1）细胞培养皿中细胞样品用1*PBS洗两次后，用1ml枪将PBS吸干净，加入1ml Trizol （Invitrogen）溶液，吹打混匀，并吸至1.5ml RNase free EP管中使细胞充分裂解，室温静置5min；组织样品用液氮充分研磨，加入1ml Trizol （Invitrogen）溶液，混匀，室温放置5min使其充分裂解；（管盖与管壁都需标记样品名称）2）加入200μl氯仿，剧烈振荡混匀30s，使水相和有机相充分接触，室温静置3-5min；（离心时离心管按顺序排放，离心完毕，离心管的顺序也按顺序排好，与第一步的顺序一致）3）4℃下，14,000g离心15min，可见分为三层，RNA在上层水相，移至另一个新的RNase free EP管；（用20-200ul的枪吸取上清，吸上清时，枪头应沿着液面上层吸取上清，枪头不可碰到、吸到中间层）4）沉淀RNA：加入等体积异丙醇，轻柔地充分混匀（颠倒6-8次）（不应用振荡器混匀），室温静置10min；5）4℃下，14,000g离心10min，收集RNA沉淀（如离心后仍不见EP管底部有沉淀，应将EP管放置在-80度冰箱过夜，继续在4℃下，14,000g 离心10min，收集RNA沉淀），去上清；6）用75％乙醇洗涤两次（12,000g离心5min）（加入乙醇后只需轻轻颠倒EP管即可，不用振荡器震荡或枪头吸打沉淀），超净台风干；沉淀不能过干或过湿，过干则不易溶解，过湿则乙醇残留。
microRNA的qRT-PCR检测方法
microRNA的qRT-PCR检测方法（1）选择内参基因：最好选择U6作为内参，actin 、tublin、5S、EF1-a也可以，最好选择两个内参为参照（两个内参结果更加可靠）。
（2）引物设计：所选基因使用Bencon Designer 软件进行引物设计。
此软件会把输入的序列和NBCI上的基因做对比，选出特异性的区域自动设计引物，而Primer 5只是在序列上自己设计引物，这样设计可能会有非特异性扩增。
Bencon Designer 软件使用步骤如下:打开Bencon Designer--File--New Sequence--粘贴序列--Add--在此方框中选择SYBR Green Design。
单击符号BLAST Search Sequence--Eukaryotic Genome BLAST--Search（等一会自动生成一个对比结果，可以不用看）--单击Primer Search--Primer Parameters（Tm和Ta为55±5℃、Length 18 to 24bp、Amplicon Length 75 to 200 bp、Alternate Primer Pairs 5）--Search--OK（自动生成Sense和Anti Sense序列，直接可以送公司合成序列）。
（3）RNA提取：Trizol法提取植物总RNA，跑1%的琼脂糖凝胶电泳（可以看到small RNA），也可以用热酚法提取小分子RNA。
（OD260/OD280在1.8-2.2之间，OD260/OD230在2.0-2.2之间）。
（4）microRNA反转录：小分子RNA的反转录要买试剂盒，一般分两步，先在小分子RNA 后加Ploy A，再就行反转录（按试剂盒步骤操作就可以）。
（5）以反转录产物为模板稀释3倍、5倍、10倍做qRT-PCR，选择一个合适的稀释倍数（一般microRNA的qRT-PCR不做标准曲线，因为稀释10倍以上Ct值大于35）。
提RNA 逆转录 qRT-PCR步骤模板
【一、提RNA】一、实验准备：1、试剂：75%乙醇、Trizol、1.5mL 进口EP管、氯仿、异丙醇、进口枪头(RNA专用)、2、配75%乙醇(DEPC水+无水乙醇)，放-20℃冰箱预冷；3、预冷离心机(1.5mL EP管用的)；4、清洁桌面，酒精喷过之后擦干，新手套、两层口罩；二、操作步骤：01、弃上清（不回收，直接倒去）；02、1mL/孔 PBS洗两遍（不回收，直接倒去，随后用200μL枪吸尽PBS）；03、每孔加500μL Trizol，轻晃，随后室温放置2min左右；04、枪头吹打，吸出放入1.5mL 进口EP管；05、加入100μL氯仿(即1/5体积的trizol)；06、4℃离心机，12000g，15min；07、吸200μL(可减少)上清放入新的1.5mL 进口EP管中（注意：只能吸到上清）；08、加入等体积异丙醇，充分混匀，常温放置10-30min(15min)；09、4℃离心机，12000g，10min；10、倒掉液体，加入1mL预冷的75%乙醇剧烈混匀；11、4℃离心机，7500g，5min；12、倒掉上清，加入1mL预冷的75%乙醇，混匀；13、4℃离心机，7500g，5min；14、倒掉上清，倒扣在餐巾纸上，5-10min，用针头或者200微升枪头去掉管壁上的水珠；15、每管中加入40μL(40μ-60μL)的DEPC水，吹打溶解；16、测浓度（先知楼21楼测RNA浓度，带DEPC水、灭菌的dd水、10微升枪和枪头）；三、注意事项01、如果当时不测RNA浓度，可暂时把RNA放在-20℃冰箱。
但长时间(>24h)保存，需要放在-80℃冰箱；02、异丙醇作用是沉淀RNA，作用比乙醇好；03、04、05、06、07、08、09、【二、测RNA浓度】一、实验准备：01、先知楼21楼-2109教室，一个冰盒+DEPC水+10微升枪、灭菌dd H2O、10μL枪头(RNA 专用)、本子+笔；二、操作步骤：01、登记；02、打开电脑==>打开“N”软件==>点击“Nucleic acid”==>选择“OK”==>选择“RNA”；03、灭菌dd H2O清洗2-3遍，擦干；04、DEPC水校零：即加DEPC水一滴，点击“Blank”，擦干；05、测RNA：加样品一滴，点击“measure”，擦干，随后加下一个样品；06、记录数据，包括RNA浓度（<1000ng/μL）、260/280；07、灭菌dd H2O清洗2-3遍，擦干；08、-80℃冰箱保存；三、注意事项230nm代表有机物水平(碳水化合物)，260nm代表RNA 水平，280nm代表蛋白水平，260/230表示有机物量，260/280代表RNA提取量；1.A260nm 是核酸最高吸收峰的吸收波长，最佳测量值的范围为0.1-1.0。
qRT-PCR流程
qRT-PCR流程摘要：苯酚的主要作⽤是裂解细胞，使细胞中的蛋⽩，核酸物质解聚得到释放。
苯酚虽可有效地变性蛋⽩质，但不能完全抑制RNA酶活性。
qRT-PCR，是Quantitative Real-time PCR 的简称，也叫实时荧光定量PCR，是⼀种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测定每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物的总量，通过内参或者外参法对待测样品中特定DNA序列进⾏定量分析的⽅法。
qRT-PCR⽬前已成为不同样本间进⾏基因表达⽔平差异⽐较权威的⽅法。
然⽽不适当的实验设计，没有⾜够的对照和重复，低质量的RNA样本，逆转录引物选择不理想，qRT-PCR的引物退⽕温度选择不当和数据分析⽅法不正确等都可能会成为影响qRT-PCR检测灵敏度的因素。
下⾯普健⽣物就从8个⽅⾯带你详细了解⼀下qRT-PCR的注意事项，以提⾼你的实验成功率。
1、实验设计 由于RNA易降解,对外在环境敏感，因此在实验条件或样本操作等各个环节都需要严格把控。
2、RNA抽提 RNA的抽提环境⾮常关键。
由于RNA酶⽆处不在和其难以灭活的顽固本性，在实验的每⼀步，任何偶然的疏忽或不妥当的操作都有可能造成RNA酶的污染，从⽽导致整个实验的失败。
因此，严格控制实验条件，避免任何可能的污染，是保证实验成功的关键。
RNA抽提建议⽤专⽤的操作区，离⼼机、移液枪、试剂等均应专⽤；所⽤的耗材、溶液及试剂均应是RNase-free或经过DEPC处理过的（这⼀步很费精⼒但不得不做，所以失败了会很痛苦）；操作过程中应始终戴⼀次性橡胶⼿套，并经常更换，以防⼿臂上的细菌、真菌以及⼈体⾃⾝分泌的RNA酶造成污染；避免在操作中说话聊天并且要记得戴⼝罩以防RNA酶污染；提取过程应尽量保持低温环境（所以戴个⼿套是正确的选择）并减少操作时间。
关于什么是Trizol，某百科是这样说的： Trizol是⼀种新型总RNA抽提试剂，可以直接从细胞或组织中提取总RNA。
qPCR实验操作流程49091
Q—PCR实验流程一、①实验前准备,每天早上到实验室后，先把超净工作台的紫外灯打开15—20分钟。
②超净台前做实验，需佩戴干净的橡胶手套/一次性薄膜手套,RNA抽提需带口罩。
③取EP管/枪头时需用镊子，不可以用使用过的手套直接取用。
取完EP管/枪头后，袋子及时封好。
④橡胶手套须放入超净台照射紫外，实验操作过程中不得带出超净台，移液器在一天工作结束后调至最大量程，并用75％乙醇清洁移液器，枪头盒及超净台面。
⑤实验进行的过程中或观看实验时，没有带口罩不要在超净台前讲话。
二、总RNA抽提1）细胞培养皿中细胞样品用1*PBS洗两次后，用1ml枪将PBS吸干净，加入1ml Trizol （Invitrogen）溶液,吹打混匀，并吸至1.5ml RNase free EP 管中使细胞充分裂解，室温静置5min;组织样品用液氮充分研磨，加入1ml Trizol (Invitrogen)溶液,混匀，室温放置5min使其充分裂解；（管盖与管壁都需标记样品名称)2）加入200μl氯仿，剧烈振荡混匀30s，使水相和有机相充分接触，室温静置3—5min；（离心时离心管按顺序排放，离心完毕，离心管的顺序也按顺序排好，与第一步的顺序一致）3)4℃下，14,000g离心15min，可见分为三层，RNA在上层水相，移至另一个新的RNase free EP管；（用20-200ul的枪吸取上清，吸上清时,枪头应沿着液面上层吸取上清，枪头不可碰到、吸到中间层）4）沉淀RNA：加入等体积异丙醇，轻柔地充分混匀（颠倒6—8次)（不应用振荡器混匀)，室温静置10min；5）4℃下,14，000g离心10min，收集RNA沉淀(如离心后仍不见EP管底部有沉淀，应将EP管放置在-80度冰箱过夜，继续在4℃下，14，000g 离心10min，收集RNA沉淀），去上清;6）用75％乙醇洗涤两次（12,000g离心5min）(加入乙醇后只需轻轻颠倒EP管即可,不用振荡器震荡或枪头吸打沉淀),超净台风干；沉淀不能过干或过湿，过干则不易溶解,过湿则乙醇残留.7）视沉淀量加入适量DEPC水(至少15ul)溶解沉淀。
QRT-PCR(荧光定量PCR)
1、SYBR Green 法
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2、SYBR Green 法的优缺点
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2、TaqMan探针法
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TaqMan作用机理
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TaqMan法优缺点
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注意事项
一、防止RNA酶污染 二、一定要做内参的。不作内参 的结果是不可信的。
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注意事项
内参：PCR时，每个标本都要做对应的内参，而 且每次都是看家基因，一般用bate-actin，有时也 用GAPDH。
各型肝炎、艾滋病、禽流感、结核、性病等传染病诊断和疗效评价 ；地中海贫血、血友病、性别发育异常、智力低下综合症、胎儿畸形 等优生优育检测；肿瘤标志物及瘤基因检测实现肿瘤病诊断；遗传基 因检测实现遗传病诊断。 • 动物疾病检测： 禽流感、新城疫、口蹄疫、猪瘟、沙门菌、大肠埃希菌、胸膜肺炎放 线杆菌、寄生虫病等。 食品安全： 食源微生物、食品过敏源、转基因、乳品企业阪崎肠杆菌等检测。 应用行业：各级各类医疗机构、大学及研究所、CDC、检验检疫局、兽 医站、食品企业及乳品厂等。
• 结果：荧光定量可以实现精确定量，普通pcr则不行。荧 光定量体现可以看到整个扩增过程，可以看到扩增效率， 溶解温度，直接得到的标准曲线等，这些是普通pcr无法 实现的。
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三、实验缺点 • 实验费用贵 • 实验重科学研究：医学、农牧、生物相关分子生物学定量研究。 • 临床疾病诊断：
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求职应注意的礼仪求职时最礼貌的修饰是淡妆面试时最关键的神情是郑重无论站还是坐不能摇动和抖动对话时目光不能游弋不定要控制小动作不要为掩饰紧张情绪而散淡最优雅的礼仪修养是体现自然以一种修养面对两种结果必须首先学会面对的一种结果被拒绝仍然感谢这次机会因为被拒绝是面试后的两种结果之一
qPCR实验操作流程
Q-PCR实验流程一、①实验前准备，每天早上到实验室后，先把超净工作台的紫外灯翻开15-20分钟。
②超净台前做实验，需佩戴干净的橡胶手套/一次性薄膜手套，RNA抽提需带口罩。
③取EP管/枪头时需用镊子，不可以用使用过的手套直接取用。
取完EP管/枪头后，袋子及时封好。
④橡胶手套须放入超净台照射紫外，实验操作过程中不得带出超净台，移液器在一天工作完毕后调至最大量程，并用75%乙醇清洁移液器，枪头盒及超净台面。
⑤实验进展的过程中或观看实验时，没有带口罩不要在超净台前讲话。
二、总RNA抽提1〕细胞培养皿中细胞样品用1*PBS洗两次后，用1ml枪将PBS吸干净，参加1ml Trizol 〔Invitrogen〕溶液，吹打混匀，并吸至1.5ml RNase free EP 管中使细胞充分裂解，室温静置5min；组织样品用液氮充分研磨，参加1ml Trizol 〔Invitrogen〕溶液，混匀，室温放置5min使其充分裂解；〔管盖与管壁都需标记样品名称〕2）参加200μl氯仿，剧烈振荡混匀30s，使水相和有机相充分接触，室温静置3-5min；〔离心时离心管按顺序排放，离心完毕，离心管的顺序也按顺序排好，与第一步的顺序一致〕3〕4℃下，14,000g离心15min，可见分为三层，RNA在上层水相，移至另一个新的RNase free EP管；〔用20-200ul的枪吸取上清，吸上清时，枪头应沿着液面上层吸取上清，枪头不可碰到、吸到中间层〕4）沉淀RNA：参加等体积异丙醇，轻柔地充分混匀〔颠倒6-8次〕〔不应用振荡器混匀〕，室温静置10min；5）4℃下，14,000g离心10min，收集RNA沉淀〔如离心后仍不见EP管底部有沉淀，应将EP管放置在-80度冰箱过夜，继续在4℃下，14,000g离心10min，收集RNA沉淀〕，去上清；6）用75％乙醇洗涤两次〔12,000g离心5min〕〔参加乙醇后只需轻轻颠倒EP管即可，不用振荡器震荡或枪头吸打沉淀〕，超净台风干；沉淀不能过干或过湿，过干那么不易溶解，过湿那么乙醇残留。