第5章 植物细胞工程制药

一、外植体选择
不同外植体的悬浮细胞培养物，其最大次级代谢产物
的累积时间各异。

例如（图5－2）：延迟期，加速期，与生长曲线平行 累积，稳定期累积

P-193



二、培养条件的影响
1.培养环境的内在因素
营养成分、生物及非生物元素、通气及混合程度、pH、与接种
有关的因素

（1）接种和诱导：次级代谢产物的产率与外植体大小，细胞密 度及营养成分密切相关，如紫草细胞培养营养成分1400mg/L时 细胞干重2.8g/L，营养成分1900mg/L时细胞干重4.9g/L。

固定化反应器：网状多孔板；尼龙网套；中空纤维膜
优点：细胞位置固定，易于获得高密度细胞群及维持细胞间理化梯度， 利于细胞组织化，易于控制培养条件及获得较高含量的次级代谢产物。

例如：辣椒细胞固定于聚氨基甲酸乙酯泡沫中，维持23天，辣椒素产 量较悬浮培养高1000倍。
第五节 影响植物次级代谢产物累积的因素
糖原、淀粉和纤维素的结构


三、植物细胞的主要生理活性物质及其他化学组分
1.生理活性物质 （1）酶类（enzyme）:淀粉酶，蛋白酶，脂肪酶 （2）维生素（vitamin）:辅酶 （3）植物激素(phytohormones):调节代谢，影响生理过程，
量微、作用大。

（4）抗生素和植物杀菌素(antibiotic):蒜，葱，萝卜
酶的合成。 （2）碳源：甘油，糖类，肌醇



（3）植物生长调节剂：极低浓度（﹤1µ mol/L）
5种天然激素：生长素（吲哚乙酸，IAA）、分裂素（6－呋喃甲基腺 嘌呤，6－FA）、赤霉素、脱落酸、乙烯

高浓度生长素、低浓度分裂素刺激细胞分裂；低浓度生长素、高浓度 分裂素刺激细胞生长；过量的赤霉素和酚类化合物能掩盖上述现象。
a 附加10-5mol/L IAA，b 附加10-6mol/L IAA和10-5mol/L KT IAA（吲哚乙酸，IAA生长素） KT （6－呋喃甲基腺嘌呤，6－FA分裂素，激动素）

3.培养环境的外部因素

ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
（1）温度：20～28℃
（2）搅拌频率：大于28r/min （3）培养容器的影响：实验室50～500mL （4）光的影响：光（光照时间，光强，光质，强度），影响植物
第五章 植物细胞工程制药
第一节 基本概念
植物细胞工程：以植物细胞为单位应用细胞生物 学分子生物学的理论和技术，在离体条件下培养、
繁殖和精细操作，使细胞的某些生物学特性按人
们的意愿改变，从而改良品种、加速繁殖或得到 有用的物质的一门科学技术。
基本概念

1.植物细胞的全能性（Cell Totipotency）：指任何具有完整的细胞核的
连续采集细胞和培养液，并以同样速度供给新鲜培养基以使细胞生长
环境长期维持恒定。生长速度取决于基质的浓度（Monod公式）。 培养时间长，无菌技术要求高。细胞的生长速度是由限制营养物质的 平衡水平决定的。如：烟草细胞

4.固定化培养法：植物次级代谢产物的累积主要在细胞生长的稳定期， 细胞成块趋于分化时，细胞中各个细胞处于一定理化梯度下。
（1）诱导去分化阶段 即初代培养 ：诱导产生愈伤组织、原球茎、顶芽和腋芽、不定芽、 体细胞胚状体等。 （2）继代增殖阶段培养： 即继代培养，将初代培养的产物切割、分离转接到新鲜的培养基上培 养。以增加培养物的数量。 （3）生根培养阶段



第四步
试管苗驯化移栽
（1） 植物组织培养技术 （2） 植物脱毒与快繁技术 意义： ①快速繁殖，保持优良品质 ②生产无毒苗，提高苗木品质 ③节约土地、环保
能,就叫做植物细胞的脱分化。

4.再分化(redifferentiation):已脱分化的细胞和组织再次分化发育成为完 整植株。

4.植物组织和器官的培养（Plant tissue culture） ：在无菌条件下，将
离体的植物器官（根尖、茎尖、叶、花、果实、种子等）、组织（花
药、胚乳、皮层等）、细胞（体细胞、生殖细胞等）、胚胎（成熟或 未成熟的胚）、原生质体等培养在人工配制的培养基上，给予人工控

9.愈伤组织(Callus)：外植体产生的一团无序生长的薄
壁细胞。

10.无性繁殖系(clone)：克隆，同一外植体获得很多无性繁殖后代。 11.突变体(mutant)：经诱变处理而变异成新细胞


12.继代培养(subculture)：连续多代培养
13.初级代谢产物：核酸、蛋白质、糖类 形态发生（morphologenesis）：指细胞再生植株的过程或个体发育 中机体及其器官形态结构的形成过程。

影响因素： 1.生物条件：外植体，季节，休眠，分化 2.物理条件：温度，光（光照时间，光强，光质），通气（O2），pH 和渗透压

3.化学条件：无机盐（N,P,K），碳源，植物生长调节剂，维生素，氨 基酸，核酸，抗生素，天然物质，前体

4.工业培养条件：培养罐类型，通气，搅拌和培养方法


植物细胞培养(suspension culture)技术
①意义：生产次生代谢物质


三、植物细胞大规模培养系统（方法）
1.成批培养法：将培养基一次性加入培养器中，接种、培养、收获细
胞。

2.半连续培养法：在反应器中投料和接种培养一段时间后，将部分培 养液和新鲜培养液进行交换。

3.连续培养法：在反应器中投料和接种培养一段时间后，以一定速度

表5－4 植物培养细胞不同生长阶段的持续时间及特征

Ｐ－183～184
细菌和哺乳动物细胞的化学组成百分比 Molecular Composition of Cells

物质 细菌 水 70 无机盐 1 混合的小分子 代谢物 3 蛋白质 15 磷脂 2 其它脂 — 多糖 2 RNA 6 DNA 1

物生长调节物质（激素）

（2）外植体的表面消毒灭菌 材料→自来水冲洗→蒸馏水→75%酒精30 S →无菌水1-2次→1-2%次
氯酸钠或次氯酸钙饱和液消毒10-30min或0.1-0.2%升汞（加吐温）510 min →无菌水洗4-5次。



第二步 接种（接种室）
第三步 培养（Culture）（培养室）

2.其他成分（后含物） （1）生物碱（alkaoid）:罂粟科，茄科


（2）糖苷类(glycoside):洋地黄毒苷
（3）挥发油(volatile oil):薄荷油，丁香油 （4）有机酸(organic acid):苹果酸，柠檬酸，水杨酸
四、植物培养细胞的生理特点

表5－3 植物细胞与动物细胞、微生物细胞的比较
活植物细胞，都携带一套完整的基因组（染色体），并具有发育成为完
整植株的潜在能力。

2.植物的分化(differentiation):胚胎分化和器官分化，受精卵－胚－种子
－植株

3.脱分化(dedifferentiation):一定条件下，原来已经分化,并且具有一定功 能的体细胞(或性细胞)，丧失了原有的结构和功能,又重新恢复了分裂功

（6）渗出物：细胞悬浮培养后期，培养液中常含有各种代谢产物。

2.两步培养法（two-step culture） 生长培养基(growth medium)：实现细胞的高生产率

生产培养基(production medium)：较低含量硝酸盐，
磷酸盐，糖
表5－12 不同培养基中紫草细胞生长和紫草素含量 培养基 M9 a White b 细胞产量 (gDCW/L) 11.3 5.7 紫草素含量/% 12.4 2.1
制的培养条件，诱发产生愈伤组织或丛生芽或长成新的完整的植株的
一种实验技术。也叫“离体培养”（Culture in vitro）或“试管培养” （In test-tube culture）。

5.细胞培养：形成单细胞无性繁殖系。
6.植物无菌培养： （1）幼苗及植株的培养 （2）愈伤组织培养（外植体，细胞聚集体） （3）悬浮培养（单细胞或小细胞团的液体培养）
哺乳动物 70 1 3 18 3 2 2 1.1 0.25
第四节 植物细胞培养的基本技术


一、植物材料的准备 ：P-186
外植体，无菌材料，常用灭菌剂，灭菌时间和顺序


二、培养基及其组成 ：P-187
相当于无菌土壤

三、培养方法： P-190


二、培养基及其组成
（1）无机盐：大于30mg/L浓度大量元素，小于30mg/L微量元素,辅助
（4）器官培养（organ
culture）
culture）
（5）胚胎培养（embryo

7.分生组织培养(meristem culture)：生长锥培养,人工
培养基上培养茎端分生组织细胞。如:茎尖0.1mm

8.外植体(explant)：植物组织培养中用来离体无菌培养 的离体材料，可以是器官、组织、细胞和原生质体等。 如：根、茎、叶、花、果实、胚珠、花药、花粉等。
脱分化
外植体 →
再分化
愈伤组织 →
形态发生
生长点 → 芽、根 → 小植株
次级代谢产物

1.有明显的分类学区域界限 2.其生物合成需要在一定条件下才能发生 3.缺乏明确的生理功能 4.是生命活动的多余成分 主要有：生物碱、黄酮类、萜类、有机酸、木质素、皂苷类、多元酚类

次级代谢作用

是由特异蛋白质调控产生的内源化合物的合成、代谢及分解作用的综合 过程。