107703-生物制药工艺学-第十三章(4) 酶类药物
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（2）工艺过程 ①自溶、过滤 猪胃黏膜在盐酸溶液中消化3-4h，过滤，收集滤液。
②脱脂、去杂质 滤液降温至30℃以下，静置24-28h，使杂质沉淀， 离心得脱脂酶液。
③浓缩、干燥 脱脂酶液在40℃以下浓缩至原体积的1/4，真空干燥， 球磨，即得胃蛋白酶粉。
（3）胃膜素和胃蛋白酶联产工艺：
向经消化、提取、脱脂、分层、浓缩及60%丙酮沉淀分离胃膜素的母液 中，边搅拌边加冷丙酮，至比重0.91，即有淡黄色胃蛋白酶沉淀，静放 过夜，去上清，沉淀真空干燥，即得胃蛋白酶。
（5）pH 一般选择在被结晶酶的等电点附近。 （6）金属离子 金属离子有助于酶的结晶，如Ca2+、Zn2+、Co2+、Cu2+、 Mg2+、Mn2+、Ni2+等。 （7）晶种 不易结晶的蛋白和酶，有时需要加入微量的晶种才能结晶。 （8）结晶器皿处理 要充分洗净、烘干。 （四）酶分离和纯化工作中的注意事项 1、防止酶蛋白变性
3、检验方法（略）
（二）胰蛋白酶（Trypsin）
1、结构与性质
易溶于水，牛胰蛋白酶原229aa组成，游对二硫键，在肠激酶或自 身催化下，释放出6肽，变成活性胰蛋白酶，分子量24KDa，223aa。 胰蛋白酶专一性作用于精氨酸与亮氨酸组成的肽键。猪胰蛋白酶的pI 为10.8。
2、生产工艺
（1）工艺路线
气泡上升法和平板法（p372-373，自己看看）
（四）细胞色素C （五）糜蛋白酶 （六）溶菌酶 （七）超氧化物歧化酶 （以上四种酶的生产工艺和工艺过程自己看看）
本章思考练习 1、酶类药物的原料来源主要有哪些？ 2、发酵法微生物酶制剂生产过程中影响酶产生的因素有 哪些？ 3、酶制剂的工业提取方法有哪些？ 4、酶类药物有哪几类？ 5、胃蛋白酶的生产工艺如何？ 6、胰蛋白酶生产的工艺过程如何？ 7、从人尿液中如何分离提取尿激酶？
3、表面活性剂法
表面活性剂具有亲水性的或憎水性的原子基团；有阳离子型、阴 离子型和非离子型的，有天然的和人造的。如胆酸、磷脂、SDS等。
三、酶制剂的工业提取法
把酶从菌体中或培养液中提取出来，使之达到与使用目的相适应的 纯度，这是酶提取和精制的任务。工业生产的酶有两种剂型——液体制 剂和粉剂。
（一）发酵液的预处理
三、微生物酶制剂生产的发酵技术
首先是微生物的培养（即发酵），要选择：培养方法、培养基、培养 温度、培养pH和通气量等。
更细一层的工艺还要考虑：培养基的灭菌方式、种子的培养条件、发 酵罐的型式、通气条件、搅拌速度、温度和pH调节控制等。
此外，还要考虑酶的分离纯化技术和制备工艺等。
先看发酵技术：
（一）原料
因为浓度越大，越容易变性。pH不能过高或过低。 2、防止辅因子的流失 3、防止酶被蛋白水解酶降解
第三节 酶类药物
一、药用酶类
（一）促进消化酶类
这类酶的作用是水解和消化食物中的成分，如蛋白质、糖类和脂 肪类等。如复合消化剂，内含蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶和纤维素酶。
（二）消炎酶类
已经用的酶有溶菌酶、菠萝蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胰酶、木瓜 蛋白酶等。
（4）结晶胃蛋白酶的制备：
取药用胃蛋白酶原粉，溶于20%酒精，加H2SO4调pH3.0，5℃静置 20h后过滤，加硫酸镁至饱和，进行盐析；盐析物再在pH3.8-4.0的乙醇 中溶解，过滤，滤液用硫酸调pH1.8-2.0，即析出针状胃蛋白酶；沉淀再 溶于20%pH4.0的乙醇，过滤，滤液用硫酸调pH1.8，在20℃放置，即可 得板状或针状晶体。
二、酶的提取
1、水溶法
常用稀盐溶液或缓冲液提取；一般应在低温下操作，pH选择也很重 要，要考虑所提取酶的稳定性、溶解度和结合性质，一般选择在酶 稳定的pH范围内、偏离等电点的适当pH。
2、有机溶剂法
最常用的有机溶剂是丁醇，因为丁醇具有下列性质：亲脂性强、兼 具亲水性、在脂和水分子间能起类似去垢剂的桥梁作用。
沉淀溶于冷水，用5M NaOH调pH5.0，25℃保温48h，即有针状结 晶析出（胰蛋白酶原粗品）；过滤，滤液用硫铵也可再沉淀出部分胰 蛋白酶原粗品。
③溶解、分级盐析 胰蛋白酶原精制。
④活化 使胰蛋白酶原变为胰蛋白酶。
⑤除钙、盐析、透析、冻干 硫铵除钙；硫铵饱和沉淀；沉淀用硼酸 缓冲液溶解，调pH8.0，过滤除杂，滤液透析除盐；结晶；晶体溶解 于蒸馏水，再透析，硅藻土吸附杂质后，过滤，滤液冻干即得产品。
2、浓缩
酶的浓缩方法很多，常用的有冷冻干燥法、离子交换法、超滤法、凝 胶吸水法和聚乙二醇吸水法等。
（三）酶的结晶
1、酶的结晶方法
（1）盐析法
在适当的pH、温度等条件下，保持酶的稳定，慢慢改变盐浓度进行结 晶；结晶时常用的盐有硫铵、柠檬酸钠、乙酸铵、硫酸镁和甲酸钠等。
（2）有机溶剂法 结晶常用的有机溶剂有乙醇、丙醇、丁醇、乙腈、异丙醇、二噁烷，
第十三章第四节
酶类药物
第一节 酶类药物的原料来源
一、原料的选择
选择原料应该注意以下几点： （1）不同酶的用料选择 （2）注意不同生长发育情况与营养 （3）从原料来源是否丰富考虑 （4）从简化提纯步骤着手 （5）尽量用新鲜组织 （6）必要时要考虑用基因工程方法
二、微生物酶制剂高产菌株的选育
获得优良菌种的途径有三条： （1）从自然界分离筛选 （2）用物理或化学方法处理、诱变 （3）用基因重组与细胞融合技术，培育出优良菌种
1、碳源 常用的有甘薯、玉米、麸皮、米糠等
2、氮源 常用的有豆饼、花生饼、菜籽饼等以及硫铵、氯化铵、尿 素、磷酸氢二钾等
3、无机盐 常用有磷酸盐、硫酸盐、钾盐、硫酸镁、氯化钙等
4、生长因素和产酶促进剂 如维生素、氨基酸、嘧啶/嘌呤碱等；酶 促进剂如吐温80、聚乙烯醇、糖脂等
（二）培养方法
1、固体培养法
也即麸曲培养法，用麸皮或米糠为主要原料，看情况配以其它辅料， 加水搅拌成半固态物料作为培养基。
固体培养法不足是：设备简陋、劳动强度大、培养基散热慢、对温 度/pH/成分变化难以控制。
2、液体培养法
分为液体表面培养法和液体深层培养法；而深层通气培养法是目前 应用最广的方法。培养条件可以调控，但因不同菌或不同酶而有所 不同。
3、检验方法 （1）质量标准
性状（白色粉末）、澄清度、pH（5-7）、干燥失重（不得超过 8%）、糜蛋白酶限度检查（不得超过5%） （2）效价检测（略） 底物与酶反应，测定A253值，按公式计算效价。
（三）尿激酶（Urokinase）
1、组成、性质
一种碱性蛋白，由肾脏产生。分子量有31.3KDa和54.7KDa两种； 尿激酶是丝氨酸蛋白酶，丝氨酸和组氨酸是其活性中心的必需氨基酸； 血纤维蛋白酶原是它唯一的天然蛋白质底物。尿激酶pI为8-9。临床上， 尿激酶已广泛用于治疗各种新血栓形成或血栓梗塞疾病。
2、生产工艺
（1）工艺路线
（2）工艺过程 ①收尿 最好是男性尿。 ②沉淀处理 用NaOH调pH8.58，静止1h，沉淀，取上清。 ③硅藻土吸附 上清尿液用硅藻土搅拌吸附。 ④洗脱 吸附好的硅藻土装柱，用0.02%氨水加0.1M氯化钠洗脱，洗脱液 变混时开始收集。 ⑤除热原、去色素 过QAE-Sephadex层析柱。 ⑥CM-C柱浓缩 ⑦透析除盐 4℃对水透析除盐。 3、检验方法 （1）性状 无色或白色粉末。 （2）活力检测
（一）杂质的出去
除杂质常用的一些方法：
1、pH和加热沉淀法
2、蛋白质表面变性法
3、选择性变性法
4、核酸沉淀剂法
5、将酶与底物结合，用加热法除去杂蛋白
（二）脱盐和浓缩
1、脱盐
最常用的脱盐方法是透析和凝胶过滤。
常用的凝胶有Sephadex G-10, G-15, G-25以及Bio-Gel P-2, P-4, P-6, P10等。
3、影响产酶的一些因素
（1）培养基组分 （2）温度 （3）pH （4）通气量 （5）搅拌速度 （6）泡沫 （7）湿度 （8）诱导剂
第二节 酶类药物的提取和纯化
一、生物材料的预处理
（一）动物材料的预处理 1、机械处理 如组织绞碎、匀浆等 2、反复冻融 3、丙酮粉 即用丙酮脱水干燥组织制成丙酮粉，对于结合酶的 制备特有用。 （二）微生物的预处理 1、干燥法 有空气干燥、真空干燥和冷冻干燥等 2、机械法 如研磨法、组织匀浆法、超声波法、高压匀浆法等 3、酶法处理 如溶菌酶等
（三）与纤维蛋白溶解作用有关的酶类
目前已用于临床的有链激酶、尿激酶、纤溶酶、ห้องสมุดไป่ตู้血酶和曲菌蛋 白酶等。
（四）抗肿瘤的酶类
如门冬酰胺酶、谷氨酰胺酶、神经氨酸苷酶、尿激酶等。
（五）其它药用酶（略）
二、重要酶类药物
（一）胃蛋白酶（Pepsin） 1、组成（结构）、性质
药用胃蛋白酶是胃液中多种蛋白水解酶的混合物，含有胃蛋白酶、组 织蛋白酶、胶原酶等。淡黄色粉末，易溶于水；结晶胃蛋白酶呈针状， 分子量34500Da。 2、生产工艺 （1）工艺路线
二甲亚砜、二氧杂环己烷等。与盐析法相比，用有机溶剂法易引起酶失 活。 （3）复合结晶法 （4）透析平衡法 （5）等电点法 2、结晶条件的选择 影响酶结晶的因素很多，下面几个尤为重要： （1）酶的纯度 一般来说，纯度越高，结晶越容易。 （2）酶的浓度 一般浓度越高，越有利于结晶。通常5-10mg/ml为好。 （3）温度 低温下较好，一般4 ℃或25℃。 （4）时间 不一定，因酶而异。
微生物发酵液的分离、过滤，常采用的设备是转鼓式真空吸滤机、 离心沉降分离机和自动板框压滤机。
（二）酶液的脱色
工业上常用活性炭脱色。
（三）盐析法
（四）有机溶剂法
有机溶剂沉淀蛋白的能力：丙酮＞异丙醇＞乙醇＞甲醇，工业上常 用的是乙醇。
（五）喷雾干燥直接制备粉末酶制剂
但常用是冷冻干燥法
四、酶的纯化
不同的酶，其纯化工艺可以差得很大。那么，评价一个纯化工艺的 好坏，主要看两个指标：酶的比活、总活力回收。要两者兼得是很难 的；目前有关酶的纯化工艺是经验多于理论。一些纯化方法的搭配和 连贯运用，是靠不断摸索的经验积累。下面讨论一些纯化过程中经常 遇到的技术难点。
（2）工艺过程
①浸取 新鲜胰脏，除去脂肪、结缔组织等，浸入预冷的0.125M硫 酸中，速冷，在0℃保存。从酸中取出、绞碎，用0.125M硫酸浸取24h， 并不断搅拌，过滤，滤饼再次浸取，合并滤液。
②分级盐析、结晶 上述滤液中加硫铵使成40%饱和度，置冷室过 夜，过滤，滤液再硫铵70%饱和度冷室过夜沉淀，过滤，滤液再硫铵 70%饱和度沉淀，过滤，沉淀溶于冷水，再重复硫铵沉淀，过滤。
②脱脂、去杂质 滤液降温至30℃以下，静置24-28h，使杂质沉淀， 离心得脱脂酶液。
③浓缩、干燥 脱脂酶液在40℃以下浓缩至原体积的1/4，真空干燥， 球磨，即得胃蛋白酶粉。
（3）胃膜素和胃蛋白酶联产工艺：
向经消化、提取、脱脂、分层、浓缩及60%丙酮沉淀分离胃膜素的母液 中，边搅拌边加冷丙酮，至比重0.91，即有淡黄色胃蛋白酶沉淀，静放 过夜，去上清，沉淀真空干燥，即得胃蛋白酶。
（5）pH 一般选择在被结晶酶的等电点附近。 （6）金属离子 金属离子有助于酶的结晶，如Ca2+、Zn2+、Co2+、Cu2+、 Mg2+、Mn2+、Ni2+等。 （7）晶种 不易结晶的蛋白和酶，有时需要加入微量的晶种才能结晶。 （8）结晶器皿处理 要充分洗净、烘干。 （四）酶分离和纯化工作中的注意事项 1、防止酶蛋白变性
3、检验方法（略）
（二）胰蛋白酶（Trypsin）
1、结构与性质
易溶于水，牛胰蛋白酶原229aa组成，游对二硫键，在肠激酶或自 身催化下，释放出6肽，变成活性胰蛋白酶，分子量24KDa，223aa。 胰蛋白酶专一性作用于精氨酸与亮氨酸组成的肽键。猪胰蛋白酶的pI 为10.8。
2、生产工艺
（1）工艺路线
气泡上升法和平板法（p372-373，自己看看）
（四）细胞色素C （五）糜蛋白酶 （六）溶菌酶 （七）超氧化物歧化酶 （以上四种酶的生产工艺和工艺过程自己看看）
本章思考练习 1、酶类药物的原料来源主要有哪些？ 2、发酵法微生物酶制剂生产过程中影响酶产生的因素有 哪些？ 3、酶制剂的工业提取方法有哪些？ 4、酶类药物有哪几类？ 5、胃蛋白酶的生产工艺如何？ 6、胰蛋白酶生产的工艺过程如何？ 7、从人尿液中如何分离提取尿激酶？
3、表面活性剂法
表面活性剂具有亲水性的或憎水性的原子基团；有阳离子型、阴 离子型和非离子型的，有天然的和人造的。如胆酸、磷脂、SDS等。
三、酶制剂的工业提取法
把酶从菌体中或培养液中提取出来，使之达到与使用目的相适应的 纯度，这是酶提取和精制的任务。工业生产的酶有两种剂型——液体制 剂和粉剂。
（一）发酵液的预处理
三、微生物酶制剂生产的发酵技术
首先是微生物的培养（即发酵），要选择：培养方法、培养基、培养 温度、培养pH和通气量等。
更细一层的工艺还要考虑：培养基的灭菌方式、种子的培养条件、发 酵罐的型式、通气条件、搅拌速度、温度和pH调节控制等。
此外，还要考虑酶的分离纯化技术和制备工艺等。
先看发酵技术：
（一）原料
因为浓度越大，越容易变性。pH不能过高或过低。 2、防止辅因子的流失 3、防止酶被蛋白水解酶降解
第三节 酶类药物
一、药用酶类
（一）促进消化酶类
这类酶的作用是水解和消化食物中的成分，如蛋白质、糖类和脂 肪类等。如复合消化剂，内含蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶和纤维素酶。
（二）消炎酶类
已经用的酶有溶菌酶、菠萝蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胰酶、木瓜 蛋白酶等。
（4）结晶胃蛋白酶的制备：
取药用胃蛋白酶原粉，溶于20%酒精，加H2SO4调pH3.0，5℃静置 20h后过滤，加硫酸镁至饱和，进行盐析；盐析物再在pH3.8-4.0的乙醇 中溶解，过滤，滤液用硫酸调pH1.8-2.0，即析出针状胃蛋白酶；沉淀再 溶于20%pH4.0的乙醇，过滤，滤液用硫酸调pH1.8，在20℃放置，即可 得板状或针状晶体。
二、酶的提取
1、水溶法
常用稀盐溶液或缓冲液提取；一般应在低温下操作，pH选择也很重 要，要考虑所提取酶的稳定性、溶解度和结合性质，一般选择在酶 稳定的pH范围内、偏离等电点的适当pH。
2、有机溶剂法
最常用的有机溶剂是丁醇，因为丁醇具有下列性质：亲脂性强、兼 具亲水性、在脂和水分子间能起类似去垢剂的桥梁作用。
沉淀溶于冷水，用5M NaOH调pH5.0，25℃保温48h，即有针状结 晶析出（胰蛋白酶原粗品）；过滤，滤液用硫铵也可再沉淀出部分胰 蛋白酶原粗品。
③溶解、分级盐析 胰蛋白酶原精制。
④活化 使胰蛋白酶原变为胰蛋白酶。
⑤除钙、盐析、透析、冻干 硫铵除钙；硫铵饱和沉淀；沉淀用硼酸 缓冲液溶解，调pH8.0，过滤除杂，滤液透析除盐；结晶；晶体溶解 于蒸馏水，再透析，硅藻土吸附杂质后，过滤，滤液冻干即得产品。
2、浓缩
酶的浓缩方法很多，常用的有冷冻干燥法、离子交换法、超滤法、凝 胶吸水法和聚乙二醇吸水法等。
（三）酶的结晶
1、酶的结晶方法
（1）盐析法
在适当的pH、温度等条件下，保持酶的稳定，慢慢改变盐浓度进行结 晶；结晶时常用的盐有硫铵、柠檬酸钠、乙酸铵、硫酸镁和甲酸钠等。
（2）有机溶剂法 结晶常用的有机溶剂有乙醇、丙醇、丁醇、乙腈、异丙醇、二噁烷，
第十三章第四节
酶类药物
第一节 酶类药物的原料来源
一、原料的选择
选择原料应该注意以下几点： （1）不同酶的用料选择 （2）注意不同生长发育情况与营养 （3）从原料来源是否丰富考虑 （4）从简化提纯步骤着手 （5）尽量用新鲜组织 （6）必要时要考虑用基因工程方法
二、微生物酶制剂高产菌株的选育
获得优良菌种的途径有三条： （1）从自然界分离筛选 （2）用物理或化学方法处理、诱变 （3）用基因重组与细胞融合技术，培育出优良菌种
1、碳源 常用的有甘薯、玉米、麸皮、米糠等
2、氮源 常用的有豆饼、花生饼、菜籽饼等以及硫铵、氯化铵、尿 素、磷酸氢二钾等
3、无机盐 常用有磷酸盐、硫酸盐、钾盐、硫酸镁、氯化钙等
4、生长因素和产酶促进剂 如维生素、氨基酸、嘧啶/嘌呤碱等；酶 促进剂如吐温80、聚乙烯醇、糖脂等
（二）培养方法
1、固体培养法
也即麸曲培养法，用麸皮或米糠为主要原料，看情况配以其它辅料， 加水搅拌成半固态物料作为培养基。
固体培养法不足是：设备简陋、劳动强度大、培养基散热慢、对温 度/pH/成分变化难以控制。
2、液体培养法
分为液体表面培养法和液体深层培养法；而深层通气培养法是目前 应用最广的方法。培养条件可以调控，但因不同菌或不同酶而有所 不同。
3、检验方法 （1）质量标准
性状（白色粉末）、澄清度、pH（5-7）、干燥失重（不得超过 8%）、糜蛋白酶限度检查（不得超过5%） （2）效价检测（略） 底物与酶反应，测定A253值，按公式计算效价。
（三）尿激酶（Urokinase）
1、组成、性质
一种碱性蛋白，由肾脏产生。分子量有31.3KDa和54.7KDa两种； 尿激酶是丝氨酸蛋白酶，丝氨酸和组氨酸是其活性中心的必需氨基酸； 血纤维蛋白酶原是它唯一的天然蛋白质底物。尿激酶pI为8-9。临床上， 尿激酶已广泛用于治疗各种新血栓形成或血栓梗塞疾病。
2、生产工艺
（1）工艺路线
（2）工艺过程 ①收尿 最好是男性尿。 ②沉淀处理 用NaOH调pH8.58，静止1h，沉淀，取上清。 ③硅藻土吸附 上清尿液用硅藻土搅拌吸附。 ④洗脱 吸附好的硅藻土装柱，用0.02%氨水加0.1M氯化钠洗脱，洗脱液 变混时开始收集。 ⑤除热原、去色素 过QAE-Sephadex层析柱。 ⑥CM-C柱浓缩 ⑦透析除盐 4℃对水透析除盐。 3、检验方法 （1）性状 无色或白色粉末。 （2）活力检测
（一）杂质的出去
除杂质常用的一些方法：
1、pH和加热沉淀法
2、蛋白质表面变性法
3、选择性变性法
4、核酸沉淀剂法
5、将酶与底物结合，用加热法除去杂蛋白
（二）脱盐和浓缩
1、脱盐
最常用的脱盐方法是透析和凝胶过滤。
常用的凝胶有Sephadex G-10, G-15, G-25以及Bio-Gel P-2, P-4, P-6, P10等。
3、影响产酶的一些因素
（1）培养基组分 （2）温度 （3）pH （4）通气量 （5）搅拌速度 （6）泡沫 （7）湿度 （8）诱导剂
第二节 酶类药物的提取和纯化
一、生物材料的预处理
（一）动物材料的预处理 1、机械处理 如组织绞碎、匀浆等 2、反复冻融 3、丙酮粉 即用丙酮脱水干燥组织制成丙酮粉，对于结合酶的 制备特有用。 （二）微生物的预处理 1、干燥法 有空气干燥、真空干燥和冷冻干燥等 2、机械法 如研磨法、组织匀浆法、超声波法、高压匀浆法等 3、酶法处理 如溶菌酶等
（三）与纤维蛋白溶解作用有关的酶类
目前已用于临床的有链激酶、尿激酶、纤溶酶、ห้องสมุดไป่ตู้血酶和曲菌蛋 白酶等。
（四）抗肿瘤的酶类
如门冬酰胺酶、谷氨酰胺酶、神经氨酸苷酶、尿激酶等。
（五）其它药用酶（略）
二、重要酶类药物
（一）胃蛋白酶（Pepsin） 1、组成（结构）、性质
药用胃蛋白酶是胃液中多种蛋白水解酶的混合物，含有胃蛋白酶、组 织蛋白酶、胶原酶等。淡黄色粉末，易溶于水；结晶胃蛋白酶呈针状， 分子量34500Da。 2、生产工艺 （1）工艺路线
二甲亚砜、二氧杂环己烷等。与盐析法相比，用有机溶剂法易引起酶失 活。 （3）复合结晶法 （4）透析平衡法 （5）等电点法 2、结晶条件的选择 影响酶结晶的因素很多，下面几个尤为重要： （1）酶的纯度 一般来说，纯度越高，结晶越容易。 （2）酶的浓度 一般浓度越高，越有利于结晶。通常5-10mg/ml为好。 （3）温度 低温下较好，一般4 ℃或25℃。 （4）时间 不一定，因酶而异。
微生物发酵液的分离、过滤，常采用的设备是转鼓式真空吸滤机、 离心沉降分离机和自动板框压滤机。
（二）酶液的脱色
工业上常用活性炭脱色。
（三）盐析法
（四）有机溶剂法
有机溶剂沉淀蛋白的能力：丙酮＞异丙醇＞乙醇＞甲醇，工业上常 用的是乙醇。
（五）喷雾干燥直接制备粉末酶制剂
但常用是冷冻干燥法
四、酶的纯化
不同的酶，其纯化工艺可以差得很大。那么，评价一个纯化工艺的 好坏，主要看两个指标：酶的比活、总活力回收。要两者兼得是很难 的；目前有关酶的纯化工艺是经验多于理论。一些纯化方法的搭配和 连贯运用，是靠不断摸索的经验积累。下面讨论一些纯化过程中经常 遇到的技术难点。
（2）工艺过程
①浸取 新鲜胰脏，除去脂肪、结缔组织等，浸入预冷的0.125M硫 酸中，速冷，在0℃保存。从酸中取出、绞碎，用0.125M硫酸浸取24h， 并不断搅拌，过滤，滤饼再次浸取，合并滤液。
②分级盐析、结晶 上述滤液中加硫铵使成40%饱和度，置冷室过 夜，过滤，滤液再硫铵70%饱和度冷室过夜沉淀，过滤，滤液再硫铵 70%饱和度沉淀，过滤，沉淀溶于冷水，再重复硫铵沉淀，过滤。