微孔板检测技术的原理和应用

Coating
*
*
= Antibody = Antigen = Enzyme * = Incubation, Washing, Aspiration
Test Procedure
Photometric Measurement
实例：细胞活性检测（MTT）
• 细胞代谢活动与活细胞数 直接成比例（线粒体的活 性脱氢酶的活性）
光吸收的应用
• 如果光的强度变化能够反映被测量物的待测性质， 则显色反应都可以使用光吸收
– 核酸和蛋白质的紫外光吸收检测 – 酶联免疫检测（ELISA） – 酶动力学分析 – 细菌内毒素检测 – 乙酰胆碱脂酶检测 – 细胞活性检测（MTT） – 环境监测
核酸的紫外光吸收检测
• DNA，RNA的吸收峰在260nm
• 方法：鲎血细胞基质染色试验 • 原理：LPS作用于鲎血细胞溶解物中的凝固
• 样品的吸光度
A998 – A900: 0.132 OD A260: 0.084 OD
实例：DNA浓度的测量
• 光程的校正
Absorbanceper _ cm _ pathlength
=
A sample
= A sample * A water cm1
Hale Waihona Puke Baidu
Pathlength
A 998 A 900
Absorbanceper _ cm _ pathlength
= 0.084 * 0.159 = 0.101 OD 0.132
• DNA的分光光度计标准，1 OD/cm
– 相当于50ng/ul DNA
– 相当于40ng/ul RNA
– 相当于33ng/ul Oligo
• 结果计算：0.101×50ng/ul=5.05ng/ul
实例：蛋白定量
Coomassie Brilliant Blue G-250
– Pathlength：实际的光程
•A977：水溶液样品在977nm的吸光值 •A900：水溶液样品本底 •Awatercm-1：1cm光程比色杯中水的吸光 度值（ A977 ）－本底值（ A900 ）
光程测量法
• 水相样品的吸收值/cm光程：
Absorbanceper _ cm _ pathlength
470 nm
CBG 是一种指示剂
595 nm
加入蛋白质
酸性环境下呈茶色
与蛋白质结合变蓝色
实例：ELISA
• 抗原，抗体，底物，显色反应 • 阴性域值，阳性程度，定量
Antibody Patient Sample (Antigen) Enzyme Conjugate Substrate Stop Solution
光的性质
• 基本性质
– 速度：3×108m/s – 波长：颜色 – 频率：能量E = hν
• 其他性质
– 偏振 – 荧光：激发
c = λ ×ν
光的性质
• 物体的颜色
– 白光是复合光 – 单色光 – 互补色光
• 溶液的颜色
– 由溶液中的质点（分子， 离子）吸收特定波长的 光，透射其互补色的光
– 吸收曲线
=
A sample
=
Pathlength
A sample * A water cm1 A 977 A 900
Asample：样品在特定波长的吸光值
• 光程的校正
– 水：998nm等消光点（受温度影响小） 977nm吸收峰
实例：DNA浓度的测量
• 水的吸光度/cm
Result: Awater: A998 – A900: 0.159 OD/cm
K收M曲n线O4溶液的吸 (cKMnO4: a<b<c<d)
原理及应用介绍大纲
• 光的物理简介 • 光吸收检测的原理与应用实例 • 荧光检测的原理与应用实例 • 发光检测的原理与应用实例
光吸收检测的原理
• 当光穿过待测物时，光的强度（能量）发 生变化
Absorbance = lg I0 = e ×c ×b
0,14 0,12
0,10
OD
– 通过水的吸收值（1cm光
0,08 0,06
0,04
程）来求得实际光程
0,02
0,00
850
870
890
910
930
950
970
990
nm
– 水在977nm有吸收峰，在
900nm几乎无吸收（与溶Pathlength 质的吸收峰无重叠）
=
A 977 A 900 A water cm1
• MTT：
– 一种甲氮唑盐，是细胞线粒 体脱氢酶的底物；活 细胞内 的线粒体脱氢酶可将MTT分 解产生蓝黑色（fromazan） 产物
– 进入活细胞，被分解，裂解 细胞，分析吸光度
Fromazan吸光谱
实例：细胞活性检测（MTT）
实例：内毒素检测（LPS）
• LPS：存在于革兰阴性(G－)细菌细胞壁外 层，脂多糖，为细菌类属的共同抗原，介 导多种生物效应。可作为多种与G－细菌相 关疾病的诊断和预后指标
微孔板检测技术的原理和应用
张智彧 应用工程师
原理及应用介绍大纲
• 光的物理简介 • 光吸收检测的原理与应用实例 • 荧光检测的原理与应用实例 • 发光检测的原理与应用实例
光的物理简介
• 光的本质 • 光的性质
光的本质
• 一种能量
– 电磁波
– 电子能级（轨道）
红
• 波粒二相性
外 线
– 衍射
– 光电效应
100
%
10
%
1
%
0.1
%
0.01
%
0.001 %
0.0001 %
0.00001 %
0.000001 %
% of Light Absorbed:
0
%
90
%
99
%
99.9
%
99.99 %
99.999 %
99.9999 %
99.99999 %
99.999999 %
影响结果的因素
• 单色光不纯 • 非平行入射光 • 介质不均匀 • 溶液浓度过高 • 溶液中发生化学反应
I
I
（公式反应了与浓度的依赖关系）
0
I0 入射光强度
I 透射光强度
e 摩尔消光系数
I
b 光程
c 样品浓度
吸光值(Absorbance)的意义
Absorbance (Optical Density):
% of Light Transmitted:
0 OD 1 OD 2 OD 3 OD 4 OD 5 OD 6 OD 7 OD 8 OD
– 标准曲线法 – 光程测量法（光程未知【酶标板】）
• 校正吸收值到1cm光程 • 通过水（如果溶剂是水）的1cm光程吸收值来校正
标准曲线法
• 作光吸收最常用的方法
– 已知浓度样品 – 吸收值（同一光程【比色杯】） – 标准曲线 – 未知吸收值带入，得到未知样品浓度
光程测量法
0,16
• 光程不一致时（酶标板）