阿霉素自组装纳米粒的制备及其抗肿瘤活性的研究

浙江中医药大学学报 2013 年 8 月第 37 卷第 8 期
阿霉素自组装纳米粒的制备 及其抗肿瘤活性的研究
JOURNAL OF ZHEJIANG CHINESE MEDICAL UNIVERSITY VOL. 37 NO.8 Aug. 2013
诸佳珍 李范珠
浙江中医药大学药学院 杭州 310053
通讯作者:李范珠，E-mail:lifanzhu@
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浙江中医药大学学报 2013 年 8 月第 37 卷第 8 期
诸佳珍，等：阿霉素自组装纳米粒的制备及其抗肿瘤活性的研究
物学研究所)；DMEM 高糖培养液、胰蛋白酶（吉诺生 物医药技术有限公司）；四氮唑蓝（MTT）和二甲基亚 砜（DMSO）（美国 Sigma 公司）；其他试剂均为分析纯。 2 方法 2.1 ADM-CHSP-SAN 的制备 精密称取盐酸阿霉素 适量溶于含有三乙胺（TEA）的 DMSO 溶液中[6（] TEA: ADM=3:1，mmoL:mmoL），室温搅拌过夜后，逐滴加入 到含 15 mg CHSP 的 DMSO 溶液中，避光搅拌 3h 后，将混合溶液转入透析袋中，用蒸馏水避光透析 24h。将透析袋中溶液在冰浴下间歇式超声 2min， 0.45μm 微孔滤膜过滤，冷冻干燥后，即得橘红色 ADM-CHSP-SAN 冻干品[7]。 2.2 形态、粒径和 Zeta 电位 取适量 ADM-CHSPSAN 混悬液滴于喷碳铜网上，2.0%磷钨酸溶液负染 3 min，挥干，透射电镜观察形态并摄制照片，激光粒度 测定仪测定平均粒径和 Zeta 电位。 2.3 包封率与载药量的测定 采用有机溶剂破坏法 [8-9] 测定 ADM-CHSP-SAN 的包封率与载药量。量取 1mL ADM-CHSP-SAN 混悬液于 9mL 的 DMSO 中， 在 482 nm 处测定吸光度，以相同溶剂的 CHSP-SAN 为参照溶剂，计算包封率和载药量。 2.4 体外释药 精确量取 2mL ADM-CHSP-SAN 混 悬液，置于经处理的透析袋中（MWCO=8~14kDa），紧 密封口，分别放入盛有 25mL 的 pH7.4、pH6.8、pH5.0 的 PBS 溶液中，（37±0.5）℃恒温水浴振荡（100r/min）， 分 别 于 0.17、0.33、0.5、0.67、0.83、1、2、3、4、8、12、24、 48 h 将整个释放介质用新鲜介质替换，在 482 nm 处 测定其吸光度，计算药物累积释放百分率，绘制释放 曲线。 2.5 体外抗肿瘤活性 2.5.1 U251 细胞的复苏及培养 取出冻存有人神经 脑胶质瘤细胞 U251 的冻存管，置于 37 ℃水浴，振摇 速融后，吸取细胞悬液，移至含有 10 倍培养基的离心 管中，混合后低速离心 5min（1500r/min），除去上清 液。用含 10% 胎牛血清、100 IU·mL-1 青霉素、100 μg·mL-1 链霉素的 DMEM 高糖培养基稀释，接种于培 养瓶，置于 37℃、5% CO2 饱和湿度的培养箱中传代 培养。 2.5.2 抗 U251 肿 瘤 细 胞 实 验 取 对 数 生 长 期 的 U251 肿瘤细胞，PBS 洗两遍之后，0.25%胰蛋白酶消 化，用含 10%胎牛血清的高糖 DMEM 培养液配成单
个细胞悬液，以台盼蓝拒染法计数后，调整至 1×105
个·mL-1 细胞浓度，接种于 96 孔细胞培养板中，于
37℃、5%CO2 细胞培养箱内孵育 24 h，加入浓度分别 为 0.04、0.2、1.0、5.0、25.0、125.0μg·mL -1 的 ADM -
CHSP-SAN 和 ADM-sol 的培养基溶液，孵育 48h 后，
细胞生长抑制率(%)＝(1-
加药细胞 对照细胞
OD OD
值 值
）×100%
2.6 统计学分析 各组数据以 x±s 表示，采用统计
学软件 SPSS 17.0 对数据进行分析，多组间差异采用
一维方差分析，两组间差异采用 t 检验分析。
3 结果
3.1 ADM -CHSP -SAN 的 性 质 ADM -CHSP -SAN
ulan，CHSP）是一种两亲性接枝聚合物，具有良好的 Bio-RAD 公司）。
生物相容性和生物降解性[5]。本实验以 ADM 为模型 1.2 药品与试剂 盐酸阿霉素（浙江海正制药有限
药物，CHSP 为载体材料，制备了两亲性的 CHSP 自组 公司，纯度＞98%，批号 100210）；盐酸阿霉素对照品
外观为橘红色、乳光明显的均一体系，透射电镜下观
Байду номын сангаас
察载药纳米粒呈圆形或类圆形，大小及分布较均匀，
粒子之间未见粘连和聚集现象，见图 1。ADM-CHSP-
并考察载药自组装纳米粒对人神经脑胶质瘤细胞的
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人神经脑胶质瘤细胞 U251 (中国科学院上海细胞生
著
基金项目:浙江中医药大学科研基金（2012ZY16）
Fund project: The Scientific Research Fund of Zhejiang Chinese Medicine University（2012ZY16）
阿霉素（adriamycin，ADM）是临床常用的抗肿瘤 抗肿瘤活性，为 ADM-CHSP-SAN 的进一步临床研究
广谱药物，目前已上市的盐酸阿霉素注射液虽克服了 提供参考。
阿霉素不稳定，易水解、光解等不足，但由于其水溶性 1 材料
强，较难透过血脑屏障，使其在治疗脑胶质瘤疾病的 1.1 仪器 Labconco 冷冻干燥机（美国 Labconco 公
装纳米粒（Self-assembled ADM-loaded cholesterol- （中国药品生物制品检定所，批号 130509-200301）；
modified pullulan nanoparticles，ADM -CHSP -SAN）， CHSP（由中国医学科学院生物医学工程研究所提供）；
应用上受限[1]。自组装纳米粒（self-assembled nano- 司）；Zetasizer Nano-ZS 粒度测定仪（英国马尔文仪器公
particle，SAN） 是由两亲性聚合物单体在溶液中自动 司）；UV-1700 紫外可见分光光度计（日本岛津公司）；
反应形成的纳米粒。作为新型载药系统，自组装纳米 Hitachi H-7650 透射电子显微镜（日本 Hitachi 公司）；
摘要：[目的]制备胆固醇基普鲁兰多糖阿霉素自组装纳米粒（Self-assembled ADM-loaded cholesterol modified pullulan nanoparticles, ADM-CHSPSAN）并考察其体外抗肿瘤活性。[方法]以胆固醇基普鲁兰多糖（cholesterol-modified pullulan，CHSP）为载体，采用透析法制备 ADM-CHSPSAN，并测定其形态、粒径、Zeta 电位、包封率和载药量，采用 MTT 法研究其抑制 U251 肿瘤细胞的活性作用。[结果]ADM-CHSP-SAN 外观呈圆 形或类圆形，平均粒径为（112.8±1.02）nm，Zeta 电位为（-27.2±0.246）mV，包封率和载药量分别为（67.14±1.21）%和（7.65±0.58）%；体外释药行为符 合 Higuchi 方程；给药剂量大于 25 μg·mL-1 时，ADM-CHSP-SAN 抑制 U251 肿瘤细胞的活性作用明显优于阿霉素溶液剂（P<0.01）。[结论]将阿 霉素制备成 ADM-CHSP-SAN 可有效提高药物的抗肿瘤活性。 关键词：阿霉素；胆固醇基普鲁兰多糖；自组装纳米粒；体外释放；抗肿瘤 中图分类号：R331 文献标识码：A 文章编号：1005-5509（2013）08-0951-05 Preparation and Research on the Aniti -Tumor Activity of Adriamycin Self -assembled Nanoparticles Zhu Jiazhen，Li Fanzhu College of Pharmaceutical Science, Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou (310053), China Abstract:[Objective] To prepare adriamycin self-assembled nanoparticles, and study the in vivo anti-tumor activity. [Methods]The self-assembled adri－ amycin loaded cholesterol-modified pullulan nanoparticles were prepared by dialysis and were characterized by morphology for particle size,Zeta potential, entrapment efficiency,drug loading content.They were incubated with U251 cells to assess the inhibition ability of the self-assembled adriamycin-loaded cholesterol -modified pullulan nanoparticles. [Results]The morphology of self -assembled adriamycin loaded cholesterol -modified pullulan nanoparticles was spherical. The mean particle size, Zeta potential, entrapment efficiency and drug loading were (112.8 ±1.02)nm,(-27.2±0.246)mV,(67.14±1.21)% and (7.65±0.58)%, respectively.The profiles of release were expressed well by Higuchi equation. When the dosages were 25 μg·mL-1 plus, the inhibiton ability against U251 was stronger than adriamycin solution(P<0.01).[Conclusion]The self-assembled adriamycin loaded cholesterol-modified pullulan nanoparticles exhibited more cycitoxic activity against U251 than adriamycin solution. Key words: adriamycin; cholesterol-modified pullulan; self-assembled nanoparticles; in vitro release; antitumor