实验二抑制剂对酶促反应速度的影响-(1)
影响酶促反应的因素
酶的竞争性和非竞争性抑制可通过双倒数作图加以区 不因竞争性抑制剂的存在而改变， 别。Vmax不因竞争性抑制剂的存在而改变，Km则不因非 不因竞争性抑制剂的存在而改变 则不因非 竞争性抑制剂的存在而改变。 竞争性抑制剂的存在而改变。
固定酶反应的其它条件，在不同pH处测定酶反应速度，可 得各种类型的酶活性与pH关系
生化学家将酶活性最高处的pH称为最适pH。一般来说，血 清中大多数酶最适pH接近中性（pH6.5-7.5）。有些酶在最适 pH处活性变化尖锐明显，也有些平坦宽广。测定酶活性浓度时 一定要选择在最适pH处，不仅因为此处酶反应速度最大，测定 灵敏度最高，还因为此处酶活性变化的斜率最小，如反应体系 中出现pH变化时，对测定结果影响最小。
2. 专一性不可逆抑制
此属抑制剂专一地作用于酶的活性中心或其必需基团，进行 共价结合，从而抑制酶的活性。有机磷杀虫剂能专一作用于胆碱 酯酶活性中心的丝氨酸残基，使其磷酰化而不可逆抑制酶的活性。 当胆碱酯酶被有机磷杀虫剂抑制后，胆碱能神经末稍分泌的乙酰 胆碱不能及时分解，过多的乙酰胆碱会导致胆碱能神经过度兴奋 的症状。解磷定等药物可与有机磷杀虫剂结合，使酶和有机磷杀 虫剂分离而复活。
五、pH对酶的作用 pH对酶的作用
当pH变化时，可影响到底物、酶、酶-底物复合物的解离状 态和构型，甚至还可能影响到各种辅因子，从而影响酶活性。 PH对酶还有一个重要的作用，就是影响酶的稳定性。 最适pH并非是酶的特征性常数，易受多种因素影响而改变， 如缓冲液的种类、底物浓度、温度等，在研究pH对酶稳定性影 响还应注意到酶浓度高低，在低浓度时，酶易解离为单体，常比 多聚体更易灭活。
(二)可逆性抑制(reversible inhibition) 可逆性抑制(reversible
酶促反应动力学实验报告
酶促反应动力学实验报告14301050154 杨恩原实验目的：1.观察底物浓度对酶促反应速度的影响2.观察抑制剂对酶促反应速度的影响3.掌握用双倒数作图法测定碱性磷酸酶的Km值实验原理：一、底物浓度对酶促反应速度的影响在温度、pH及酶浓度恒定的条件下，底物浓度对酶的催化作用有很大的影响。
在一般情况下，当底物浓度很低时，酶促反应的速度(v)随底物浓度[S]的增加而迅速增加，但当底物浓度继续增加时，反应速度的增加率就比较小，当底物浓度增加到某种程度时反应速度达到一个极限值(即最大速度Vmax)。
底物浓度和反应速度的这种关系可用米氏方程式来表示(Michaelis-Menten方程)即：式中Vmax为最大反应速度，Km为米氏常数，[S]为底物浓度当v=Vmax/2时，则Km=[S]，Km是酶的特征性常数，测定Km是研究酶的一种重要方法。
但是在一般情况下，根据实验结果绘制成的是直角双曲线，难以准确求得Km和Vmax。
若将米氏方程变形为双倒数方程(Lineweaver-Burk方程)，则此方程为直角方程，即:以1/V和1/[S]分别为横坐标和纵坐标。
将各点连线，在横轴截距为-1/Km，据此可算出Km值。
本实验以碱性磷酸酶为例，测定不同浓度底物时的酶活性，再根据1/v和1/[S]的倒数作图，计算出其Km值。
二、抑制剂对酶促反映的影响凡能降低酶的活性，甚至使酶完全丧失活性的物质，成为酶的抑制剂。
酶的特异性抑制剂大致上分为可逆性和不可逆性两类。
可逆性抑制又可分为竞争性抑制和非竞争性抑制等。
竞争性抑制剂的作用特点是使该酶的Km值增大，但对酶促反映的最大速度Vmax值无影响。
非竞争性抑制剂的作用特点是不影响[S]与酶的结合，故其Km值不变，然而却能降低其最大速度Vmax。
本实验选取Na2HPO4作为碱性磷酸酶的抑制物，确定其抑制作用属于哪种类型。
实验步骤：实验一:底物浓度对酶促反应速度的影响1.取试管9支，将0.01mol/L基质液稀释成下列不同浓度：管号试剂2.另取9支试管编号，做酶促反应：管号试剂3.混匀，37 ℃水浴保温5分钟左右。
生化实验酶促反应动力学实验
抑制剂↑ 无抑制剂
1/[S]
反竞争性抑制
抑制剂仅与酶和底物形成的中间产物结合，是中间产物的 量下降，既减少了中间产物转化为产物的量，也减少了从 中间产物解离出游离酶和底物的量。
特征曲线
1/V
Vmax降低，Km降低
抑制剂↑ 无抑制剂
1/[S]
本次实验方案
本实验以磷酸苯二钠为底物，碱性磷酸酶 AKP为催化剂，磷酸氢二钠作为抑制剂， 分别观察无抑制剂和有抑制剂时底物浓度 与酶促反应速度之间的关系。
实验二
酶促反应动力学实验
前言
❖ 酶促反应动力学：
研究酶促反应速度及其影响因素的科学。
❖ 研究的理论和实践意义：
➢ 有助于阐明酶的结构与功能的关系。 ➢ 也可为酶作用机理的研究提供数据。 ➢ 帮助寻找最有利的反应条件，以最大限度地发挥酶催化反应
的高效率。 ➢ 有助于了解酶在代谢中的作用或某些药物作用的机理等。
四、抑制剂对酶促反应的影响
Competitive 竞争inh性ib抑ito制rs剂Leabharlann Inh抑ib制ito剂rs
酶的活性下降但 不引起酶变性的 物质
Reversible 可逆in性hib抑it制or剂s 不可Irr逆ev性er抑sib制le剂
inhibitors
N非o竞nin-c争hoi性bmitp抑oer制tsiti剂ve An反tii竞-ncho争imb抑iptoe制rtsi剂tive
底物浓度相同（mM）；
Km
[S]
Km 是 酶 的 特 征 性 常 数 之 一 ， 可
用来表示酶对底物的亲和力，
Km越小，亲和力越大。
米氏方程变换，将曲线作图改为直线作图， 可更易利用图解法得Km和Vmax
酶的反应动力学
竞争性抑制剂双倒数曲线，如下图所示：
1 ＝Km 1 〔 I 〕 1 （1+ ） + Ki 〔S〕 Vmax v Vmax
Vmax指该酶促反应的最大速度，[S]为底 物浓度，Km是米氏常数，VO是在某一底物浓 度时相应的反应速度。从米氏方程可知： 当底物浓度很低时 [S] << Km,则 V≌Vmax[S]/Km ，反应速度 与底物浓度呈正比; 当底物浓度很高时， [S]>> Km ，此时V≌Vmax ，反应速度达最大 速度，底物浓度再增高也不影响反应速度。
Vmax A B A B K A AB K s KB m
B m
A Ks KB A m Km B
v
K
A m
1 1 v Vmax
1 KB m A 1 B
1 V max
二. 酶浓度的影响
化学动力学基础
底物浓度对酶反应速率的影响 温度、pH及激活剂 对酶反应的影响
酶的抑制作用
目的与要求
重点掌握酶促反应动力学：米氏方程、 温度、pH、激活剂、抑制剂对酶促反应速 度的影响；掌握三种可逆抑制作用的动力 学特点。
化学动力学基础
各级反应的特征
1 一级反应
t1/2≈0.693/k 2 二级反应 t1/2=1/ka 3 零级反应
ES的形成速度： d„ES‟/ dt＝k1„E‟„S‟ ES的分解速度： －d„ES‟/ dt＝（k2＋k3）„ES‟ 稳态平衡下， k1„E‟„S‟ ＝（k2＋k3）„ES‟ 即：„E‟„S‟/„ES‟= （k2＋k3）/ k1=Km
而„E‟=[E]t－„ES‟代入
得：
Et ES S Km ES
温度、pH、激活剂、抑制剂对酶活性的影响
温度、pH、激活剂、抑制剂对酶活性的影响（间接碘量法）（effects of temperature pH activitor and inhibitor to activity of enzyme）一、目的1.了解温度、pH、激活剂、抑制剂对酶活性的影响2.学习酶活性的判定二、原理酶活性大小可以用反应速度来表示，即在单位时间内，酶所催化底物的消耗量或产物的生成量来衡量。
酶活性大，反应速度就快。
反之则慢。
酶促反应速度受多种因素的影响。
如温度、pH、激活剂、抑制剂等。
本实验是观察在不同温度，pH，以及缺乏激活剂或有抑制剂的条件下唾液淀粉酶的活性大小。
借以验证各种因素对酶活性的影响。
唾液中含有唾液淀粉酶，此酶可以使淀粉逐步水解，最后生成麦芽糖。
麦芽糖具有还原性。
根据淀粉被唾液淀粉酶水解后产物的生成量（即还原性麦芽糖的多少）判定酶活性的大小。
用碘的反滴定法测定还原物的量，还原物多，酶活性大。
具体反应如下：1、试剂成分（S、H、S试剂）：CuSO4、Na2CO3、NaHCO3、KI、KIO3、酒石酸钾钠、草酸钾。
2、判定酶活性大小的化学反应过程：Na2CO3＋2H2O —→2NaOH ＋ H2CO3CuSO4＋2NaOH —→Cu(OH)2↓＋ Na2SO45KI ＋KIO3 ＋ 3H2SO4—→3I2＋3K2SO4 ＋3H2O酶淀粉———→麦芽糖麦芽糖＋Cu++—→麦芽糖氧化产物＋Cu+ Cu+＋ I2—→Cu++ ＋ 2I-COO- 草酸钾COO-Cu++＋|—————→| >CuCOO- 防止逆反应COO-剩余I2 ＋ Na2S2O3—→2I- ＋ Na2S4O6（与淀粉呈兰色) （与淀粉无色)3、判定酶活性大小的标志酶活性大→麦芽糖多→Cu+ 生成量多→I2消耗量多→剩余I2少→Na2S2O3消耗量少酶活性越大，Na2S2O3消耗量越少。
空白实验无酶活性，因此Na2S2O3消耗量最多。
与空白实验进行对比，差值越大，说明此条件下酶活性越大。
pH、激活剂、抑制剂对酶活性的影响 - 实验教学中心
温度、pH、激活剂、抑制剂对酶活性的影响（间接碘量法）（effects of temperature pH activitor and inhibitor to activity of enzyme）一、目的1.了解温度、pH、激活剂、抑制剂对酶活性的影响2.学习酶活性的判定二、原理酶活性大小可以用反应速度来表示，即在单位时间内，酶所催化底物的消耗量或产物的生成量来衡量。
酶活性大，反应速度就快。
反之则慢。
酶促反应速度受多种因素的影响。
如温度、pH、激活剂、抑制剂等。
本实验是观察在不同温度，pH，以及缺乏激活剂或有抑制剂的条件下唾液淀粉酶的活性大小。
借以验证各种因素对酶活性的影响。
唾液中含有唾液淀粉酶，此酶可以使淀粉逐步水解，最后生成麦芽糖。
麦芽糖具有还原性。
根据淀粉被唾液淀粉酶水解后产物的生成量（即还原性麦芽糖的多少）判定酶活性的大小。
用碘的反滴定法测定还原物的量，还原物多，酶活性大。
具体反应如下：1、试剂成分（S、H、S试剂）：CuSO4、Na2CO3、NaHCO3、KI、KIO3、酒石酸钾钠、草酸钾。
2、判定酶活性大小的化学反应过程：Na2CO3 ＋2H2O —→2NaOH ＋ H2CO3CuSO4＋2NaOH —→Cu(OH)2↓＋Na2SO45KI ＋KIO3 ＋ 3H2SO4—→3I2＋3K2SO4 ＋3H2O酶淀粉———→麦芽糖麦芽糖＋Cu++—→麦芽糖氧化产物＋Cu+Cu+＋ I2—→Cu++ ＋ 2I-COO- 草酸钾COO-Cu++＋|—————→| >CuCOO- 防止逆反应COO-剩余I2＋Na2S2O3—→2I- ＋Na2S4O6（与淀粉呈兰色) （与淀粉无色)3、判定酶活性大小的标志酶活性大→麦芽糖多→Cu+ 生成量多→I2消耗量多→剩余I2少→Na2S2O3消耗量少酶活性越大，Na2S2O3消耗量越少。
空白实验无酶活性，因此Na2S2O3消耗量最多。
与空白实验进行对比，差值越大，说明此条件下酶活性越大。
酶学及其应用实验讲义2014
0.1mol/L 氢氧化钠（NaOH）配制。 2）材料 胰酶溶液：1mg/mL，用 0.1mol/L，pH8.0 硼酸缓冲液配制。 3）仪器 试管 1.5cm×15cm（×19）；移液管 1mL（×7），2mL（×3），5mL（×5）；量筒 100mL（×1）， 恒温水浴；冰浴（0℃）；白瓷板；胶头滴管。
操作方法
1） 温度对酶活力的影响
取 3 支试管，按下表操作：A280
操作项目
管号
1
2
3
胰酶溶液/mL
0.2
0.2
0.2
蒸馏水/mL
0.8
0.8
0.8
温度预处理 5min/℃
0
37
70
1% 酪蛋白溶液/mL
1.0
1.0
1.0
混匀后，置各相应温度保温 10min，加入 3.0mL 5%三氯醋酸溶液终止反应
标准 0.1mol/L NaOH 溶液 2） 材 料 胰酶溶液（现配以保持酶活，配后离心取上清）：称取 3g 胰酶溶于 25mL 蒸馏水中，放 入冰箱保存。 3） 器 材 50mL 三角烧瓶（×16），150mL 三角烧瓶（×4）；吸管 5mL（×1），10mL（×5）；量 筒 100mL（×4）；25mL 碱式滴定管及滴定台，蝴蝶夹；恒温水浴；滴管。
A280
空白管：先在试管中加入 1.0mL 1%酪蛋白溶液和 3.0mL 5%三氯醋酸溶液，摇匀后，再
加入 0.2mL 酶液，0.8mL 蒸馏水，在 37℃保温 10min。
将样品管和空白管分别离心，4000r/min，10 分钟，取上清液于 280nm 处测定各管的吸
酶的反应动力学
双倒数作图法
（二）双底物的反应
双底物反应的动力学
1 乒乓反应动力学
v
Vm axAB
2、〔S〕 >> 〔E〕,[S]-[ES] ≈[S]
3、反应系统处于稳态平衡状态，即〔ES〕的形成速度等于〔ES〕 的分解速度：d〔ES〕/dt＝－d〔ES〕/dt
ES的形成速度： d〔ES〕/ dt＝k1〔E〕〔S〕
ES的分解速度： －d〔ES〕/ dt＝（k2＋k3）〔ES〕
稳态平衡下， k1〔E〕〔S〕 ＝（k2＋k3）〔ES〕
（2）特点：
① 抑制剂I与底物S在化学结构上相似，能与 底物S竞争酶E分子活性中心的结合基团.
例如，丙二酸、苹果酸及草酰乙酸皆和琥珀酸 的结构相似，是琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制剂。
②抑制程度取决于抑制剂与底物的浓度比、 〔ES〕和〔EI〕的相对稳定性；
③加大底物浓度，可使抑制作用减弱甚至消除。
（3）竞争性抑制剂的动力学方程
（一）不可逆性抑制作用
不可逆性抑制作用的抑制剂，通常以共 价键方式与酶的必需基团进行不可逆结合 而使 酶丧失活性。常见的不可逆抑制剂如下图 所 示。按其作用特点，又分专一性及非专一 性两种。
1.非专一性不可逆抑制
抑制剂与酶分子中一类或几类基团作用，不论 是必需基团与否，皆可共价结合，由于其中必需基 团也被抑制剂结合，从而导致酶的抑制失活。某些 重金 属(Pb++、Cu++、Hg++)及对氯汞苯甲酸等，能与酶分 子的巯基进行不可逆适合，许多以巯基作为必需基 团 的酶(通称巯基酶)，会因此而遭受抑制，属于此种 类型。用二巯基丙醇(british anti lewisite,BAL)或二巯基丁二酸钠等含巯基的化合 物可使酶复活。
底物浓度及抑制剂对酶促反应速度的影响
底物浓度及抑制剂对酶促反应速度的影响一、实验目的：1、学习和掌握Km的测定原理和实验方法。
2、掌握竞争性抑制剂对酶活性的影响及竞争性抑制剂表观Km’的测定。
二、实验原理：1.酶的底物浓度和酶促反应速度的关系一般情况下符合米-曼氏方程：式中：v为反应初速度；Vmax为最大反应速度；[S]为底物浓度；Km为米氏常数，其单位为mmol/L。
Km值是酶的特征性常数，一般来说，Km可以近似地表示酶与底物的亲和力。
测定Km值是酶学研究中的一个重要方法。
Lineweaver-Burk作图法（双倒数作图法，图1）是用实验方法测定Km值的最常用的比较简单的方法。
Lineweaver-Burk将米氏方程改写成双倒数形式：1/ v = Km/ Vmax×1/[S] + 1/ Vmax以1/v－1/[S]作图得一个斜率为Km/ Vmax的直线，将直线外推与横轴相交，其横轴截距为-1/Km ,纵轴截距为1/Vmax ，因此实验时，选择不同的[S]，测定相应的v，依L－B双倒数方程作图，即可求得Km 和Vmax；在抑制剂存在时，即可求得表观Km 和 Vmax，竞争性抑制的动力学特点见图2。
2.本实验以碱性磷酸酶（AKP）为例，磷酸苯二钠为底物，磷酸氢二钠为其竞争性抑制剂，茶碱为其非竞争性抑制剂。
AKP催化磷酸苯二钠水解产生游离酚和磷酸盐。
酚与酚试剂应用液在碱性溶液中生成蓝色的衍生物。
根据蓝色的深浅可测出酚的含量，从而算出相应的酶促反应速度(v)。
再根据Lineweaver—Burk法作图，计算其Km 值及抑制剂存在时表观Km值的改变。
三、实验步骤：1.米氏常数测定按下表操作：2.抑制剂对酶促反应速度的影响按下表操作：3.计算以1/A660－1/[S]作图，求出Km及表观Km。
四、结果与分析：实验数据处理表格：1.米氏常数Km测定管号0 1 2 3 4 5[S](mmol/L) 2 2 3 4 6 8A6600.206 0.318 0.412 0.496 0.5532.抑制剂存在时表观Km测定管号0 1 2 3 4 5[S](mmol/L) 2 2 3 4 6 8A6600.170 0.185 0.275 0.376 0.389作图：计算：1.Km计算：由直线方程y=7.0999x+0.9662知，当y=0时，x=-0.1361，即-1/Km=-0.1361，所以Km=7.35mmol/L，纵截距为0.96622.表观Km计算：由直线方程y=10.895x+0.9662知，当y=0时，x=-0.08868，即-1/Km=-0.08868，所以Km=11.28mmol/L，纵截距为0.9662表观Km>Km,，且纵截距相等，所以抑制剂是竞争性抑制剂。
实验二影响酶促反应的因素
—
10滴
把三支管摇匀，然后分别放至相应的温度中水浴10分钟，加碘2滴
水浴温度
0℃
37℃
37℃
结果与分析
取白瓷板一块，向各凹分别加1滴碘液，每隔半分钟用滴管或玻棒从2号管取溶液1滴，加到已加有碘液的小凹中，观察颜色变化，直至与碘不呈色时（即只显棕黄色时），向各管加碘液1滴，摇匀观察颜色变化(切记勿摇动)。摇匀再观察。
（二）pH对酶促反应速度的影响
管号
1
2
3
1%淀粉溶液
10滴
10滴
10滴
pH5.0缓冲液
10滴
—
—
pH6.8缓冲液
10滴
—
pH8.0缓冲液
—
—
10滴
稀释唾液
5滴
5滴
5滴
把三支管摇匀，然后放至 37℃水浴10分钟，加碘2滴摇匀
结果与分析
取白瓷板一块，向各凹分别加1滴碘液，每隔半分钟用滴管或玻棒从2号管取溶液1滴，加到已加有碘液的小凹中，观察颜色变化，直至与碘不呈色时（即只显棕黄色时），向各管加碘液1滴，摇匀观察颜色变化。
将各管混匀，放进37℃水浴箱中保温。
管号
1
2
3
4
1%淀粉溶液
10滴
10滴
10滴
10滴
pH6.8缓冲液
10滴
10滴
10滴
10滴
蒸馏水
2滴
—
—
—
氯化钠溶液
—
2滴
—
—
CuSO4溶液
—
—
2滴
—
Na2SO4溶液
—
—
—
2滴
稀释唾液
5滴
5滴
实验二抑制剂对酶促反应速度的影响-(1)
实验二抑制剂对酶促反应速度的影响Effects of Inhibitors on the Velocity of Enzymatic
Reactions
一、实验原理
凡能降低酶活性甚至使酶丧失活性的物质，称为酶的抑制剂。
酶的特异性抑制剂可分为可逆性和不可逆性两类。
可逆性抑制剂又可分为竞争性和非竞争性两类。
竞争性抑制剂的作用特点是该酶的Km值增大，但最大的反应速率不变，而非竞争性抑制剂的作用特点是不影响底物与酶结合，故其Km值不变，而能降低其最大反应速度。
本实验中观察无机磷酸盐对碱性磷酸酶的抑制作用，用磷酸苯二钠法测酶活性，使各管底物浓度不同，其他条件相同，除各管都加有同样量Na2HPO4外，实验操作完全同前一实验。
计算结果，画出曲线，判定Na2HPO4对碱性磷酸酶的影响。
二、实验操作
摇匀，37℃保温5min
充分摇匀，37℃准确保温15min
充分摇匀，室温放置10min
在510nm，以B管调零时读取各管光密度值。
计算并作图要领同实验一，求出Km值，判定结果，Na2HPO4属于哪种抑制剂。
三、思考题
联系实验结果，讨论抑制剂对酶活性的影响。
四、英语关键词
最大反应速度：Maximum velocity
米—曼式方程：Michaelis—Menten Equation
特性常数：Characteristic constant
绘图：Plot
直线：Straight Line
截距：Intercept
斜率：Slope
磷酸苯二钠：Disodium Phenylphosphate
4-氨基安替比林：4-Aminoantipyrine。
酶促反应动力学 酶促反应动力学
实验四实验四 酶促反应动力学酶促反应动力学————pH pH pH、、温度温度、、激活剂激活剂、、抑制剂对酶促反应速度的影响抑制剂对酶促反应速度的影响目的目的：：1.了解pH、温度、激活剂和抑制剂对酶活力的影响。
2．学习测定酶最适pH 的方法。
(一) pH 对酶活力的影响对酶活力的影响1.1.实验原理实验原理实验原理对环境酸碱度敏感是酶的特点之一。
对每一种酶来说，只能在一定pH 范围内才表现其活力，否则酶即失活。
另外，在这个有限pH 范围内，酶的活力也随着环境pH 的改变有所不同。
酶通常在某一pH 时，才表现最大活力。
酶表现最大活力时的pH 称为酶的最适pH。
一般酶的最适pH 在4～8之间。
淀粉遇碘呈蓝色。
糊精按其分子大小，遇碘可呈蓝色、紫色、暗褐色或红色。
最简单的糊精和麦芽糖遇碘不呈色。
在不同条件下，淀粉被唾液淀粉酶水解的程度可由水解混合物是遇碘呈现的颜色来判断。
本实验观察pH 对唾液淀粉酶活力的影响，唾液淀粉酶的最适pH 约为6.8。
2实验器材实验器材恒温水浴锅、试管、试管架、锥形瓶（50ml 或100ml）、吸量管（1、2、5、10ml）、秒表、白瓷板、pH 试纸、稀释50倍的新鲜唾液（在漏斗内塞入少量脱脂棉，下接洁净试管，嗽口后含一小口蒸馏水，半分钟后收集过滤唾液。
取滤液2ml 放入锥形瓶内，加蒸馏水稀释至100ml，充分混匀）。
3实验试剂实验试剂（1）新配制的溶于0.3%NaCl 的0.5%淀粉溶液称取可溶性淀粉0.5g，先用少量0.3%NaCl 溶液加热调成糊状，再用热的0.3%NaCl 溶液稀释至100ml。
（2）0.2mol/L Na 2HPO 4溶液称取Na 2HPO 4·7H 2O 53.65g(或Na 2HPO 4·12H 2O 71.7g),溶于少量蒸馏水中,移入1000ml 容量瓶,加蒸馏水稀释到刻度。
（3）0.1mol/L 柠檬酸溶液称取含一个水分子的柠檬酸21.01g，溶于少量蒸馏水中，移入1000ml 容量瓶，加蒸馏水至刻度。
抑制剂对酶促反应的影响
第一页，课件共有22页
酶促反应（Enzyme catalysis）又称酶催化或 酵素催化作用，指的是由酶作为催化剂催化进行的 化学反应。
❖ kinetics of enzyme-catalyzed reactions,酶反 应动力学主要研究酶催化的反应速度以及影 响反应速度的各种因素。这些因素包括酶浓 度、底物浓度、pH 值、温度、激活剂和抑 制剂等。
反竞争性抑制机理
E+S
ES
P+ E
+
I
ESI
第十三页，课件共有22页
Uncompetitive inhibitor
反竞争性抑制剂与酶的结合部位
第十四页，课件共有22页来自特点a.抑制剂与底物可同时与酶的不同 部位结合；
b.必须有底物存在，抑制剂才能对 酶产生抑制作用；
c.动力学参数：Km减小，Vm降低。
特点
a.底物和抑制剂分别独立地与的不同部 位相结合；
b.抑制剂对酶与底物的结合无影响，故 底物浓度的改变对抑制程度无影响；
c.动力学参数：Km值不变，Vm值降低。
第十八页，课件共有22页
非竞争性抑制剂与酶的结合部位
如某些金属离子（Cu2+、Ag+、Hg2+）以及EDTA
等，通常能与酶分子的调控部位中的-SH基团作用， 改变酶的空间构象，引起非竞争性抑制
第七页，课件共有22页
① 竞争性抑制
抑制剂与底物竞争与酶 的同一活性中心结合，从而 干扰了酶与底物的结合，使 酶的催化活性降低，这种作 用就称为竞争性抑制作用。
第八页，课件共有22页
特点
a.竞争性抑制剂往往是酶的底物类似物或 反应产物； b.抑制剂与酶的结合部位与底物与酶的结 合部位相同； c.抑制剂浓度越大，则抑制作用越大；但 增加底物浓度可使抑制程度减小；
生物化学资料：底物浓度及抑制剂对酶促反应速度的影响
混匀 37℃ 5´
－
0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
混匀 37℃ 15´ （每管准确计时）
酚试剂
1.0
1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
10％Na2CO3
3.0
3.0 3.0 3.0 3.0 3.0
混匀 37℃ 15´
A660
以1/A660－1/[S]作图，求出表观Km
注意事项
加AKP
①用100μl移液枪加 ②在水浴箱中加 ③准确计时 ④立即混匀 ⑤ 0管不加
底物浓度及抑制剂对酶促反应速度的影响
1.观察底物浓度对酶促反应速度的影响。 2.观察抑制剂对酶促反应速度的影响。 3.掌握用双倒数作图法测定碱性磷酸酶的km值。
酶动力学实验研究对象 酶促反应初速度 影响因素：
酶动力学实验注意事项 反应pH值 反应温度 反应时间
酶促反应动力学:
研究酶促反应的速度以及影响此 速度的各种因素的科学。
加酚试剂
①用1000μl移液枪加 ②在水浴箱中加 ③准确计时 ④立即混匀
1.取样量准确,保温准确，加样顺序要一致，每 步均混匀。
2.同一组实验用相同的比色计。
3.作图时,实验点不在同一条直线上时,尽量使各 点平均分布在直线的两侧,两图画在同一坐标 纸上,便于判断。
绘图与数据处理：
两条直线必须在纵轴上交于一点。
影响酶促反应速度(V)的因素:
1.底物浓度 [S] 3.温度 5.酶的激活剂
2.酶的浓度 4.pH 6.酶的抑制剂
（一）底物浓度对酶促反应速度的影响
当底物浓度较低时,V随[S]的增大而急剧上升,两 者成正比关系.随着底物浓度继续增加,反应速度增 加,而幅度不断下降,若继续加大[S]反应速度就不 再增加,达到一个极限值Vmax.
抑制剂对酶促反应速度的影响
二、不可逆性抑制剂
1．概念： 抑制剂通过与酶或酶-底物复合物非共价键结合抑制酶促反应，抑制
效应的强弱取决于掏剂与底物的浓度之比以及它们与酶的亲和力之比。 采用透析或超滤的方法，可将抑制剂除去，使酶恢复活性。因此是可逆 的。 2．分类：
2. 常见类型 ➢ 巯基酶抑制剂 ➢ 丝氨酸酶抑制剂
（一）巯基酶抑制剂
➢ 巯基酶：以巯基为必需基团的一类酶 ➢ 巯基酶抑制剂：砷化合物、重金属
作用机制：破坏巯基，使酶活性丧失 ➢ 常用解毒剂：二巯基丙醇、二巯基丁二酸钠
作用机制：以其分子中的巯基置换出酶蛋白巯基，使酶活性恢复
（一）巯基酶抑制剂
（二）丝氨酸酶抑制剂
抑制剂对酶促反应速度的影响
酶促反应特点
可逆性抑制
主要内容
重要概念：
不可逆性抑制
抑制剂
1．概念 能使酶促反应速度下降而不引起酶蛋白变性的物质称为酶的
抑制剂(I)。 2．分类
一、不可逆性抑制剂
1. 原理 抑制剂通过与酶的必需基团结合使酶失活，从而使酶促反应 减慢甚至停止，而且用透析、超滤等物理方法不能去除，称 为不可逆抑制剂，它们的抑制作用称为不可逆抑制作用。
➢ 依据：根据抑制剂与酶和底物的关系 ➢ 类型：竞争性抑制、非竞争性抑制和反竞争性抑制
二、不可逆性抑制剂
分类
竞争性抑制
非竞争性抑制
反竞争性抑制
抑制剂结合对象
酶
酶、酶-底物复合物 酶-底物复合物
（一）竞争性抑制剂
抑制剂与底物结构相似，通过与底物竞争酶的活性中心抑制酶促 反应。
（一）竞争性抑制剂
实验二 影响酶促反应的因素
• 煮沸唾液的制备 取上述唾液约5ml，放入沸水中 煮沸5分钟，取出备用。
实验二 温度、pH 值、激活 剂和抑制 剂对酶活 性的影响 及特异性
A
1
一、实验目的
➢1．通过实验，观察温度、pH值、激活剂 与抑制剂对酶促反应速度的影响。
➢2．能运用所学的生化知识对实验结果进行 正确的分析。
A
2
二、实验原理
淀粉
＋
碘
↓
蓝 色
糊精
麦芽糖和葡萄糖
＋
＋
碘
碘
↓
紫色→红色→无色
↓
无色
• 利用淀粉及其水解产物的颜色反应，来比较唾液淀粉酶在
A
5
பைடு நூலகம்
➢5.0.9%NaCl溶液 ➢6.1% CuSO4溶液 ➢7.碘液 9.试管架 ➢11.试管夹 ➢12.滴管 ➢13.白瓷板 ➢14.恒温水浴箱 ➢15.电炉 ➢16.烧杯
A
6
【注意事项】 1.注意实验器材的干净，避免杂质影响反应
结果 2.各管反应时间应严格控制，保证一致。
A
7
四、实验方法
管号
1
2
3
1%淀粉溶液
10滴 10滴 10滴
pH5.0缓冲液
10滴
—
—
pH6.8缓冲液
10滴
—
pH8.0缓冲液
—
温度、激活剂和抑制剂对酶活力的影响
医学Байду номын сангаасpt
4
（二）激活剂和抑制剂对酶反应的影响
酶活力常受到有些物质的影响,有些物质
剂
能使酶活力增i] 强,称为酶的激活剂； 另一些物 质则能使酶活力降低，称为酶的抑制剂。
医学ppt
5
三、试剂和器材
1、实验器材 (1)恒温水浴锅 (2)试管 (3)烧杯 (4)量筒 (5)玻璃 棒 (6)白磁板 (7)铁三角架 (8)酒精灯 (10 )试 管夹 (11)试管架 (12)秒表
因此大多数酶都有一个最适 温度(即酶促反应速度最快 时的环境温度)
酶的最适温度不是一个常数， 它与作用时间长短有关。
医学ppt
3
人唾液中淀粉酶为α-为淀粉酶，在唾液腺细 胞内合成。在唾液淀粉酶的作用下，淀粉被 水解，经过一系列被称为糊精的中间产物， 最后生成麦芽糖。不同阶段的糊精遇碘有 不同颜色反应，分别呈现为：
思考题
1、 高温导致酶活性丧失的分子机理是什么？如何在酶 的分离纯化中克服这种影响？
2、 哪些因素可以导致酶活医性学pp的t 降低？
10
实验二 温度、激活剂和抑制剂对 酶活力的影响
医学ppt
1
一、实验目的
1、了解温度对酶活性的影响，学会检测酶最 适温度的方法。
2、了解激活剂和抑制剂对酶活性的影响。 3、学习检测激活剂和抑制剂影响酶促反应速
度的原理和方法。
医学ppt
2
二、实验原理 （一）温度对酶活性的影响
一方面是温度升高,酶促反 应速度加快。 另一方面,温度升高,也将导 致酶活性降低甚至丧失。
医学ppt
7
管号
1
2
实验酶促反应的影响因素
实验酶促反应的影响因素此实验可以根据酶的特性，设计影响酶促反应的各种因素，并进行实验检验。
（一）酶的激活剂和抑制剂一、实验目的1．了解酶促反应的激活与抑制。
2．学习鉴定激活剂和抑制剂影响酶反应的方法和原理。
二、实验原理酶的活性常受某些物质的影响，有些物质能使酶的活性增加，称为酶的激活剂；有些物质能使酶的活性降低，称为酶的抑制剂。
例如，氯化钠为唾液淀粉酶的激活剂，硫酸铜为其抑制剂。
通常少量的激活剂或抑制剂就会影响酶的活性，而且常具有特异性。
但是，值得注意的是激活剂和抑制剂不是绝对的，有些物质在低浓度时为某种酶的激活剂，而在高浓度时则为该酶的抑制剂。
例如氯化钠达到1/3饱和度时就可抑制唾液淀粉酶的活性。
三、器材1．试管及试管架 2．烧杯、椎形瓶和量筒（100mL）3．玻璃漏斗 4．吸管 5．滤纸 6．恒温水浴锅四、试剂1． 1% 淀粉溶液2．稀释100~200倍的新鲜唾液3． 1%氯化钠溶液4．0.1 %硫酸铜溶液5．碘化钾-碘溶液：将碘化钾20g 和碘10g 溶于100 mL水中，使用前稀释10倍。
五、操作方法取3支试管，向第一支试管中加入1%氯化钠溶液1 mL，向第二支试管中加入 0.1%硫酸铜溶液1 mL，向第3支试管中加入蒸馏水1mL作对照。
再向每支试管各加入 0.1%淀粉溶液3 mL和稀释的唾液1 mL。
摇匀各管，充分混合，一起放入37℃恒温水浴中保温10~15分钟后取出。
冷却后，各滴入2-3滴碘化钾-碘溶液。
混匀。
观察比较3支试管颜色的深浅，并解释之。
如果激活剂或抑制剂的作用不明显，主要可能原因是唾液淀粉酶的活性不够高，可以适当延长反映时间或者降低唾液稀释的倍数。
思考题1．激活剂可以分为哪几类？本实验中氯化钠属于其中的哪一类？2．抑制剂和变性剂有什么不同？试举例说明。
3．酶反应的抑制作用有哪些类型？根据什么划分的？它们都有什么特点？（二）温度对酶活性的影响一、实验目的通过检验不同温度下唾液淀粉酶的活性，了解温度对酶活性的影响。
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实验二抑制剂对酶促反应速度的影响Effects of Inhibitors on the Velocity of Enzymatic
Reactions
一、实验原理
凡能降低酶活性甚至使酶丧失活性的物质，称为酶的抑制剂。
酶的特异性抑制剂可分为可逆性和不可逆性两类。
可逆性抑制剂又可分为竞争性和非竞争性两类。
竞争性抑制剂的作用特点是该酶的Km值增大，但最大的反应速率不变，而非竞争性抑制剂的作用特点是不影响底物与酶结合，故其Km值不变，而能降低其最大反应速度。
本实验中观察无机磷酸盐对碱性磷酸酶的抑制作用，用磷酸苯二钠法测酶活性，使各管底物浓度不同，其他条件相同，除各管都加有同样量Na2HPO4外，实验操作完全同前一实验。
计算结果，画出曲线，判定Na2HPO4对碱性磷酸酶的影响。
二、实验操作
摇匀，37℃保温5min
充分摇匀，37℃准确保温15min
充分摇匀，室温放置10min
在510nm，以B管调零时读取各管光密度值。
计算并作图要领同实验一，求出Km值，判定结果，Na2HPO4属于哪种抑制剂。
三、思考题
联系实验结果，讨论抑制剂对酶活性的影响。
四、英语关键词
最大反应速度：Maximum velocity
米—曼式方程：Michaelis—Menten Equation
特性常数：Characteristic constant
绘图：Plot
直线：Straight Line
截距：Intercept
斜率：Slope
磷酸苯二钠：Disodium Phenylphosphate
4-氨基安替比林：4-Aminoantipyrine。