光学显微镜.ppt

放大率= 物镜放大率（Mob）×目镜放大率（Moc）
Mob=△/F1
Moc=250/F2
M=△/F1×250/F2
△为标准镜筒长度160mm， F1为物镜的焦距 250为明视距离（mm）， F2为目镜的焦距
分辨率和放大率的关系
分辨率由物镜决定，且物镜决定显微镜的 成像质量。
目镜的作用，只是把物镜所能分辨的物体 点距离放大到人眼容易分清的程度。
研究； 荧光显微镜利用标本发出的荧光来观察物体； 立体显微镜可用来观察物体的立体像等； 投影显微镜可将物像投影在投影屏上，供几个人
同时观察。
光和眼睛的特性
光
人眼
只能根据光 的强度和颜 色的不同来 进行判断 。
如何观察细胞？
● 明视场 ● 荧光
● 暗视野 ● 相位差（负相衬） ● 相位差（正相衬） ● 偏光 ● 微分干涉差 ● 霍夫曼调制相衬
观察对象可以是正常情况下所不能分辨 的，或者是较大的物体只能看到模糊的 象，但物体的细节并不清楚。
（三）相差（衬）显微镜
Phase Contrast Microscope
用于观察生活细胞或未经染 色细胞的形态结构。
生活细胞无色透明，细胞内 各种结构间的反差很小，在 一般光学显微镜下难以观察 到细胞的轮廓及内部结构， 必须使用相差显微镜。
3.荧光显微镜光路图
1.激发滤板 2.分光器 3.压制滤板
4.医学研究常用的荧光物质（探针）
异硫氰酸荧光素（FITC）
–490-495nm；520-530nm；黄绿色
四甲基异硫氰酸罗达明 （TMRITC ）
–550nm；620nm；橙红色
得克萨斯红 （Texas red ）
–590-595nm；620-630nm；红色
暗视场的实现
在明视场的基础上加装暗 视场聚光器。
聚光镜中央有挡光片，照 明光线不直接进人物镜， 只允许被标本反射和衍射 的光线进入物镜，因而视 野的背景是黑的，物体的 边缘是亮的。
暗视场显微镜的应用
暗视场观察方式主要应用于微生物学和 工业检测等领域。
如原虫、细菌的鞭毛、伪足运动、螺旋体、尿 管形、结晶等以及胶体化学领域观察溶质粒子 的布朗运动。
三维成像原理
利用人眼形成立体 空间的原理，采用频 闪液晶片使人类以前 不能分析辨别的立体 结构在光学放大下拥 有图像深度信息的三 维立体效果。
右肋部软组织损伤
（七）荧光显微镜
Fluorescence Microscope
利用一定波长的紫外线照射 标本，标本受激发产生荧光， 然后通过物镜与目镜观察标 本荧光图象的显微镜。
从显微镜能看到的圆形范围叫视场，又叫视野。
– 视野愈大愈便于观察，但是视野直径随放大率的增大而 变小。一般观察时，将活动镜台上加上推尺，可以移动 位置，使标本的不同部位依次进入显微镜的视野供轮流 观察，以满足使用要求。
⑤镜像清晰度与镜像亮度
物体经光学系统放大后的物像轮廓清晰、衬 度适中的能力称为镜像清晰度。
– 设计时都取一固定的标准值，便于互换使用。
2.显微镜的几个光学特点：
制作光学镜头所用的玻璃折射率为1.65-1.78，所 用介质的折射率越接近玻璃的越好。
sinα/2的最大值必然小于1；介质为空气，镜口率 一般为0.05-0.95；油镜头用香柏油为介质，镜口 率可接近1.5。
普通光线的波长为400-700nm，分辨力数值不会小 于0.2μm，人眼的分辨力为0.2mm,因此显微镜的最 大设计倍数为1000-1500X。
（五）倒置显微镜 Inverted Microscope
物镜与照明系统颠倒，前 者在载物台之下，后者在载物 台之上，用于观察培养的活细 胞，通常具有相差物镜，有的 还具有荧光装置。习惯上又称 为生物倒置显微镜 （Biological Inverted Microscope）。
（六）三维立体显微镜
3.显微镜的构造
支持系统
载物台 底座 镜臂 物镜转换器
照明系统
光源 反光镜 聚光镜 光阑
调节系统
粗调 微调 聚焦螺旋
放大系统
物镜 目镜
（二）暗视场显微镜
基本原理：
– 使照明的光斜射于物体，而继续按正常光路 前进时这束光不能直接进入物镜，所以视场 是暗的。
– 但是视场中的某些物Байду номын сангаас（所要观察的对象） 却起着散射（有时也可以是反射或折射）的 作用，这些光可以进入物镜，因而在暗视场 上呈现出他们的象。
滤色系统是荧光显微镜的重 要部位，由激发滤板和压制滤板 组成。
•反光镜与聚光镜（7、8）
聚光镜明视野聚光器的暗视 野聚光器 。
荧光显微镜的结构
•物镜和目镜（10、12）
为了提高荧光图像的亮 度，应使用镜口率大的物镜 。
在荧光显微镜中多用低 倍目镜 。
•落射光装置
新研制的荧光显微镜多 采用落射光装置，称之为落射 荧光显微镜。
物镜已分清的细微结构，若目镜没有足够 的放大倍率使图像达到人眼所能分辨的大 小，则看不清；
物镜不能分辨清的细微结构，目镜倍率放 大的再大，也看不清楚。
④焦深（焦点深度）与视场
在使用显微镜时，当焦点对准某一物体平面时，不 仅位于该点平面上的各点都可看清楚，而且在此平 面的上下一定厚度内，也能看得清楚，这个清晰部 分的厚度就是焦深。
①数值孔径 (镜口率)
物镜前透镜与被检物体之间介质的折射 率（n）和孔径角（α）半数的正弦的乘 积。
NA= n·sinα/2
孔径角： 又称“镜口角”，是物镜光轴 上的物体点与物镜前透镜的有效直径所 形成的角度。孔径角越大，物镜的光通 量就越大。
数值孔径
是判断物镜和聚光镜性能 高低的重要指标，其值一 般在0.05-0.95之间。
–HO33342（Hoechst 33342）： DNA特异性的荧光染料，与DNA结合是非嵌入 式，主要结合在A-T碱基区。该染料的显著 特点是对活细胞DNA具有良好的亲和力，特 异性强。
常用荧光物质
测定DNA、RNA的荧光探针
几种常用的显微镜
现代显微镜
倒置显微镜 电子显微镜
显微镜概述
显微镜（Microscope）是观察微小物体 用的光学仪器。
在医学方面，显微镜主要用来观察眼睛 不能直接看见的组织细胞和微生物，故 常将其称为生物显微镜。
按照显微镜原理和结构的不同，可将其 分为光学显微镜、非光学显微镜和光电 结合型显微镜三类。
1953年诺贝尔物理奖。 1932年，M.Knoll和E.A.F.Ruska发明电镜，1940年，
美、德制造出分辨力为0.2nm的商品电镜。 1981年，G.Binnig和H.RoherI发明了扫描隧道显微
镜，与电镜发明者Ruska同获1986年度的诺贝尔物理 学奖。
Robert Hooke
Made by A.van Leeuwenhoek (1632-1723)
显微镜的分类
光学显微镜：由光学透镜制成，这是使用量 最大的一种显微镜，如手术显微镜、裂隙灯 显微镜、生物显微镜等。
非光学显微镜：它采用电子技术制成，如电 子显微镜等 。
光电结合显微镜：它是光学和电子技术如录 象技术、电视技术等相结合的产物，如摄影 显微镜、电视显微镜等。
特种光学显微镜
暗视场显微镜用于观察细菌和螺旋体的运动； 相差显微镜用于观察无色透明的标本； 倒置显微镜用于细胞培养、组织培养和微生物的
n为介质折射率； α为孔径角（样品对物镜镜口的张角）。
分辨率
思考： 如何提高显微镜的分辨能力？
提高分辨率的措施：
– 降低波长λ值，使用短波光作光源 – 增大介质的ｎ值（水浸或油浸物镜） – 增大孔径角（极限值为180度） – 增加明暗反差
③放大率
被检物体经物镜放大再经目镜放大后，人眼 所看到的最终图像的大小与原物体大小的比 值，是物镜和目镜放大倍数的乘积。
– 1. 环形光阑：位于光源与聚光器之间。 – 2. 相位板：物镜中加了涂有氟化镁的相位板，可
将直射光或衍射光的相位推迟1/4λ。
相差显微镜
应使用波长范围窄的近 于单色的光源，相位的 变化常因照明光线的波 长而不同。
切片或涂片不能太厚， 以5～10μm左右为宜。
载玻片、盖玻片的厚度 应符合标准，不应有疵 痕，制片的封固剂应均 匀一致。
2.荧光显微镜标本制作要求
载玻片
载玻片厚度应在0.8～1.2mm之间。太厚的坡片，一 方面光吸收多，另一方面不能使激发光在标本上聚集。
盖玻片
盖玻片厚度在0.17mm左右，光洁。最好使用干涉盖 玻片，它可以使荧光顺利通过，而反射激发光。
标本
组织切片或其他标本不能太厚，另外，细胞重迭或 杂质掩盖，影响结果的判断。
– 受光学系统设计和制造精度的影响，也与使用 方法是否正确有关。
镜像亮度是显微图像亮度的简称。
– 一般以观察时既不感到疲劳又不感到耀眼为最 佳。
⑥工作距离与机械筒长
工作距离就是从物镜的前表面中心到被观 察标本之间的距离。
– 它与数值孔径有关，数值孔径愈大，工作距离 愈小。
取下物镜和目镜后的镜筒长度，即物镜和 目镜支撑面间的距离为机械筒长。
细胞的有丝分裂
（四）偏光显微镜 Polarizing microscope
偏光显微镜是鉴定物质细微结构光学性质的一种 显微镜。
广泛地应用于矿物、晶体、陶瓷、金属、药物、 生物组织和植物纤维等各种具有双折射性偏光物 质的观察、研究和鉴别。
细胞：纤维丝、纺锤体、胶原、染色体等。
光源前有偏振片（起偏器），使进入显微镜的光 线为偏振光，镜筒中有检偏器（与起偏器方向垂 直的偏振片）。
媒质折射率：
空气（1）； 水（1.333）； 油（1.515）； α-溴萘（1.66）
②分辨率
显微镜分辨物体细微结构的能力，即物体 所能分辨两点之间的最小距离。