蒲黄、松花粉等花粉类药材及其混伪品的DNA条形码鉴定

蒲黄、松花粉等花粉类药材及其混伪品的DNA条形码鉴定[摘要]目前市场上花粉类药材品种较多，由于在外观形态均呈粉末状，很难区分，加之市场价格较高等因素，故混用和掺伪的情况时有发生，因此花粉类药材的准确鉴定对公众的用药安全显得尤为重要。

该研究采用DNA条形码技术，对蒲黄、松花粉及其混伪品的基原植物及药材共60份样本进行研究。

通过primer premier 6.0设计出蒲黄ITS2特异性引物PhF-R，其扩增效率高达100%，实验结果表明蒲黄药材的ITS2序列长度为234～249 bp，种内K2P平均距离与同属种间K2P平均距离十分接近，但远小于其与混伪品的种间K2P平均距离；松花粉药材的ITS2序列长度均为247 bp，ITS2序列种内平均K2P遗传距离远小于其与混伪品种间平均K2P距离。

利用ITS2序列构建的邻接（NJ）树表明蒲黄、松花粉及其混伪品可明显区分，并呈现出良好的单系性。

因此，DNA条形码可对该实验材料准确鉴定，有助于花粉类药材的监管及市场流通。

[关键词]ITS2；蒲黄；松花粉；DNA条形码花粉为植物的雄性细胞，由于其中蕴含着丰富的营养物质，所以具有很高的营养价值和药用价值[1]。

蒲黄[2]为香蒲科植物水烛香蒲Typha angustifolia L.、东方香蒲T. orientalisPresl.或同属植物的干燥花粉，始载于《神农本草经》，其味甘、性平，具有凉血止血、活血化瘀的功效[3-6]。

松花粉[7]，即松科植物马尾松Pinus massoniana Lamb.、油松P. tabuliformis Carr.或同属数种植物的干燥花粉，始载于《新修本草》，味甘平无毒[8]，具有收敛止血、燥湿敛疮的功效。

近年来国内花粉市场异常火爆，其价格连年攀升。

有文献报道[9-13]蒲黄、松花粉、海金沙Lygodium japonicum （Thunb.）Sw.及市售的玉米花粉Zea mays L.存在掺伪的情况，因此对几种易混花粉类药材进行有效鉴定显得至关重要。

陈树山[9]、贾荷丽[10]、陈永林[11]、任燕[13]等曾从性状、理化及显微方面对花粉类药材进行鉴别，但传统的鉴定方法在一定程度上由于药材本身、实验仪器、实验设计等方面的差异而影响对药材的准确鉴定。

基于DNA测序和序列比对的DNA条形码技术是近年来分子生药鉴定的研究热点和方向[14]。

DNA条形码（DNA barcoding）是利用基因组中一段公认标准的、相对较短的DNA片段来进行物种鉴定的分子诊断新技术。

该技术于2003年由加拿大分类学家Paul Hebert首次提出，并受到各国学者的广泛关注。

Paul提出以一段650 bp的线粒体基因COI作为动物的通用条形码[15-16]。

在植物方面，陈士林等对6 000余份药用植物样本进行DNA条形码序列筛选，提出以ITS2为主，psbA-trnH为辅的药用植物条形码鉴定体系[17-21]。

该体系已在羌活[22]、金银花[23]、冬虫夏草[24]、石斛[25]等贵重药材上得到了验证。

因此本研究选用ITS2序列来鉴定易混淆花粉类药材，为确保药材质量及临床用药安全提供参考。

1 材料本实验所研究的材料共60份，其中19份为基原植物样本，采集于新疆、河北、河南、安徽、广东、广西、云南、北京等地，所有基原植物经中国医学科学院药用植物研究所林余霖研究员鉴定，凭证标本保存于中国中医科学院中药研究所，材料来源见表1；其余41份为药材样本，购于北京、河北、安徽、重庆、黑龙江等地的药市或药店，详细信息见表2。

2 方法2.1 DNA的提取对于叶片样本，取样品约25 mg，用球磨仪（Sceintz-48，宁波新芝）以50次/s研磨2 min，使用植物基因组DNA提取试剂盒（Tiangen Biotech Co.，China）提取总DNA；而粉末状药材，取样品约40 mg，加700 μL DNA 裂解液，在56 ℃水浴的条件下过夜，采用植物基因组DNA 提取试剂盒（Tiangen Biotech Co.，China）提取总DNA。

2.2 蒲黄引物设计利用MEGA5.0对ITS2通用引物扩增出的序列进行分析，定位至蒲黄的“保守区域”，并运用primer premier 6.0设计特异性引物PhF-R。

其序列如下，Ph-F：5′-CGCGAACCATCGAGTCTTT-3′，Ph-R：5′- GTTTCTTCTCCTCCGCTTATTT-3′。

2.3 PCR扩增和测序对于非香蒲属样本，选取ITS2通用引物S2F：5′-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3′和S3R：5′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′作为扩增引物。

反应条件为94 ℃变性5 min，经过40个循环（94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s），最后72 ℃延伸10 min。

反应体系为2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL，引物2.5 μmol?L-1各1.0 μL，DNA模板量约30～60 ng，其余用ddH2O 补至25 μL；而香蒲属样本，选用PhF-R为ITS2扩增引物，退火温度54 ℃，其他条件同上。

电泳检查PCR扩增情况，进行双向测序。

2.4 ITS2序列分析对获得的测序结果使用Codoncode Aligner V3.7.1校对拼接，删除低质量区，去除引物区。

基于隐马尔可夫模型HMMer注释除去5.8S和28S，从而获得ITS2序列。

运用软件MEGA 5.0对所有ITS2序列进行分析比对[26]。

基于K2P模型进行遗传距离的计算、系统聚类树的构建，对于系统树各分支的置信度采用自举检验法bootstrap检验（1 000次重复）。

3 结果与分析3.1 蒲黄PCR扩增效率本实验中，以蒲黄药材及基原植物共29份样本的总DNA为模板，采用通用引物进行PCR 扩增，结果仅有2份样本的DNA扩增成功，且测序正常，扩增效率仅为6.70%。

根据已获得的2条蒲黄ITS2序列，对蒲黄重新设计引物。

采用针对蒲黄已知序列设计的新引物，对之前提取的总DNA进行重新扩增，结果显示29份样本全部扩增成功，其中26份样品测序结果合格，扩增效率高达100%。

3.2 市场上购买的药材的鉴定对市场上购买的41份药材样本进行实验，得到的ITS2序列进行BLAST比对后发现：22份蒲黄药材中有7份样品（KJ474686～92）与GenBank 登陆号KF265389的相似度为100%，比对结果为长苞香蒲；有6份样品（YC0518MT10～15）与GenBank登录号KF265390的最高相似度为84%，比对结果为香蒲属植物，暂不能鉴定到种；有6份样品（KJ474656～61）与GenBank 登陆号FJ949066，DQ996015的相似度为100%，比对结果为水稻；此外，22份蒲黄药材中有3份样品（YC0518MT16～18）在测序过程中存在套峰的情况。

8份松花粉药材中有5份样品（KJ474648～52）与GenBank登录号GQ434744的相似度为100%，比对结果为马尾松；其余3份样品与GenBank 登录号JF829712，JF829701，GQ434747的相似度均为100%，比对结果为松属植物，暂不能鉴定到种。

按照同样的方法，4份海金沙药材的鉴定结果均为海金沙。

7份玉米花粉材料的鉴定结果均为玉米。

3.3 松花粉、蒲黄及混伪品的种内、种间变异分析马尾松P. massoniana 种内不同来源样品8条ITS2序列长度为247 bp，平均GC含量为60.73%，种内K2P距离为0，种内无变异位点，共获得KJ474648型1种单倍型。

油松P. tabuliformis 种内不同来源样品3条ITS2序列长度为247 bp，GC含量为60.32%，种内K2P距离为0，种内无变异位点，共获得KJ474642型1种单倍型。

松花粉未定种的3份样品（YC0405MT02～04）的ITS2序列长度为247 bp，共获得YC0405MT02型1种单倍型。

对3个物种的序列分析发现，仅在74 bp处有一变异位点，即马尾松在74 bp处的碱基为C，油松和未定种样品的序列在74 bp处为T。

油松与马尾松的种间距离为0.004，与混伪品的最小种间距离为0.657；马尾松与混伪品的最小种间距离在0.670。

长苞香蒲T. domingensis 种内不同来源样品9条ITS2序列长度为234 bp，平均GC含量为78.63%，种内K2P距离为0，种内无变异位点，共获得KJ474686型1种单倍型。

水烛香蒲T. angustifolia 种内不同来源样品3条ITS2序列长度为234 bp，平均GC含量为79.92%，有2个位点存在变异，即81位点处A-G变异和141位点处T-C变异，共获得3种单倍型。

种内最大K2P距离为0.022，与混伪品的最小种间距离为0.337。

蒲黄未定种的6份样品（YC0518MT10～15）的ITS2序列长度为249 bp，共获得YC0518MT10型1种单倍型。

序列比对信息见表3。

海金沙L. japonicum种内不同来源样品7条ITS2序列长度为267 bp，共获得5种不同的单倍型，其中KJ474663型3条，KJ474662型1条，KJ474665型1条，KJ474666型1条，KJ474668型1条。

玉米花粉Zea mays种内不同来源样品10条ITS2序列长度为224 bp，共获得4种不同的单倍型，其中KJ474669型7条，KJ474671型1条，KJ474674型1条，KJ474678型1条。

水稻Oryza sativa种内不同来源样品6条ITS2序列长度为232 bp，共获得KJ474656型1种单倍型。

基于得到的ITS2序列的单倍型，运用邻接法（NJ）构建系统发育树，见图1。

从所构建的系统发育树中可以看出松花粉、蒲黄、海金沙、玉米花粉、水稻各独聚一支，因此，ITS2序列能准确鉴别蒲黄、松花粉等花粉类药材及其混伪品。

4 讨论蒲黄为多年水生草本单子叶植物，国外学者对水生单子叶植物的DNA条形码有比较深入的研究[27]。

在本研究的过程中，笔者发现当采用通用引物（ITS2F-3R）扩增蒲黄药材时，扩增效率仅为6.70%，这有可能是ITS2F-3R在单子叶植物中的通用性不高导致的。

因此笔者以己获得的2条蒲黄序列为研究对象，运用Primer Premier 6.0软件重新设计了一对引物（PhF-R），其扩增效率可以达到100%。

从鉴定效率角度上看，基于ITS2序列构建的NJ树可以将蒲黄与其混伪品明显分开，但香蒲属下种级物种间并没有很好的区分，这可能与香蒲属植物的亲缘关系较近有关。