454测序技术 原理和流程
一二三四代测序技术原理详解
一二三四代测序技术原理详解一、第一代测序技术原理第一代测序技术最早出现于1977年，是由Sanger等人发明的，并被称为“链终止法”。
其原理是通过DNA聚合酶将输入的DNA序列再生产出一条互补链，同时在每个位点上加入一种特殊的荧光标记的二进制核苷酸，然后将这些被标记的DNA片段分开进行电泳，根据电泳结果可以得到DNA的序列。
第一代测序技术的核心原理是首先将待测序列分成多个片段，然后利用DNA聚合酶在每个片段的3'末端加入一种荧光标记的二进制核苷酸。
这种核苷酸的特殊之处在于，它们只能和待测序列的碱基互补配对，并且在加入过程中会停止DNA链的生长。
随后，将加入了荧光标记的DNA片段进行分离和电泳。
由于不同长度的DNA片段在电场下移动的速度不同，所以通过观察不同片段的移动位置，可以推断出每个片段的碱基序列。
二、第二代测序技术原理第二代测序技术的原理是通过对待测DNA片段进行多轮的扩增和测序，最后将所有结果进行比对和组装，得到完整的DNA序列。
第二代测序技术的核心原理是将待测DNA样本分成许多小片段，然后将每个片段进行扩增，所得到的扩增产物再次进行扩增，并且在扩增过程中引入一种荧光标记的二进制核苷酸。
在每个扩增步骤之后，需要将扩增产物进行分离，例如利用固相法将扩增产物固定在芯片上。
然后，对每个扩增产物进行毛细管电泳或基于光信号的测量，以确定每个扩增产物对应的碱基序列。
最后，通过将所有碱基序列进行比对和组装，可以得到待测DNA的完整序列。
第二代测序技术相较于第一代测序技术具有更高的通量和更低的成本，可以同时进行大规模的测序，因此被广泛应用于基因组学和生物医学研究。
三、第三代测序技术原理第三代测序技术是在第二代测序技术的基础上发展而来的，其主要原理是通过直接测量DNA或RNA单分子的序列来进行测序，无需进行扩增和分离过程。
第三代测序技术的核心原理是通过探测DNA或RNA单分子在固定的平面上的位置变化，来确定每个单分子的碱基序列。
454测序原理
454测序原理
454测序技术是一种基于测序仪器的高通量测序技术，其原理是通过将DNA 样本分离成小片段，然后将这些片段连接到载体上，最终通过测序仪器进行测序。
本文将详细介绍454测序的原理及其应用。
首先，454测序的原理是基于“串联测序”（pyrosequencing）技术。
在这种技术中，DNA样本首先被分离成小片段，然后这些片段被连接到载体上形成DNA文库。
接下来，这些DNA片段会被放置在微小的水滴中，每个水滴中只含有一种DNA片段。
然后，这些微小水滴会被放置在一个包含放射性同位素的试剂中，当DNA聚合酶合成新的DNA链时，会释放出能够被探测的放射性同位素。
其次，454测序的原理还涉及到核苷酸的测序。
在这个过程中，每个核苷酸会被加入到新合成的DNA链中，而且只有当正确的核苷酸被加入时，才会释放出能够被探测的放射性同位素。
因此，通过检测放射性同位素的释放量，就可以确定每个核苷酸的顺序。
另外，454测序的原理还包括数据分析。
在测序完成后，会得到大量的数据，这些数据需要进行分析才能得到最终的测序结果。
数据分析的过程包括对原始数据的处理、序列拼接、序列比对等步骤，最终得到DNA序列的信息。
最后，454测序技术在基因组学研究、疾病诊断、药物研发等领域有着广泛的应用。
通过454测序技术，可以快速、高效地获取DNA序列信息，为相关领域的研究提供了重要的数据支持。
总之，454测序技术是一种基于测序仪器的高通量测序技术，其原理是基于串联测序技术，涉及到DNA样本的分离、核苷酸的测序和数据分析等步骤。
该技术在基因组学研究、疾病诊断、药物研发等领域有着广泛的应用前景。
高通量测序技术简介
高通量测序技术简介
高通量测序技术又称“下一代”测序技术，以能一次并行对几十万到几 百万条DNA分子进行序列测定和一般读长较短等为标志。目前用于微生物群 落多样性研究的高通量测序平台主要有来自罗氏公司的 454法、Illumina公 司Solexa法和 ABI 的 SOLiD 法
罗氏454法测序原理
GS FLX系统的测序原理是基于焦磷酸测序法，依靠生物发光对DNA序列进 行检测。在DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，荧光素酶和双磷酸酶的协同作用下， GSFLX系统将引物上每一个dNTP的聚合与一次荧光信号释放偶联起来。通过 检测荧光信号释放的有无和强度，就可以达到实时测定DNA序列的目的。
罗氏454法测序流程
Solexa测序法测序流程
• 1.添加接头：利用物理方法将待测 样品DNA打碎，在单链DNA碎片两端 加上接头
• 表面结合：Solexa的测序时利用微注 射系统将已经加过接头和待测片断随 机添加到玻璃Flow Cell内，每一个 Flow Cell又补分成8条Lane，每条 Lane的内表面上能与共价键的形式随 机固定单链接头序列和带接头的单链 待测DNA片断
四种荧光标记的染料应用边合成边测序（ Sequencing By Synthesis ） 的原理，在每个循环过程里，荧光标记的核苷和聚合酶被加入到单分子阵列中。 互补的核苷和核苷酸片断的第一个碱基配对，通过酶加入到引物上。多余的核苷 被移走。这样每个单链 DNA 分子通过互补碱基的配对被延伸，利用生物发光蛋 白，比如萤火虫的荧光素酶，可通过碱基加到引物后端时所释放出的焦磷酸盐来 提供检测信号。针对每种碱基的特定波长的激光激发结合上的核苷的标记，这个 标记会释放出荧光。荧光信号被 CCD 采集，CCD 快速扫描整个阵列检测特定的 结合到每个片断上的碱基。通过上述的结合，检测可以重复几十个循环，这样就 有可能决定核苷酸片断中的几十个碱基。
454测序技术基本原理
454测序技术基本原理454测序技术是一种基于DNA串联式测序的高通量测序技术。
该技术利用PCR扩增的方式将DNA分子固定在微球上，然后将这些微球均匀地分散在pico流水仪上，通过单个核苷酸连续测序的方式得到DNA序列信息。
本文将从实验步骤、原理和优缺点三个方面阐述454测序技术的基本原理。
实验步骤1、DNA提取测序前需要从样品中提取目标DNA物质。
对于不同的样品，提取方法不同，通常采用化学试剂、机械破碎或针刺取等方法提取DNA。
2、PCR扩增PCR扩增是将DNA序列按照一定的温度循环条件进行复制的过程。
PCR扩增由若干次循环组成，通常可分为三步：a) 熔解（Denaturation）：高温（95℃~98℃）使DNA双链分离成两个单链，形成单链DNA模板。
b) 合成（Annealing）：温度回降（50℃~70℃），引物结合到单链DNA上，形成DNA 双链结构。
c) 延伸（Extension）：DNA聚合酶将双链DNA沿模板链向3'端延伸合成新的DNA链。
PCR扩增反应得到的DNA产物可分为两种类型：大量扩增的目标DNA和微球放置板上随机捕获的非模板DNA。
3、微球固定4、测序反应测序反应通过单个核苷酸的连续探测，对目标DNA序列进行识别和测序。
精细的光学和声学系统检测每次核苷酸加入后发出的光信号，然后排除错误数据并将相邻的场景、质量和信号强度合并以产生最终测序可靠的序列。
原理1、基于串联式测序在测序反应中，每个核苷酸单元依次加入为该反应产物的单一串联链的一部分。
这种串联式测序方式将初步测序的精度扩展到所有测序反应产物的终端序列。
2、基于荧光原理测序反应中每个核苷酸单元的加入和检测均通过荧光技术实现。
特殊荧光分子被加入到产物反应液中，随着核苷酸单元的加入和反应的进行，每个反应产生的荧光信号与特定的核苷酸单元有关。
3、基于高通量454测序技术结合了反应批处理和DNA克隆，大大增加了读取的序列数量。
454测序原理
454测序原理
454测序原理是一种被广泛应用于基因组学研究的高通量测序技术。
其原理基于荧光化学发光和低密度DNA固相扩增的方法，能够以高通量的方式快速获取大量的基因组信息。
首先，将待测DNA样品进行首次扩增，得到大量的单链DNA模板。
然后，将这些单链DNA模板固定在微小的玻璃球上，每个玻璃球上只有一个DNA模板。
之后，这些玻璃球会被封装在一个水油混合液中的微小水滴中，每个水滴中通常只有三个玻璃球。
接下来，这些水滴会被密封在一片透明的PicoTiterPlate™中，并在一组具有不同碱基的草酸序列上进行串联测序，这些草酸序列会与模板DNA上的碱基进行互补配对。
然后，454测序仪会从PicoTiterPlate™中释放出草酸序列，当这些草酸序列与模板DNA上的碱基配对时，会释放出一定量的能量。
这些能量会被测序仪检测到，并将其转化成可视化的荧光信号。
最后，经过相应的图像处理和数据分析，就可以得到原始的测序数据。
根据荧光信号的强度和先后顺序，可以确定每个DNA模板上的碱基序列。
总结来说，454测序原理基于荧光化学发光和低密度DNA固相扩增的方法，通过测量荧光信号的强度和先后顺序，快速获
得DNA模板的碱基序列信息。
这种技术具有高通量、高准确性和高灵敏度等特点，在基因组学领域有着广泛的应用。
罗氏454焦磷酸测序技术
腺苷双磷酸酶、底物荧光素酶和5′磷酸硫腺苷共同孵育,然后脱氧核糖核苷三磷酸即按照 碱基配对的原则依次连接到引物上。在每一轮测序反应中,只加入一种dNTP,若该dNTP与 待测模板配对, DNA 聚合酶可以将其掺入到合成链中并释放出等摩尔数的焦磷酸基团 ( PPi) 。ATP硫酸化酶在APS存在的情况下催化焦磷酸形成ATP,ATP驱动荧光素酶介导的 荧光素向氧化荧光素( oxyluciferin)的转化,氧化荧光素发出与ATP量成正比的可见光信号。 ATP和未掺入的dNTP由三磷酸腺苷双磷酸酶降解,淬灭光信号,并再生反应体系,然后加入 下一种dNTP,如此循环[13]。
仔猪肠道菌群的形成
新生动物肠道菌群形成可以划分为以下几个阶段 [3,4,5,6]。
第一阶段:新生动物出生两周以内，肠道内的细菌定 植方式基本相同。结肠内首先出现杆菌和肠链球菌，随之 很快出现双歧杆菌并成为优势菌，这个时期肠道菌群的特 点是不稳定，容易发生变化。
第二阶段:出生后两周到断奶以前，动物在母乳喂养 下，肠道内细菌主要以厌氧菌为主，主要为双歧杆菌，肠 杆菌和链球菌数量较少。这个阶段的特点是肠道菌群容易 受食物的影响，食物的微小改变就可以引起肠道菌群发生 较大的变化。
肠道菌群的研究方法进展（分子生态学研究方法）
DNA 指纹图谱技术依据分子大小、核酸序列等特征的不同，将代 表微生物群落中各物种的 DNA 分子标记物在凝胶上进行电泳分离，使 代表不同物种的分子标记迁移到胶上的不同位置，最终得到的电泳图 谱用于显示群落的组成结构。DNA 指纹图谱的最大优点是方便、快速、 直观，常用于检测微生物群落结构的动态变化或比较不同群落之间的 结构差异。最常用的 DNA 指纹图谱技术包括变性梯度凝胶电泳 （Denatured gradient gel electrophoresis，DGGE）[10,11,12]和末端片段长 度多态性（Terminalrestriction fragment length polymorphism, T-RFLP） 等。
454测序
第二代测序技术（Next-Generation Sequencing）NGS之基础篇2001年，美、英、法、德、日、中六国合作，历时十年，耗资数十亿美元的人类基因组计划（Human Genome Project，HGP）宣告完成。
转眼又是十年过去，在此期间，各国科学家仍在为解读基因的密码而不懈努力，这其中最大的突破，就是第二代测序技术的推出。
HGP的顺利完成证明了我们有能力对自身的遗传信息进行研究，然而，高昂的成本、漫长的时间、巨大的人力需求，无不限制着对遗传密码的进一步认识。
从HGP开始的第一天期，科学家们就在寻求更好的方法来对基因组进行研究，“鸟枪法”就是其中之一。
2006年，美国X大奖基金会（）设立了奖金高达1000万美元的基因组Archon X大奖，旨在奖励第一个在10天内以低于100万美元的成本完成100个人类基因组测序的民间团队。
而罗氏（Roche）、应用生物系统（Applied Biosystems，ABI）、Illumina三家公司先后推出了各自的第二代高通量测序平台，成为NGS领域的领头羊。
2005年底，454公司推出第一个基于焦磷酸测序原理的高通量基因组测序系统——Genome Sequencer 20 System，这是核酸测序技术发展史上里程碑式的事件。
随后，罗氏公司以1.55亿美元收购了454公司，并在2006年推出了更新的GS FLX测序系统，该系统可在10小时的运行中获得100万条读长（reads），4~6亿个碱基信息（base pair），且准确率达到99%以上。
2008年，GS FLX系统再次升级，通量提高了5倍，读长和准确率也有所增加。
虽然454 GS测序平台也许不是市场占有率最高的测序仪，但截至2011年3月，利用该系统进行研究的论文已发表超过1000余篇，而它在读长上的优势明显胜于另两套系统，因此在从头测序（de novo）和宏基因组测序（meta genome）方面有着不可替代的地位。
454测序技术原理和流程
454测序技术原理和流程454测序技术是一种基于边合成边测序（Sequencing-by-Synthesis）原理的第二代高通量测序技术。
它于2003年由Roche公司（现被Illumina收购）推出，并在接下来的十几年中成为基因组学和转录组学研究中广泛使用的测序平台之一、下面将详细介绍454测序技术的原理和流程。
原理：454测序技术的原理基于DNA文库的融合PCR（emulsion PCR）扩增和荧光PCR测序的思想。
首先，DNA样本被切割成适当长度的片段，并在连接接头后构建成DNA文库。
然后，在微量水滴中将单个DNA片段与一组引物和酶进行PCR扩增。
每个水滴中只有一个DNA片段和其互补链，它们会形成单链的DNA模板。
接下来，这些微量水滴重新包装到小球形体内，称为水滴中合成（emulsion clonal amplification）。
在合成过程中，每个DNA模板被荧光标记的四种去氧核苷三磷酸（dNTPs）和DNA聚合酶引导下进行DNA合成。
每次加入一个碱基的dNTP，当它与DNA模板互补时，DNA聚合酶会将其连接到模板上，形成连续的DNA链。
而每个碱基加入后，会释放出焦磷酸酯，产生光信号，通过荧光探测器检测到这些光信号并记录。
这种碱基加入和荧光检测的过程会重复多次，直到DNA链达到所需长度或检测不到进一步的信号。
这样，通过记录每个碱基的荧光信号，就可以获得一条包含DNA片段顺序的测序读数。
流程：1.样本制备：首先，从样本中提取DNA，然后将其切割成适当长度的片段。
3.融合PCR扩增：将连接接头的DNA片段与引物、酶和其他反应物一起加入到微量水滴中，使每个水滴中只有一个DNA片段。
然后，在PCR反应中进行多轮扩增，使DNA片段复制为数以百万计的复本。
4.DNA合成：将融合PCR扩增产生的水滴中的DNA片段重新包装到小球形体内，形成单链DNA模板。
接着，在存在荧光标记的dNTPs和DNA聚合酶的条件下，进行边合成边测序，记录下每次碱基加入的荧光信号。
454测序
第二代测序技术（Next-Generation Sequencing）NGS之基础篇2001年，美、英、法、德、日、中六国合作，历时十年，耗资数十亿美元的人类基因组计划（Human Genome Project，HGP）宣告完成。
转眼又是十年过去，在此期间，各国科学家仍在为解读基因的密码而不懈努力，这其中最大的突破，就是第二代测序技术的推出。
HGP的顺利完成证明了我们有能力对自身的遗传信息进行研究，然而，高昂的成本、漫长的时间、巨大的人力需求，无不限制着对遗传密码的进一步认识。
从HGP开始的第一天期，科学家们就在寻求更好的方法来对基因组进行研究，“鸟枪法”就是其中之一。
2006年，美国X大奖基金会（）设立了奖金高达1000万美元的基因组Archon X大奖，旨在奖励第一个在10天内以低于100万美元的成本完成100个人类基因组测序的民间团队。
而罗氏（Roche）、应用生物系统（Applied Biosystems，ABI）、Illumina三家公司先后推出了各自的第二代高通量测序平台，成为NGS领域的领头羊。
2005年底，454公司推出第一个基于焦磷酸测序原理的高通量基因组测序系统——Genome Sequencer 20 System，这是核酸测序技术发展史上里程碑式的事件。
随后，罗氏公司以1.55亿美元收购了454公司，并在2006年推出了更新的GS FLX测序系统，该系统可在10小时的运行中获得100万条读长（reads），4~6亿个碱基信息（base pair），且准确率达到99%以上。
2008年，GS FLX系统再次升级，通量提高了5倍，读长和准确率也有所增加。
虽然454 GS测序平台也许不是市场占有率最高的测序仪，但截至2011年3月，利用该系统进行研究的论文已发表超过1000余篇，而它在读长上的优势明显胜于另两套系统，因此在从头测序（de novo）和宏基因组测序（meta genome）方面有着不可替代的地位。
454技术简介
技术简介GS FLX系统超高通量测序技术原理GS FLX系统的测序原理是一种依靠生物发光进行DNA序列分析的新技术；在DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，荧光素酶和双磷酸酶的协同作用下，将引物上每一个dNTP的聚合与一次荧光信号释放偶联起来(图1)。
通过检测荧光信号释放的有无和强度，就可以达到实时测定DNA序列的目的。
此技术不需要荧光标记的引物或核酸探针，也不需要进行电泳；具有分析结果快速、准确、灵敏度高和自动化的特点.图1：GS FLX 高通量测序方法原理示意图PCR产物，BAC，cDNA，小分子RNA等等。
2）样品DNA打断：样品例如基因组DNA或者BAC等被打断成300－800 bp的片段；对于小分子的非编码RNA，这一步骤则不需要。
短的PCR产物则可以利用GS融合引物进行扩增后直接进行步骤4)的工作。
3）衔接子连接：借助一系列标准的分子生物学技术，将A和B接头（3’和5’端具有特异性）连接到DNA片段上。
接头也将在后继的纯化，扩增和测序步骤中用到。
图中仅仅显示了后续步骤中要用到的单链的DNA片段4）一条DNA片段＝一个磁珠：接头使成百上千条DNA片段结合到它们自己唯一的磁珠上，此磁珠被单个油水混合小滴包被后，在这个小滴里进行独立的扩增，而没有其他的竞争性或者污染性序列的影响；整个DNA片段进行平行扩增。
5）一个磁珠＝一条读长：经过PCR扩增后，每个磁珠上的DNA片段拥有了成千上万个相同的拷贝。
经过富集以后，这些片段仍然和磁珠结合在一起，随后就可以放入到PicoTiterPlate板中供后继测序使用了。
6）数据读取和分析工具：GS FLX系统在10小时的运行当中可获得10多万个读长，读取超过1亿个碱基信息。
GS FLX 系统提供三种不同的生物信息学工具对测序数据进行分析，适用于不同的应用：例如多达3 GB序列的重测序，对比已知参考序列进行的扩增产物差异分析，及 120 MB的从头测序工作等。
GS FLX系统具备的卓越性能：1.一个测序反应耗时10个小时，获得超过4亿个的碱基数据2.单个序列的读长更长，平均可达到350－500碱基左右3.通量更高，每个反应可以得到超过100万个序列读长，成本大大降低4.读长超过350 bp时，单一读长的准确性可以超过99.5%5.测序结果一致性超过99.99%6.技术成熟，提供完整的解决方案GS FLX系统的应用一、全基因组测序1.多达120 Mb的未知基因组的测序1)生成基因组结构概图2)研究DNA序列的组织，分布和信息3)基因筛查：寻找新基因，定位和功能4)和其他基因组进行比较研究2.全基因组进行从头鸟枪法测序，例如微生物基因，BAC和YAC克隆测序。
454测序平台介绍
3.1 454乳化PCR实验流程概述
乳化反应体系制备（2小时）
PCR （9小时）
模板磁珠富集（5小时）
通过将固定了测序引物的微珠掺入PCR体系，并和矿物油混合并高速震荡，获得 “油包水”的乳化PCR反应体系，理想的乳化PCR反应体系中，每个水滴都是一个仅 含有一个微珠和一条模板的独立PCR体系，经过50个循环的扩增后，每个微珠都 将生成数十万条固定化的单克隆模板，用于后续的富集和测序。
3.4 模板珠的富集
富集磁珠
空载珠
模板珠
磁力架
使用固定有测序引物的富集磁珠和扩增成功的模板磁珠进行杂交， 并通过磁力回收富集磁珠-模板珠混合物，并通过氢氧化钠变性使 得回收的模板珠和富集磁珠分离，得到纯度较高的富集珠用于测 序。
4.1 454测序仪的结构
用户界面
化学反应 和成像区 主输液系统 试剂区
2.1.2 DNA的末端修复和加A
末端修复 加A
依赖T4 DNA聚合酶的5’-3’聚合酶活性， 5’-3’外切酶活性和3’-5’ 外切酶活性补平DNA片段的末端。 依靠T4 PNK酶使得被修复末端5’端磷酸化。 依靠Taq DNA聚合酶使平末端加A
2.1.3 接头连接和片段选择
接头连接
纯化和片段选择
合格指标 >420bp >20 >500
5 454测序仪的应用范围
454测序系统相对于Hiseq，SOLiD等第二代测序平台，拥有快速和长度长的 核心竞争优势，所以454测序系统在其他测序平台可运转的应用类型至于，特 别适合于基因组的从头组装以及环境基因组（Meta-genomics）等需求长读长 测序数据的研究应用。454测序数据可以单独分析，也可以和短读长测序数据 进行协同分析，使得研究目的更易实现并做到成本最优化。
Roche 454(GS FLX Titanium System)超高通量测序技术原理
Roche 454（GS FLX Titanium System）超高通量测序技术原理2005年底，454公司推出了革命性的基于焦磷酸测序法的超高通量基因组测序系统——Genome Sequencer 20 System，被《Nature》杂志以里程碑事件报道，开创了边合成边测序（sequencing-by-synthesis）的先河。
之后，454公司被罗氏诊断公司以1.55亿美元收购。
2007年，他们又推出了性能更优的第二代基因组测序系统—— Genome Sequencer FLX System (GS FLX)。
2008年10月，454推出了全新的GS FLX Titanium系列试剂和软件，让GS FLX的通量一下子提高了5倍，准确性和读长也进一步提升。
想当年，GS 20的出现，揭开了测序历史上崭新的一页。
Jonathan Rothberg博士就是大规模并行测序的发明者，同时也是454的创始人。
上世纪90年代，很多学者也都想到了大规模并行测序，他们试图将Sanger测序移到芯片上，但都以失败告终，因为这项技术没有可扩展性。
1999年，Rothberg的儿子出世，他放了两个星期的陪产假。
小家伙出生后被送入婴儿特护病房，Rothberg非常担心，甚至想获取儿子的基因组信息。
这段担惊受怕的经历给了他灵感，他突然意识到焦磷酸测序（pyrosequencing）不仅简单，而且具有可扩展性。
两个星期之后，Rothberg就开始设计芯片和流动室，让测序在更小的反应室中进行，并同时进行几百万个反应。
硬件的设计和制造也只是成功的一半，在样品制备上还有同样漫长的路要走。
Rothberg摒弃了传统的细菌克隆与挑选，将DNA打断成随机片段，并寻找一种方法来克隆每个片段。
受到其他学者乳液实验的启发，他也想将DNA放入油包水的乳液中，这样就省去了反应管。
一个好汉三个帮。
在Joel Bader等人的帮助下，Rothberg验证了这些想法的可行性，并利用了炸药中的表面活性剂来维持乳液的热稳定性。
454测序原理
454测序原理
454测序原理是一种DNA组学技术，它可以同时完成很多DNA片段的测序，并生成大量高质量、相对低成本的核酸序列数据。
这一原理最初由Roche公司研发，属于生物信息学中的宏基因组学技术，主要用于检测和解析微生物群落和病毒等未知样本中的DNA序列，也可以用于基因组解析、转录组分析等。
454测序是根据“重测序”技术而设计的，针对每个测序模板，其原理包括样品准备、DNA扩增、碱基电泳和DNA信号检测4个步骤。
首先，将待测样品者分装到每个孔中，在每个孔中进行核酸扩增，即通过聚合酶链式反应（PCR）获得多份一样的片段，这是测序的基础；接着，将PCR产物加入到碱基电泳仪中，在特殊环境中，碱基电泳仪可以将成对碱基，即A、C、G、T分离成四条独立的带电性带，再通过电泳实现碱基的排序，并可以检测碱基的核苷酸序列；最后，将检测到的电泳信号转换成技术文件，即可以得到DNA序列了。
454测序原理的优势在于可以同时完成大量DNA序列的测序，并以此来获取很多有价值的基因组学数据。
它的灵敏性较高，可以检测极小的变异。
当检测单一基因时，454测序平台能够提供高精度的核酸序列，同时具有传统测序技术无法替代的扩增片段深度，这对后续的研究特别有用。
此外，454测序也可以检测非编码RNA，通过它可以比较不同物种的一部分序列的保守性，帮助研究者了解分子进化的过程，以及基因的结构及功能。
454测序原理
454测序原理
454测序原理是一种高通量的测序技术，其核心原理是基于PCR扩增和荧光方法来实现。
具体操作过程如下：
1.剪切DNA：
首先，将长串的DNA分子经过特殊的酶切或机械剪切成数百个碎片，每个碎片一般长度在400-800bp之间。
2.链使用PCR扩增：
接着，将这些碎片的末端上添加连接器，并以连接器为起始点进行链使用PCR扩增放大，此时每个DNA分子就被扩增成数百万份。
3.单一DNA分子构建：
将单一的DNA分子分别放置在微小的水滴中，每个水滴只包含单一的DNA分子，然后分别分配在大量的PCR反应的微孔里面。
4.序列测定：
进行PCR扩增反应，测序端读出荧光信号并记录，每次只测定一种碱基，通常是A、C、G、T四种碱基，记录每种碱基的发光强度和出现时间。
对于每个DNA分子，都可以得到许多碱基信号的序列信息。
5.组装成序列：
经过大量的这样的测定，就可以获得巨量的碱基信息，将这些碱基信息通过计算机进行组装，就可以得到原始的DNA序列信息。
454测序原理主要有以下优点：
1.高通量：可以一次测定数百万个DNA分子，速度快、高效。
2.灵敏性：对于低浓度的DNA样品也可以进行高质量的测序，检测灵敏度较高。
3.序列长度长：能够读取长度较长的DNA序列，最长可达1kb。
4.配对末端技术：采用配对末端技术读取，可使序列可靠度更高。
综上所述，454测序原理主要是通过PCR扩增和荧光方法来实现的。
它具有高通量、灵敏性强、序列长度长等优点，因而被广泛应用于基因组研究、转录组研究、单细胞测序、微生物组等方面。
454高通量测序微生物多样性流程
Minimum: 2.5%-tile: 25%-tile: Median: 75%-tile: 97.5%-tile: Maximum: Mean: # of unique seqs: total # of seqs:
screen.seqs(fasta=test.trim.revcomp.unique.align,start=2162,end=10893,name=tes s,group=test.groups,minlength=200,maxhomop=7,processors =10) Start 1 7 8 25 45 1036 2162 84.3121 2157 2691 End 10893 10893 10893 10893 10893 12128 13980 11074 NBases 332 407 470 485 515 532 555 486.864 Ambigs 0 0 0 0 0 0 0 0 Polymer 4 5 5 6 7 7 7 5.96656 NumSeqs 1 68 673 1346 2019 2624 2691
large subunit (23S/28S, LSU) ribosomal RNA (rRNA) sequences for all three domains of life (Bacteria, Archaea and Eukarya). The greengenes web application provides access to the current and comprehensive 16S rRNA gene sequence alignment.
UCHIME can detect chimeras using a reference database or de novo using abundance information on the assumption that chimeras are less abundant than their parents because they must have undergone fewer rounds of amplification.
罗氏454焦磷酸测序技术
仔猪肠道菌群的形成
新生动物肠道菌群形成可以划分为以下几个阶段 [3,4,5,6]。
第一阶段:新生动物出生两周以内，肠道内的细菌定 植方式基本相同。结肠内首先出现杆菌和肠链球菌，随之 很快出现双歧杆菌并成为优势菌，这个时期肠道菌群的特 点是不稳定，容易发生变化。
第二阶段:出生后两周到断奶以前，动物在母乳喂养 下，肠道内细菌主要以厌氧菌为主，主要为双歧杆菌，肠 杆菌和链球菌数量较少。这个阶段的特点是肠道菌群容易 受食物的影响，食物的微小改变就可以引起肠道菌群发生 较大的变化。
肠道菌群的研究方法进展（分子生态学研究方法）
DNA 指纹图谱技术依据分子大小、核酸序列等特征的不同，将代 表微生物群落中各物种的 DNA 分子标记物在凝胶上进行电泳分离，使 代表不同物种的分子标记迁移到胶上的不同位置，最终得到的电泳图 谱用于显示群落的组成结构。DNA 指纹图谱的最大优点是方便、快速、 直观，常用于检测微生物群落结构的动态变化或比较不同群落之间的 结构差异。最常用的 DNA 指纹图谱技术包括变性梯度凝胶电泳 （Denatured gradient gel electrophoresis，DGGE）[10,11,12]和末端片段长 度多态性（Terminalrestriction fragment length polymorphism, T-RFLP） 等。
UniFrac 是一种通过计算系统发育树上序列的进化距离，比较不同微生物群 落结构差异的系统发育进化方法。 UniFrac方法在比较不同微生物群落结构的差 异时，不仅考虑物种的丰度，更考虑序列之间的进化距离。
参考文献
1. Zoetendal E, Koike S, Mackie R, et al. Molecular ecological analysis of the gastrointestinal microbiota: A review. J of Nutrition, 2004, 134:465-472.
Roche 454(GS FLX Titanium System)超高通量测序技术原理
Roche 454（GS FLX Titanium System）超高通量测序技术原理2005年底，454公司推出了革命性的基于焦磷酸测序法的超高通量基因组测序系统——Genome Sequencer 20 System，被《Nature》杂志以里程碑事件报道，开创了边合成边测序（sequencing-by-synthesis）的先河。
之后，454公司被罗氏诊断公司以1.55亿美元收购。
2007年，他们又推出了性能更优的第二代基因组测序系统—— Genome Sequencer FLX System (GS FLX)。
2008年10月，454推出了全新的GS FLX Titanium系列试剂和软件，让GS FLX的通量一下子提高了5倍，准确性和读长也进一步提升。
想当年，GS 20的出现，揭开了测序历史上崭新的一页。
Jonathan Rothberg博士就是大规模并行测序的发明者，同时也是454的创始人。
上世纪90年代，很多学者也都想到了大规模并行测序，他们试图将Sanger测序移到芯片上，但都以失败告终，因为这项技术没有可扩展性。
1999年，Rothberg的儿子出世，他放了两个星期的陪产假。
小家伙出生后被送入婴儿特护病房，Rothberg非常担心，甚至想获取儿子的基因组信息。
这段担惊受怕的经历给了他灵感，他突然意识到焦磷酸测序（pyrosequencing）不仅简单，而且具有可扩展性。
两个星期之后，Rothberg就开始设计芯片和流动室，让测序在更小的反应室中进行，并同时进行几百万个反应。
硬件的设计和制造也只是成功的一半，在样品制备上还有同样漫长的路要走。
Rothberg摒弃了传统的细菌克隆与挑选，将DNA打断成随机片段，并寻找一种方法来克隆每个片段。
受到其他学者乳液实验的启发，他也想将DNA放入油包水的乳液中，这样就省去了反应管。
一个好汉三个帮。
在Joel Bader等人的帮助下，Rothberg验证了这些想法的可行性，并利用了炸药中的表面活性剂来维持乳液的热稳定性。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。