测序技术原理介绍
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整个过程所用到的软件
Life Technologies
基于荧光共振能的单分子测序合成技术。(fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based single-molecule sequencing-by-synthesis technology ) 技术概要:量子点与聚合酶结合,当有带有荧光标记的核苷酸结合时,在激光的 照射下,量子点与核苷酸相互作用,发出荧光,同时被检测到。
2.ZMW(zero-mode waveguide):十几纳米的小孔能让激光进入后迅速衰减,只有 底部30纳米可见。排除背景影响。此外由于dNTP在荧光信号检测区停留的时间 (毫秒级)与它进入和离开的时间( 微秒级) 相比会很长,所以信号强度会很 大。
3.荧光脉冲的到达时间和持续时间反映了聚合酶动力学信息,而各种修士对聚合 酶动力学的影响不一,从而将它们(N6-甲基腺嘌呤、5-甲基胞嘧啶和5-羟甲基 胞嘧啶等)区分开来。
Ion Torrent
Jonathan Rothberg
Science 327:1190 (2010) Nature Methods 8:41 (2011)
Personal Genome Machine
▪ $50K/instrument ▪ >100bp/read ▪ >1Gb/run ▪ 2h/run ▪ $1.2/Mb
Instrument Amplification
454 GS-FLX Titanium
emPCR
Sequencing
Pyrosequencing
Paired ends Length/read (bp) Throughput/run (bp)
Time/run Reagent cost/Mb
Yes 400-600
逐一加入荧光标记的末端终止子(这个终止子与Illumina终止子不一样,它所有 的终止子都标有同一种单色染料),然后经过洗涤单色成像之后切开荧光染料和 抑制基团,洗涤,加帽,允许下一个核酸进入。如此循环。
Paired-End Reads
Hybridize
~25cycle
To end
~25 cycle
Oxford Nanopore Technologie
电信号
成像
O x f o r d N a n o p o r e Technologies公司正在研究的纳米孔单分子技术是一种基于电信号测序 的技术。他们设计了一种以α-溶血素为材料制作的纳米孔,在孔内共价结合有分子接头环糊精。用 核酸外切酶切割ssDNA时,被切下来的单个碱基会落入纳米孔,并和纳米孔内的环糊精相互作用, 短暂地影响流过纳米孔的电流强度,这种电流强度的变化幅度就成为每种碱基的特征。碱基在纳米 孔内的平均停留时间是毫秒级的,它的解离速率常数与电压有关,180 mV的电压就能够保证在电 信号记录后将碱基从纳米孔中清除。
测序技术原理介绍
▪ 化学测序 ▪ Sanger测序 ▪ NGS(二代测序) ▪ Form the next to the third(三代测序)
▪ Gilbert化学降解法
1. 目的DNA制备 2. 单侧末端标记待测DNA片段 3. 碱基的特异性修饰及化学降解 4. 聚丙烯酰胺凝胶电泳 5. 放射自显影 6. 阅读测序结果
Trends in Genet 24:133(2008)
Base calling
• Homopolymer error
GV6330
Illumina Solexa
Genome Analyzer
▪ Since 2006
Template preparation-bridge RCR
Adaptor ligation
Third-generation sequencing
▪ Single molecular template ▪ Real-time sequencing ▪ Low cost ▪ Long reads
Nat Biotech 28:426 (2010)
Helicos BioSciences
1.将待测DNA随机打成200bp左右的小片段,在每个小片段末端加上ploy-dA,最 后一个A有荧光标记。 2.与玻璃片上随机固定的多个poly-dT引物结合。 3.激光刺激,标记荧光的A发光,确定位置。 4.洗去荧光物质。
Helicos BioSciences
BAC library
Shotgun
Sequencing and assembly
Human Genome Project
$3 billion, 11 years
Whole-genome shotgun method
Craig Venter
Short fragment
Plasmid library Mate-pair sequencing
Surface attachment
Bridge amplification
Denaturation Trends in Genet 24:133(2008)
Cyclic reversible termination
Fluorophore cleavage
Terminating group
Trends in Genet 24:133(2008)
melt Primer
Pacific Biosciences
模板制备
将待测DNA随机打成250bp-6kb的片段,两端加上发卡状的引物序列。
ZMW(zero-mode waveguide)
短测序 讨论??
长测序
主要技术特点
1.荧光标记到磷酸上,合成后自动脱落(传统的是标记到核苷酸的碱基上,大分 子染料会干扰DNA合成酶的活性或者造成聚合反应提前终止)
500M 10h $12.4
Illumina HiSeq 2000
Bridge PCR Reversible termination
Yes
100
200G
8 days
$0.10
ABI SOLiD 5500xl emPCR
Ligation
Yes 50-100 ~155G 8 days ~$0.07
Total direct cost/Mb
Read 1
Read 2
Repetitive DNA Paired read maps uniquely
Single read maps to multiple positions
Mate-pair sequencing
Known Distance
Read 1
Read 2
Molecular Ecology Resources (2011)
SOLiD color space
fluorescent dye
N: Degenerated bases Z: Universal bases Annu Rev Geno Hum Genet 9:387(2008)
Sequencing by ligation
▪ Prime and ligate • Image • Cleave off fluor
Semiconductor sequencing
▪ Detect H+ released as a voltage change—fast ▪ Common microchip design standards—low-
cost manufacturing ▪ Sequencing volume is increasing
Βιβλιοθήκη Baidu
▪ Sanger测序法
1. 单链DNA模板制备 2. DNA模板与测序引物退火 3. 掺入法标记反应 4. 延伸-终止反应 5. 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 6. 放射自显影 7. 阅读测序结果
Hierarchical shotgun (map-based) method
Long fragment
Physical map
Nat Rev Genet 11:31(2010)
• All four labeled reversible terminators are added per cycle
• Remove unincorporated bases and detect signal • Remove the terminating group and the fluorescent dye
$40
$0.25
~$0.11
Purchase cost
$500K
$690K
$595K
Journal of Genetics and Genomics 38:95(2011) Molecular Ecology Resources (2011)
Pair-end sequencing
Known Distance
Scaffold
Assembly
Contig
3 years $300 million
Sanger vs next-generation sequencing
Nat Biotech 26:1135(2008)
Roche 454
Genome Sequencer / FLX
▪ Since 2004
Template preparation- emulsion PCR
Fragmentation
Ligation Water-in-oil emulsion
Mirco-reactor
emPCR
PicoTiter Plate loading Trends in Genet 24:133(2008)
Pyrosequencing
▪ Single dNTP type flows per cycle ▪ Inorganic pyrophosphate (PPi) drives visible light through a series of reactions ▪ Remove unincorporated nucleotide
Sequencing by ligation
▪ Extend sequence • Reset primer
• Extend with new primer
Annu Rev Geno Hum Genet 9:387(2008)
Base decoding
Instrument comparison
Base calling
Solexa测序原理
ABI SOLiD
SOLiD Analyzer
▪ Since 2007
Template preparation-emulsion PCR
Nature Rev Genet 11:31(2010) Annu Rev Geno Hum Genet 9:387(2008)