生物基因工程重组体转入受体细胞

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二、重组DNA导入大肠杆菌 1. 外源DNA导入细菌的几种方法 （1）转化（transformation) （2）转导（transduction)
（3）转染（transfection)
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转化(transformation)
转化：通过自动获取或人为地供给外源DNA，使 细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型。
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转导（transduction)
例 λ噬菌体的生活史
2. 转化率 每gDNA转化成功的细菌克隆数。
3. 转化方法 （1）热休克法（heat shock） 简单，但转化效率不高（106-108/gDNA）。 （2）电转化法 转化效率高（高于109/gDNA）。
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原指将噬菌体、病毒或以其为载体构建的重组子导 入受体细胞的过程。
通过感染方式将外来DNA引入宿主细胞，并导致 宿主细胞遗传性状改变的过程称为转染。
将任何类型DNA转移至动物细胞内的过程均可叫 转染。
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转化（transformation)
例：溶菌时，裂解的DNA片段被另一细菌摄取。
2°C离心 集菌
转化
加入 1mLSOC 培养液
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4. 平板培养 基培养细菌
10-100L转 化液
涂于含抗 菌素的平 板
37℃过夜
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5. 影响转化率的因素 （1）重组质粒 ①环形质粒数 环形重组质粒 质粒自我连接 线性载体或DNA片断进入细菌会被降解。
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冰浴15分钟， 2°C离心集菌
少量冰冷 的水重悬
2°C离心 收集菌体
冰冷的水 重悬菌体
分装成 50-300L
0.5g质粒 DNA
On ice 混合
电转仪调为 2.5kV,25F
脉冲控制器 200-400
10-100L转化液涂
37°C中速震
含抗菌素的平板
荡60分钟
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冰冷的水 重悬菌体
④储存感受态菌要在-70℃以下
⑤使用感受态菌时必须迅速融化
融化后一般不能再次冻存使用。
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6. 体外包装的噬菌体的转导
（1）体外包装（in vitro packaging）
把重组的噬菌体DNA或Cosmid质粒DNA 包装成具有感染能力的噬菌体颗粒。
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目的基因
限制性内切酶
载体
限制性内切酶
重组体
T4 DNA连接酶 15ºC
载体自连
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目的基因 自连
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（2）感受态细胞 （competent cells)
①生长状态
制备感受态菌必须使用对数生长期的菌。
②必须在冰冷的条件下制备。
③CaCl2处理 要充分，使细菌细胞膜增加通透性。
第一节 重组体导入细菌细胞 一、感受态大肠杆菌的制备
1. 目的
增加受体菌百度文库细胞膜的通 透性。
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2. 菌种 使用丧失了限制体系的大肠杆菌。 如K12系列的大肠杆菌。
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3. 制备原理 用CaCl2处理大肠杆菌，能增加膜的通透性。
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第五章 重组体导入受体细胞 第一节 重组体导入细菌细胞 第二节 重组DNA导入真核细胞
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第一节 重组体导入细菌细胞 一、感受态大肠杆菌的制备 二、重组DNA导入大肠杆菌
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噬菌体1 外壳蛋白基因E发生了无义突变，不 能合成头部蛋白，但能合成其它外壳 蛋白（尾部蛋白）。
噬菌体2 外壳蛋白基因D发生了无义突变，不 能合成头部的包装识别蛋白，但能合 成其它外壳蛋白（头部、尾部蛋白）。
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E基因 突变
D基因 突变
只合成尾部 蛋白和包装 识别蛋白
提取尾 部蛋白
合成头部蛋 白和尾部蛋 白，但不能 聚合和包装
DNA
提取头 部和尾 部蛋白
体外包装 成活性噬 菌体
重组的载体 DNA
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(4) 体 外 包 装 过 程
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（5） 转导
体外包装好的重组噬菌体感染受体菌，使受 体菌发生溶菌，形成噬菌斑。（每g DNA 能形成106噬菌斑）。
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（1）热休克法
10ng载 体DNA
100L感 受态菌
10-100L转化 液涂含抗菌素 的平板
吸附DNA
On ice混 合，静置 10分钟
摄入DNA 42ºC 1分钟
37℃摇1小时
加入1mL LB培养基
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（2）电转化法
LB培养受体菌至 OD600=0.5-0.6
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4. 制备过程
培养大 肠杆菌
OD600至 0.3-0.4
On ice 510 min
4℃离心 收集菌
On ice 30 min
4℃离心 收集菌
用冰冷的 60mMCaCl2 重悬
用冰冷的 60mMCaCl2 重悬
4℃离心 收集菌
用冰冷的 60mMCaCl2 重悬
分装、-70 ℃ 冻存
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转导(transduction)
转导：当病毒从被感染的供体细胞释放出来，再次
感染另一受体细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之 间的DNA转移及基因重组即为转导作用
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转染(transfection)
转染是转化的一种特殊形式。 由transformation （转化）和 infection（感染）两词构成。
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第二节 外源基因导入真核细胞 一、导入酵母细胞 二、导入植物细胞 三、导入哺乳动物细胞
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（2）cI857基因突变的噬菌体
cI857基因是个温度敏感性阻遏蛋白基因， 感染细菌后，在32℃下培养细菌时能够保 持溶源性。
但当温度升高到44℃—45℃时，就会导致 cI基因编码的阻遏蛋白失活，DNA复制、 外壳蛋白合成。
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（3） 互补型噬菌体
在cI857基因突变的噬菌体的基础上， 选择两种外壳蛋白的突变型噬菌体。