生物基因工程重组体转入受体细胞
第六章 重组DNA导入受体细胞
根据基因转移方法的特性，重组DNA导入受体细胞的 方法有以下几种： •转化：将重组质粒导入受体细菌细胞，使受体细菌遗传 性状发生改变的方法； •转染：将携带外源基因的病毒感染受体细胞的方法（磷 酸钙沉淀法与体外包装法）； •微注射技术：将外源基因直接注射到真核细胞内的方法； •电转化法 •基因枪技术：又称微弹技术或高速离子轰击法； •脂质体介导法 •其他方法：快速冷冻法、碳化硅纤维介导法。
CaCl2使细菌发生休克后，立即进行转化（E.coli X1776
可长期冷藏，并保持其摄取DNA的能力）。 也可以采用Rb+、Mn2+、K+、二甲基亚砜、二流苏糖
醇（DTT）等制备感受态细胞。
CaCl2制备感受态细胞的一般过程：
•E.coli 接种于LB agar培养基，37℃培养一晚；
•挑选3-5个大菌落，接种于50ml LB培养基，37 ℃振摇培 养一晚后，在A550测定，要求细菌繁殖一定量（一般为对 数生长期）；
以病毒（噬菌体）为载体，转染宿主细胞的方法主 要有磷酸钙沉淀法和体外包装转染法。 一、磷酸钙沉淀法
磷酸钙沉淀法（磷酸钙-DNA共沉淀法），它能把外 源基因与λ噬菌体DNA的重组子导入大肠杆菌和哺乳动物 细胞，但转染效率仍不如体外包装法。
细胞具有摄取磷酸钙沉淀的双链DNA（吞噬DNA-磷酸 钙复合颗粒）的能力，几乎所有的双链DNA都可以通过这 种方法导入细胞。
第六章重组dna导入受体细胞????????????外源基因与载体在体外连接成重组体dna分子后需要将其导入受体细胞进行扩增和筛选得到大量单一的重组体分子这就是外源基因的无性繁殖即
第六章 重组DNA导入受体细胞
内容提要
•克隆与导入方法 •转化 •转染 •共转化 •电转化 •基因枪法 •微注射技术 •脂质体导入法 •转化酵母菌 •植物细胞的基因转移方法 •哺乳动物细胞基因导入法 •反转录病毒载体的转染
基因工程知识要点
基因⼯程知识要点第⼀章1.基因⼯程:是在分⼦⽔平上进⾏的遗传操作，指将⼀种或多种⽣物体（供体）的基因或基因组提取出来，或者⼈⼯合成的基因，按照⼈们的愿望进⾏严密的设计，经过体外加⼯重组，转移到另⼀种⽣物体（受体）的细胞内，使之能在受体细胞遗传并获得新的遗传性状的技术。
2.基因⼯程的基本过程为哪些？切—接—转—增—检①获得⽬的基因：从供体细胞分离出基因组DNA，⽤内切酶将外源DNA切开。
——切（同时选择运载⽬的基因的载体）②⽬的基因与载体DNA拼接：⽤DNA连接酶将含有外源基因的DNA⽚段接到载体分⼦上，形成DNA重组分⼦。
——接③重组体分⼦导⼊受体细胞：借助于细胞转化⼿段将DNA重组分⼦导⼊受体细胞中。
——转④短时间培养转化细胞，以扩增DNA重组分⼦或使其整合到受体细胞的基因组中。
——增⑤筛选和鉴定转化细胞，获得使外源基因⾼效稳定表达的基因⼯程菌或细胞。
——检3.哪些基因是真核⽣物特有的？①假基因：核苷酸序列同其相应的正常功能基因基本相同，但却不能合成出功能蛋⽩质的失活基因。
②基因家族：由功能相关的基因成套组合形成③重复序列哪些是原核⽣物特有的：插⼊序列。
哪些是真核和原核共有的：移动基因、重叠基因第⼆章1.寄主细胞控制的限制与修饰宿主控制限制——核酸限制性内切酶宿主控制修饰——修饰的甲基转移酶以λ(k)噬菌体侵染E.coli B菌株为例解释寄主控制与修饰的现象。
（简述寄主控制的限制与修饰现象。
⼤多数细菌的噬菌体侵染都存在着⼀些功能性障碍。
所谓的寄主控制的限制与修饰现象简称（R/M体系）。
R/M体系：寄主是由两种酶活性配合完成的⼀种是修饰的甲基转移酶——修饰另⼀种是核酸内切限制酶——限制R/M体系的作⽤：保护⾃⾝的DNA不受限制；破坏外源DNA使之迅速降解；2. 简述Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型核酸内切酶的基本特性。
（1）Ⅰ型酶基本特性①有内切酶活性和甲基化酶活性——互斥②需要ATP、SAM（S—腺苷甲硫氨酸）和Mg 2+辅助因⼦；③EcoB和EcoK是由三种不同亚基组成。
动物基因工程—目的基因导入受体细胞
目的基因导入受体细胞
二、基因导入方法
（1）显微注射法 利用显微注射仪，通过机械方法把外源DNA直接注入细胞质或细胞核的基因转化
方法。 一般是微管吸取供体DNA溶液，在显微镜下准确地插入受体细胞核中，并将
DNA注入进去。此法常用于转基因动物的基因转移。
将外源基因用微玻璃管在显微镜下注射入受精卵细胞核中
目的基因导入受体细胞
一、受体细胞（receptor cell）
作为基因工程的宿主细胞必须具备的条件： 便于重组DNA分子导入；能使重组DNA分子稳定 存在；便于便于重组体的筛选；遗传稳定性高，易于扩 大培养；安全性高，无致病性，不会对外界环境造成生 物污染；利于外源基因蛋白产物高效表达。
目的基因导入受体细胞
入的外源基因进行遗传分析。
目的基因导入受体细胞
一、受体细胞（receptor cell）
原核生物受体细胞缺点
原核生物细胞不具备真核生物的蛋白质折叠复性系统，即使真核生物基 因能得到表达，得到的多是无特异性空间结构的多肽链。
原核生物细胞缺乏真核生物的蛋白质加工系统，而许多真核生物蛋白质 的生物活性正是依赖于其侧链的糖基化或磷酸化等修饰作用。
二、基因导入方法
（4）基因枪法
又称微弹轰击法，是利用高速运行的金属颗粒（微弹，1um）轰击细胞时能进入细胞内的 现象，将包裹在金属颗粒（钨或金颗粒）表面的外源DNA分子随之带入细胞进行表达的基 因转化方法。
基本做法：先将外源DNA溶液与钨或金颗粒（直径0.5-um）共同保温，使DNA吸附于金 属颗粒表面，然后放电加速金属颗粒，使之以400m/s的速度直接喷射受体细胞，外源 DNA随金属颗粒进入细胞内部。
具有趋化性的农杆菌移向这类植物受伤细胞，并将其Ti质粒上的T-DNA转移至细 胞内部。根据这一性质，将待转移的目的基因组入Ti质粒载体，通过农杆菌介导进入 植物细胞，与染色体DNA整合，得以稳定维持或表达。
何水林版基因工程第五章基因的转移与重组体的筛选和鉴定
带酶切位点的PCR产物 5’- GCAGAATTC
PCR产物 PCR产物
GGATCCGCG CCTAGGCGC BamH I位点
-3’
-5’
3’- CGTCTTAAG
EcoR I位点
EcoR I BamH I 5’AATTC 3’- G PCR产物 PCR产物 G -3’ CCTAG -5’
两头各有一个粘性末端！
4. DEAE-葡萄糖转染法 二乙氨乙基（DEAE）葡聚糖为多聚阳离子试剂，能 促进哺乳动物细胞摄入外源DNA。
葡聚糖
++ ++++++ ++ + + + 二乙氨乙基 + + （DEAE） ++ ++ ++++
++ ++++++ ++ + + + 二乙氨乙基 + + （DEAE） ++ ++ ++++ - - - -- - DNA - - --- -
4、在培养基中生长数小时之后，球形细胞复原并增殖。
操作步骤： 10ng 载体DNA 100L 感受态细胞 10-100L转化液 涂Amp＋平板
（p140）
吸附DNA 冰浴30min
摄入DNA 42℃ 1~2min
37℃ 振荡培养1h
加入1mL LB培养基 （Amp-）
转化率：106-108/g DNA
（一）转化率的计算：
转化率 ＝ 产生菌落的总数 / DNA的加入量
基因工程复习资料
基因工程复习资料克隆：是指从一个共同祖先无性繁殖下来的一群遗传上相同的DNA 分子、细胞或者个体所构成的特殊的生命群体载体：携带外源DNA进入宿主细胞的工具。
化学本质：DNA 1.运送外源基因高效转入受体细胞2.为外源基因提供复制能力或者整合能力3.为外源基因的扩增或者表达提供条件。
基因工程的含义：按照预先设计好的蓝图，利用现代分子生物学技术，特别是酶学技术，对一种生物（供体）的遗传物质（DNA ）直接进行体外重组操作与改造，并转移到另外一种生物（受体）中去，从而实现受体生物的定向改造与改良。
黏性末端是指DNA分子在限制酶的作用之下形成的具有互补碱基的单链延伸末端结构，它们能够通过互补碱基间的配对而重新环化起来DNA连杆，是指用化学方法合成的一段由10～12个核苷酸构成的、具有一个或者数个限制酶识别位点的寡核苷酸片段。
DNA接头它是一类由人工合成的一头具有某种限制性内切酶粘末端，另一头为平末端的特殊的双链寡核苷酸片段。
当它的平末端与平末端的外源DNA片段连接之后，便会使后者成为具黏性末端的新的DNA分子，而易于连接重组。
载体：携带外源DNA进入宿主细胞，并为其提供复制与功能基因表达调控系统的工具。
目的基因：基因工程中克隆的目标DNA分子SD序列：mRNA中起始密码子上游8-13个核苷酸处有一段富含嘌呤核苷酸的顺序，它能够与30S亚基中的16S rRNA 3’端富含嘧啶的尾部互补，形成氢键结合，有助于mRNA的翻译从起始密码子处开始启动子：DNA分子与RNA聚合酶特异结合的部位，也是转录开始的部位基因组文库：某种生物的基因组的全部遗传信息通过克隆载体贮存在一个受体菌的群体之中，这个群体即为该生物的基因组文库。
cDNA：以mRNA为模板合成的互补脱氧核糖核苷酸序列。
cDNA文库：某种生物基因组转录的的全部mRNA经反转录产生的各类cDNA分别与克隆载体重组，贮存在一个受体菌的群体中，这个群体就称之cDNA文库。
基因工程
1、基因工程，是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序，也称为分子克隆技术。
（供体基因、受体细胞、载体是重组DNA技术的三大基本元件。
）2、同尾酶：识别的靶序列也各不相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，这一类限制酶特称为同尾酶。
这两个相同的粘性末端称为配伍未端。
3、同裂酶：有一些来源不同的限制酶识别的是同样的核苷酸靶子序列，这类酶特称为同裂酶。
同裂酶的切点位置可相同或不同。
4、1酶活性单位（U）：某种限制性核酸内切酶在最适反应条件下，60 min内完全切割1μg λDNA所需的酶活性5、星号（*）活性：如果改变反应条件就会影响酶的专一性和切割效率，称星号（*）活性。
6、停滞效应：PCR中后期，随着目的DNA扩展产物逐渐积累，酶的催化反应趋于饱和，DNA扩增产物的增加减慢，进入相对稳定状态，即为停滞效应，又称平台期。
7、PCR扩增引物：是指与待扩增互补的人工合成的寡核苷酸短片段，其长度通常在15～30个核苷酸之间。
8、linker：是指用化学方法合成的一段由8~12个核苷酸组成，具有一个或数个限制酶识别位点的平末端的双链寡核苷酸片段。
9、衔接头：它是一类人工合成的一头具有某种限制酶切的粘性末端另一头为平末端的特殊的双链寡核苷酸短片段。
10、粘性末端：因酶切位点在两条DNA单链上不同（对称），酶切后形成得具有互补碱基的单链末端结构。
酶切后产生两个粘性末端很容易通过互补碱基的配对而重新连接起来。
11、平末端：因酶切位点在两条DNA单链上相同，酶切后形成的平齐的末端结构，这种末端不易重新连接起来。
12、基因克隆载体：通过不同途径将承载的外源DNA片段（基因）带入受体细胞且能在其中维持的DNA分子。
也称DNA克隆载体。
13、cos位点：λDNA两端各有12bp的粘性末端，粘性末端形成的书暗恋区域称为~~14、受体细胞:又称为宿主细胞或寄主细胞(host cell)等，从实验技术上讲是能摄取外源DNA并使其稳定维持的细胞；从实验目的上讲是有应用价值和理论研究价值的细胞。
基因工程原理-第5章重组基因导入受体细胞
转化率＝
转化子 DNA分子数
＝
Ca2+诱导大肠杆菌转化法
① 低温下使磷质层形成液晶结构， Ca2+： 使膜间核酸酶分离 ② 与DNA结合，抗DNase
（1）感受态的制备
对数生长后期的菌体 5x107个/毫升
冰浴10分钟
含CaCl2缓冲液 15分钟 含CaCl2缓 冲液
（3）筛选转化子。
（2）DNA分子转化感受态细胞
菌间接合转移的有关基因
tra。
（Vir 区）
（Con区）
出毒性。占Ti质粒 1/3。
Ori区 ——复制起始区。
外源基因
Ti质粒载体
限制性酶 切开
（1）叶盘法转化植物细胞
（2）整体植株接种转化法
人为地在整体植株上造
成创伤部位，然后把农杆菌
接种在创伤表面，使农杆菌 按照天然的感染过程在植株
体内进行侵染。获得转化的
CHO，猴肾细胞等
• 受体动物：鼠、牛、羊、鱼等
第二节 重组基因导入受体细胞
一、重组基因导入原核受体细胞
接受DNA片段
（一）转化
1928年英国学者F·Griffth在肺炎双球菌中发现的，证
明了遗传的物质基础是DNA。
转化（transformation）——重组质粒DNA分子进入受体细胞，并在受 体细胞稳定维持和表达的过程，转化后的受 体菌，称转化子。 转化子 细胞数
（二）植物病毒介导基因转移 DNA病毒20%
植物病毒
RNA病毒80%
花椰菜花叶病毒：双链DNA病毒
（三）化学诱导DNA直接转化 （1）多聚物介导法 聚乙二醇 多聚赖氨酸 多聚鸟苷酸
（2）脂质体介导基因转化
脂质体
（四）物理方法介导DNA直接转化 （1）基因枪转化
环境微生物学试题(六)
环境微生物学试题(六)一、名词解释（每题1.5分，计30分）自发裂解简单染色异形胞初生菌丝异宗配合次级代谢促进扩散专性厌氧菌致死时间DNN 转录根土比生物圈COD 氨化作用污泥浓度自然挂膜法废气的微生物洗涤法酶生物传感器低温微生物二、是非题（每题1分，计10分）1.毒性噬菌体在细菌细胞中复制并导致细胞的裂解死亡。
( )2.原生动物是具有类似动物特征的原核微生物。
( )3.在实验室中细菌不能形成菌落。
( )4.嗜盐微生物是那些能够生活在高盐环境中的微生物。
( )5.在微生物生长的滞留适应期，细胞快速分裂。
( )6.磷在细胞代谢中非常重要，因为它用于合成核苷酸和磷脂。
( )7.在反硝化过程中，气体氮转化为硝酸盐，后者供给细菌。
( )8.在各种污水处理方法中，最根本、有效和简便的方法就是利用微生物的处理法。
( )9.显微镜的放大倍数愈高,其视野面积愈大。
( )10.芽孢是芽孢细菌的繁殖器官。
( )三、选择题（每题1分，计20分）1. 路易·巴斯德对微生物学的贡献在于他_______。
(a)发现了病毒(b)提出了自然发生说理论(c)抨击了进化论(d)号召人们关注微生物在日常生活中的重要性2. 溶源菌遇到同一种噬菌体或与之密切相关的噬菌体时表现为______。
(a) 抗性 (b) 免疫性(c) 再次溶源性(d) 裂解3. 原核细胞细胞壁上特有的成分是______(a)肽聚糖(b)几丁质(c)脂多糖(d)磷壁酸4. 一般来说，构成酶母菌营养体的基本单位是______。
(a) 菌丝 (b) 菌丝体(c) 无隔菌丝(d) 有隔菌丝5. 胞饮（作用）和吞噬（作用）两者都是原生动物所采用的_____的过程。
(a）带物质进人细胞质（b) 执行渗透（作用）(c）用日光能量合成糖类(d）从氨基酸合成蛋白质6. 下列物质属于生长因子的是________(a) 葡萄糖(b) 蛋白胨(c) NaCl (d) 维生素7. 具有酶辅助因子功能的有机分子是______。
基因工程基本操作过程
双酶切片段的定向克隆的优点
外源DNA只能以一个方向定向插入到重组质粒中， 以便目的基因的正确转录和表达。
载体与外源DNA结合处的限制酶切位点仍然保留， 可以随时从重组载体中通过相应的限制性内切酶 切割后分离获得目的基因。
17、空山新雨后，天气晚来秋。。上午8时41分24秒Lo上re午m 8ip时su4m1分do0lo8r:4si1t:a2m42e2t,.8co.7nsectetur adipiscing elit. Fusce id urna blandit, eleifend nulla ac,
若调控基因可能有增强子作用，还应在报告基因下游 适当部位插入一个功能基因，由此反映增强子的作用。
为了将目的基因重组于载体分子之中， 需要将载体DNA和目的基因分别进行适 当处理，使其可以互相连接，形成新的 重组分子。
载体DNA通常有着许多酶切位点．但是并不是所 有的酶切位点都可用于重组切割，理想的酶切位 点应该符合下列几个条件:
缺点：如果待克隆的DNA片段或基因的内部，也 含有与所加的人工接头相同的限制酶切位点，这 样在酶切消化人工接头产生粘性末端的同时，也 会把克隆的外源基因切成不同的片段，从而为后 继的操作造成麻烦。
自从 1973 年 Jackson 等人在一次分子生物学学 会上首次提出基因可以人工重组，并能在细菌中复 制。从此以后，基因工程成为一项新兴的研究领域 得到了迅速的发展，无论是基础研究，还是应用研 究均取得了喜人的成果。这是生命科学发展的一次 飞跃，生命科学已经进入了一个定向、快速改造生 物性状的新时代，受到了国内外广泛的重视。
上述方法的缺点：由限制酶产生的具有粘性末端的载 体DNA分子，在连接反应中常发生自我环化作用，并 在连接酶的作用下重新变成稳定的共价闭合环状结构。
(参考)基因工程 第六章 DNA重组的操作
(三) 酶联免疫吸附测定（ELISA） Enzyme-linked immunosorbant assay 1. 原理：
一抗（primary antibody）: 与目标分子的特异结合。 二抗（secondary antibody）： 与一抗的特异性结合。
2. 酶联（enzyme-link）： 二抗上携带一种酶能催 化无色底物转变为有色的物质（或发光），再通 过比色测定有色物质的含量（或光强度），从而
其中载体介导的转化方法是目前植物基因工程中使用最多、 机制最清楚、技术最成熟的一种转化方法，而转化载体中 又以Ti质粒转化载体最为重要。
26
（三）重组DNA导入动物细胞
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 磷酸钙沉淀法 脂质体介导感染法 显微注射法 病毒感染法 DEAE葡聚糖转染技术 电击法 血影细胞介导法
为了克服以上弊端，目前对平末端连接常采用同 聚物加尾法、衔接物连接法和DNA接头连接法等改 进方法。
9
三、PCR产物的连接
PCR扩增是获得目的基因的重要途径 PCR产物的连接是基因工程实验中经常性的工作， 其主要方法有：
引入酶切位点克隆法、T-A克隆法和平末端克隆法等
10
（一）引入酶切位点连接法
21
电转化的原理图（引自孙明，2006）
22
（二）感染 将以λ噬菌体DNA为载体的DNA重组分子包装成病毒 颗粒，使其感染受体菌的过程称为感染，由噬菌体 和细胞病毒介导的遗传信息转移过程也称为转导 （transduction）
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二、重组DNA导入真核细胞的方法
常用的方法有电击法、磷酸钙沉淀法、脂质体 介导法等； 进入细胞的DNA可以被整合至宿主细胞的基 因组中，也可以在染色体外存在和表达。
基因工程的载体和受体情况讲解
（2）质粒的不相容性（incompatibility）
任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于 一个细胞中，这种现象称为质粒的不相容性，不相容性的质
（3）质粒的可转移性
据此，革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类： ✓接合型质粒：能在天然条件下自发地从一个细胞转移到 另一个细胞（接合作用），如F质粒。 ✓非接合型质粒：不能在天然条件下独立地发生接合作用 如Col、R质粒的一些成员。
值得注意的是，某些非接合型质粒（ColE1）在接合型质 粒的存在和协助下，也能发生DNA转移，这个过程由 bom 和mob 基因决定。
R因子（resistance factor）
✓最初发现于痢疾志贺氏菌（Shigella dysenteriae），后来发现 还存在于Salmonella、Vibrio、Bacillus、Pseudomonas和 Staphylococcus中。
✓R因子由相连的两个DNA片段组成，即抗性转移因子 （resistence transfor factor， RTF ）和抗性决定R因子（rdeterminant）。RTF为分子量约为11×106 Dalton，控制质粒拷 贝数及复制。抗性决定因子大小不固定，从几百万到100×106 Dalton以上，其上带有抗生素的抗性基因。
基因工程的载体和受 体情况讲解
一、用于基因克隆的载体
1.载体的概念
（1）携带外源DNA进入宿主细胞的工具。 （2）能够运载外源DNA片段（目的基因）进入受体细胞， 具有自我复制能力，使外源DNA片段在受体细胞中得到扩 增和表达，不被受体细胞的酶系统所破坏的一类DNA分子。 （3）实质：用来携带目的基因片段进入受体细胞。
基因工程复习资料
分子克隆技术:指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序，也称为分子克隆技术克隆：是指从一个共同祖先无性繁殖下来的一群遗传上相同的DNA 分子、细胞或个体所组成的特殊的生命群体载体：携带外源DNA进入宿主细胞的工具。
化学本质：DNA 1.运送外源基因高效转入受体细胞2.为外源基因提供复制能力或整合能力3.为外源基因的扩增或表达提供条件。
基因工程的含义：按照预先设计好的蓝图，利用现代分子生物学技术，特别是酶学技术，对一种生物（供体）的遗传物质（DNA ）直接进行体外重组操作与改造，并转移到另外一种生物（受体）中去，从而实现受体生物的定向改造与改良。
黏性末端是指DNA分子在限制酶的作用之下形成的具有互补碱基的单链延伸末端结构，它们能够通过互补碱基间的配对而重新环化起来DNA连杆，是指用化学方法合成的一段由10～12个核苷酸组成的、具有一个或数个限制酶识别位点的寡核苷酸片段。
DNA接头它是一类由人工合成的一头具有某种限制性内切酶粘末端，另一头为平末端的特殊的双链寡核苷酸片段。
当它的平末端与平末端的外源DNA片段连接之后，便会使后者成为具黏性末端的新的DNA分子，而易于连接重组。
载体：携带外源DNA进入宿主细胞，并为其提供复制和功能基因表达调控系统的工具。
目的基因：基因工程中克隆的目标DNA分子SD序列：mRNA中起始密码子上游8-13个核苷酸处有一段富含嘌呤核苷酸的顺序，它可以与30S亚基中的16S rRNA 3’端富含嘧啶的尾部互补，形成氢键结合，有助于mRNA的翻译从起始密码子处开始启动子：DNA分子与RNA聚合酶特异结合的部位，也是转录开始的部位基因组文库：某种生物的基因组的全部遗传信息通过克隆载体贮存在一个受体菌的群体之中，这个群体即为该生物的基因组文库。
cDNA：以mRNA为模板合成的互补脱氧核糖核苷酸序列。
基因工程作业题及答案
基因工程作业题及答案作业一：一、名词解释：1、基因：是遗传的物质基础，是DNA（脱氧核糖核酸）分子上具有遗传信息的特定核苷酸序列的总称，是具有遗传效应的DNA分子片段。
2、基因组该指单倍体细胞中包括编码序列和非编码序列在内的全部DNA分子3、操纵子:原核生物的几个功能相关的结构基因往往排列在一起，转录生成一个mRNA，然后分别翻译成几种不同的蛋白质。
这些蛋白可能是催化某一代谢过程的酶，或共同完成某种功能。
这些结构基因与其上游的启动子，操纵基因共同构成转录单位，称操纵子。
4、启动子:是RNA聚合酶结合位点周围的一组转录控制组件，包括至少一个转录起始点。
在真核基因中增强子和启动子常交错覆盖或连续。
有时，将结构密切联系而无法区分的启动子、增强子样结构统称启动子。
5、增强子:是一种能够提高转录效率的顺式调控元件，最早是在SV40病毒中发现的长约200bp的一段DNA，可使旁侧的基因转录提高100倍，其后在多种真核生物，甚至在原核生物中都发现了增强子。
增强子通常占100～200bp长度，也和启动子一样由若干组件构成，基本核心组件常为8～12bp，可以单拷贝或多拷贝串连形式存在。
6、基因表达：是指细胞在生命过程中，把储存在DNA顺序中遗传信息经过转录和翻译，转变成具有生物活性的蛋白质分子。
二、简答题1、说明限制性内切核酸酶的命名原则要点。
答：限制性内切核酸酶采用三字母的命名原则,即属名+种名+株名的各一个首字母,再加上序号. 基本原则: 3-4个字母组成,方式是:属名+种名+株名+序号; 首字母: 取属名的第一个字母,且斜体大写;第二字母: 取种名的第一个字母,斜体小写;第三字母: (1)取种名的第二个字母,斜体小写;(2)若种名有词头,且已命名过限制酶,则取词头后的第一字母代替.第四字母: 若有株名,株名则作为第四字母,是否大小写,根据原来的情况而定,但用正体. 顺序号: 若在同一菌株中分离了几种限制酶,则按先后顺序冠以I,Ⅱ,Ⅲ,…等,用正体.2、什么是限制性内切核酸酶的星号活性？受哪些因素影向？答：Ⅱ类限制酶虽然识别和切割的序列都具有特异性，但是这种特异性受特定条件的限制，即在一定环境条件下表现出来的特异性。
目的基因导入受体细胞及重组子的筛选
活化菌种，扩大培养，使其 处于对数生长后期 （OD600=0.4）
3-4 ml菌液冰水浴中10 分钟，4 ℃离心集菌
转 入 37 ℃ 水 浴 上5 min， 加入 1 ml不含选择性 药 物 的 LB 培 养 基
转入42 ℃水浴 上 2 min ， 使 感受态细胞吸 收重组DNA。
0.2 ml新制备好 的感受细胞中加 入缓冲液溶解的 重 组 DNA ， 置 于冰水浴中1 h 以上，期间轻摇 几次
第三节 重组子的筛选
在重组DNA分子的转化、转染或转导过程中，并非所有的受 体细胞都能被导入重组DNA分子，一般仅有少数重组DNA分子能 进入受体细胞。再者，在这些被转化的受体细胞中，除部分含 有我们期待的DNA分子外，另外一些还可能是由于载体自身或 一个载体与多个外源DNA片段形成的非期待重组DNA分子导入所 致。因此，需要采取必要的方法将重组子从大量的受体细胞中 筛选出来。 ■转化子：导入外源DNA分子后能稳定存在的受体细胞称为转 化子。 ■重组子：含有重组DNA分子的转化子称为重组子。
受体细胞在遗传密码的应用上无明显的偏倚性。 具有较好的转译后加工机制，便于真核目的基因的高效表达。 在理论研究和生产实践上有较高的应用价值。
3.各种类型受体细胞的优缺点
（1）原核细胞 ■优点 大 部 分 原 核 细 胞 没 有 纤 维 素 组 成 的 坚 硬 细 胞 壁 ， 便 于 外 源 DNA的进入。 没有核膜，染色体DNA没有固定结合的蛋白质，这为外源DNA 与裸露的染色体DNA重组减少了麻烦。 基因组简单，不含线粒体和叶绿体基因组，便于对引入的外 源基因进行遗传分析。 原核生物多数为单细胞生物，容易获得一致性的的实验材料， 并且培养简单，繁殖迅速，实验周期短，重复实验快。
基因工程的生物安全问题
基因工程又叫做基因拼接技术或DNA重组技术。
是在生物体外，通过对DNA分子进行人工“剪切”和“拼接”，对生物的基因进行改造和重新组合，然后导入受体细胞内进行无性繁殖，使重组基因在受体细胞内表达，产生出人类所需要的新的生物类型和生物产品。
基因工程拥有巨大应用前景，因此世界各国对基因工程的后果已有了高度的重视。
这里说的“后果”，实际上就是涉及“生物安全性”问题。
生物安全性，简单说，就是生物体对人是否安全，一般特指生物体经过基因工程改造后对人是否还依然安全。
学说争论：有关基因工程改造过的生物产品的生物安全性问题的争论由来已久，就像核技术开始发展时一样，有人坚决反对，也有人认为只要使用得当就能为人类造福。
那么基因工程改造过的生物及其产品到底有没有危险呢？要回答这个问题恐怕不是一两句话可以说得清楚的，这个问题也不是一两年内可以解决的。
应该说，到目前为止，基因工程改造过的生物及产品基本都是安全的，这当然是与各国政府制定相关法规以及各国科学家的共同努力分不开的。
农业应用：1.增加农作物产品的营养价值如增加种子、块茎的蛋白质含量，改变植物蛋白的必需氨基酸比例等。
2.提高农作物抗逆性能如抗病虫害、抗旱、抗涝、抗除草剂等性能。
3.提高光合作用效率从而提高农作物产量。
4.生物固氮的基因工程。
把禾谷等非豆科植物转变为能同根瘤菌共生，或具固氮能力，将代替无数个氮肥厂。
5.增加植物次生代谢产物产率。
~构成全球药物原料的 25% ，如治疗疟疾的奎宁、治疗白血病的长春新碱、治疗高血压的东莨菪碱、作为麻醉剂的吗啡等。
6.培育畜牧业和水产业新品种。
7.其它如肥料等。
在农业上应用的基因工程迄今为止，只发现有一例改造有明显的副作用。
这个例子就是：巴西坚果中有一种基因，它制造一种称为清蛋白的蛋白质，科学家们把这种基因转到农作物中以期提高农产品中的蛋白质含量从而提高品质。
结果发现，蛋白质含量是提高了，但有些人对这种新加入的蛋白质过敏，美国先锋种子公司对这一过程进行了实验，结果该公司的科学家证实，过敏对象正是食用了该转基因果实才过敏的。
生物技术制药
生物技术制药：是指利用生物系统或通过生物反应过程生产药物的技术。
名解生物药物：是指以生物资源为原料或以生物技术为手段开发生产的用作疾病的预防、诊断和治疗的医药品。
名解1）基因工程：又称DNA重组技术（DNA recombination technology），是指按人的意志，将某一生物体（供体）的遗传信息（目的基因）在体外经人工与载体DNA重组，构成重组DNA，然后转入到另一生物体（受体）细胞中，使被引入的外源DNA片段（目的基因）在受体细胞内得以表达和遗传。
名解2）限制酶：限制性核酸内切酶，是一类专一性很强的核酸内切酶，专一地识别和作用于DNA分子上特定的核苷酸序列，切断DNA双链。
名解3）连接酶：能将两段DNA拼接起来的酶叫DNA连接酶。
这类酶的发现和分离纯化，使两个DNA片段在体外连接形成重组DNA分子成为可能。
名解5）限制酶星活性：在标准条件下，每种限制酶都有严格的识别序列。
在非标准条件下，会导致限制酶识别序列的特异性发生改变，在DNA内产生附加切割，称限制酶的第2活性或星活性。
名解6）基因载体：在细胞内具有能进行自我复制的独立DNA分子作为外源DNA片段的运载体，简称基因载体，又称分子克隆载体或无性繁殖载体。
名解3、限制酶有哪些特性？（1）不同限制酶能专一地识别不同的特异核苷酸序列（核苷酸序列不同，序列大小不同）。
（2）各种限制酶的识别序列都具有回文结构。
（3）各种限制酶的切割类型是各式各样的，切后形成各种粘性或平整末端。
①一种是限制酶错位切断DNA双链而形成彼此互补的单链末端，称粘性末端。
②另一种是限制酶在同一位点平齐切断DNA两条链而形成的双链末端，称为平整末端。
（4）在标准条件下，每种限制酶都有严格的识别序列。
在非标准条件下，会导致限制酶识别序列的特异性发生改变，在DNA内产生附加切割，称限制酶的第2活性或星活性。
5、基因载体有哪些特性？6、如何将天然的原始载体改造成理想的基因载体？5、6连①要有复制子（Replicom）功能，且复制起始区中没有限制酶的酶切位点。
基因工程理论课复习整理
基因工程理论复习整理1、基因工程（gene engineering）的定义：在分子水平上进行遗传操作，即将任何生物体（供体）的基因或基因组提取出来，或通过人工合成的目的基因，按照人们预先设计的蓝图，插入质粒或病毒复制子（载体），而形成一杂合分子（DNA重组体），然后将重组体转移到复制子所属的宿主生物体中复制，或转移到另一种生物体（受体）的细胞内（可以是原核细胞也可以是真核细胞），使之能在受体细胞内遗传并使受体细胞获得新的性状。
2、基因工程四大要素：目的基因、载体、工具酶、受体细胞。
3、基因工程特点：分子水平操作，细胞水平表达。
4、基因组DNA提取条件（1）提取DNA总的原则：a保证核酸一级结构的完整性；b其他生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降低到最低程度；c核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；d其他核酸分子，如RNA，也应尽量去除。
（2）影响因素①减少化学因素对DNA的降解：避免过碱、过酸对核酸链中磷酸二酯键的破坏，操作多在pH 4-10条件下进行；②减少物理因素对DNA的降解：避免强烈振荡、搅拌，细胞突置于低渗液中等操作，以避免破坏大分子量的线性DNA分子；③防止核酸的生物降解：避免细胞内、外各种核酸酶对核酸磷酸二酯键的水解作用，DNA酶需要Mg2+、Ca2+的激活，因此实验中常利用金属二价离子螯合剂EDTA，柠檬酸盐，可基本抑制DNA 酶的活性。
5、细胞的破碎:一般采用温和处理法裂解细胞。
6、沉淀基因组DNA：加入一定量的预冷的异丙醇或乙醇。
7、质粒可分为紧密控制型和松弛控制型，基因工程中一般用到的是松弛控制型。
8、利用同一复制系统的不同质粒不能在同一宿主细胞中共同存在，当两种质粒同时导入同一细胞时，它们在复制及随后分配到子细胞的过程中彼此竞争，这种现象称为质粒的不相容性。
9、碱裂解法原理：当用碱处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共价闭环的质粒DNA 在回到中性pH时即恢复其天然构象；变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相中，从而可通过离心将两者分开。
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生物基因工程重组体转入受体细胞
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4. 制备过程
培养大 肠杆菌
OD600至 0.3-0.4
On ice 510 min
4℃离心 收集菌
On ice 30 min
4℃离心 收集菌
用冰冷的 60mMCaCl2 重悬
用冰冷的 60mMCaCl2 重悬
4℃离心 收集菌
用冰冷的 60mMCaCl2 重悬
分装、-70 ℃ 冻存
第一节 重组体导入细菌细胞 一、感受态大肠杆菌的制备
1. 目的
增加受体菌 细胞膜的通 透性。
生物基因工程重组体转入受体细胞
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2. 菌种 使用丧失了限制体系的大肠杆菌。 如K12系列的大肠杆菌。
生物基因工程重组体转入受体细胞
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生物基因工程重组体转入受体细胞
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3. 制备原理 用CaCl2处理大肠杆菌，能增加膜的通透性。
2°C离心 集菌
转化
加入 1mLSOC 培养液
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4. 平板培养 基培养细菌
10-100L转 化液
涂于含抗 菌素的平 板
37℃过夜
生物基因工程重组体转入受体细胞
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5. 影响转化率的因素 （1）重组质粒 ①环形质粒数 环形重组质粒 质粒自我连接 线性载体或DNA片断进入细菌会被降解。
生物基因工程重组体转入受体细胞
冰浴15分钟， 2°C离心集菌
少量冰冷 的水重悬
2°C离心 收集菌体
冰冷的水 重悬菌体
分装成 50-300L
0.5g质粒 DNA
On ice 混合
电转仪调为 2.5kV,25F
脉冲控制器 200-400
10-100L转化液涂
37°C中速震
含抗菌素的平板
荡60分钟
生物基因工程重组体转入受体细胞
冰冷的水 重悬菌体
生物基因工程重组体转入受 体细胞
生物基因工程重组体转入受体细胞
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第五章 重组体导入受体细胞 第一节 重组体导入细菌细胞 第二节 重组DNA导入真核细胞
生物基因工程重组体转入受体细胞
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第一节 重组体导入细菌细胞 一、感受态大肠杆菌的制备 二、重组DNA导入大肠杆菌
生物基因工程重组体转入性内切酶
载体
限制性内切酶
重组体
T4 DNA连接酶 15ºC
载体自连
生物基因工程重组体转入受体细胞
目的基因 自连
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（2）感受态细胞 （competent cells)
①生长状态
制备感受态菌必须使用对数生长期的菌。
②必须在冰冷的条件下制备。
③CaCl2处理 要充分，使细菌细胞膜增加通透性。
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（2）cI857基因突变的噬菌体
cI857基因是个温度敏感性阻遏蛋白基因， 感染细菌后，在32℃下培养细菌时能够保 持溶源性。
但当温度升高到44℃—45℃时，就会导致 cI基因编码的阻遏蛋白失活，DNA复制、 外壳蛋白合成。
生物基因工程重组体转入受体细胞
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（3） 互补型噬菌体
在cI857基因突变的噬菌体的基础上， 选择两种外壳蛋白的突变型噬菌体。
原指将噬菌体、病毒或以其为载体构建的重组子导 入受体细胞的过程。
通过感染方式将外来DNA引入宿主细胞，并导致 宿主细胞遗传性状改变的过程称为转染。
将任何类型DNA转移至动物细胞内的过程均可叫 转染。
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转化（transformation)
例：溶菌时，裂解的DNA片段被另一细菌摄取。
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转导(transduction)
转导：当病毒从被感染的供体细胞释放出来，再次
感染另一受体细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之 间的DNA转移及基因重组即为转导作用
生物基因工程重组体转入受体细胞
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转染(transfection)
转染是转化的一种特殊形式。 由transformation （转化）和 infection（感染）两词构成。
噬菌体1 外壳蛋白基因E发生了无义突变，不 能合成头部蛋白，但能合成其它外壳 蛋白（尾部蛋白）。
噬菌体2 外壳蛋白基因D发生了无义突变，不 能合成头部的包装识别蛋白，但能合 成其它外壳蛋白（头部、尾部蛋白）。
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E基因 突变
D基因 突变
只合成尾部 蛋白和包装 识别蛋白
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转导（transduction)
例 λ噬菌体的生活史
2. 转化率 每gDNA转化成功的细菌克隆数。
3. 转化方法 （1）热休克法（heat shock） 简单，但转化效率不高（106-108/gDNA）。 （2）电转化法 转化效率高（高于109/gDNA）。
生物基因工程重组体转入受体细胞
生物基因工程重组体转入受体细胞
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二、重组DNA导入大肠杆菌 1. 外源DNA导入细菌的几种方法 （1）转化（transformation) （2）转导（transduction)
（3）转染（transfection)
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转化(transformation)
转化：通过自动获取或人为地供给外源DNA，使 细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型。
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生物基因工程重组体转入受体细胞
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第二节 外源基因导入真核细胞 一、导入酵母细胞 二、导入植物细胞 三、导入哺乳动物细胞
④储存感受态菌要在-70℃以下
⑤使用感受态菌时必须迅速融化
融化后一般不能再次冻存使用。
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6. 体外包装的噬菌体的转导
（1）体外包装（in vitro packaging）
把重组的噬菌体DNA或Cosmid质粒DNA 包装成具有感染能力的噬菌体颗粒。
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（1）热休克法
10ng载 体DNA
100L感 受态菌
10-100L转化 液涂含抗菌素 的平板
吸附DNA
On ice混 合，静置 10分钟
摄入DNA 42ºC 1分钟
37℃摇1小时
加入1mL LB培养基
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（2）电转化法
LB培养受体菌至 OD600=0.5-0.6
提取尾 部蛋白
合成头部蛋 白和尾部蛋 白，但不能 聚合和包装
DNA
提取头 部和尾 部蛋白
体外包装 成活性噬 菌体
重组的载体 DNA
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(4) 体 外 包 装 过 程
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（5） 转导
体外包装好的重组噬菌体感染受体菌，使受 体菌发生溶菌，形成噬菌斑。（每g DNA 能形成106噬菌斑）。