《基因工程制药》PPT课件
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基因工程药物 ppt课件
基因工程药物 （工程菌）
PPT课件
1
基因工程药物
• 基因工程药物是先确定对某种疾病有预防和治疗作用的蛋白质， 然后将控制该蛋白质合成过程的基因取出来，经过一系列基因操 作，最后将该基因放入可以大量生产的受体细胞中去，这些受体 细胞包括细菌、酵母菌、动物或动物细胞、植物或植物细胞，在 受体细胞不断繁殖过程中，大规模生产具有预防和治疗这些疾病 的蛋白质，即基因疫苗或药物。
PPT课件
2
工程菌
• 用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌类细胞株系一 般称为“工程菌”。
PPT课件
3
目录
六6 采取的措施
五5 基因工程药物的安全性及质量 检控
四4 基因工程药物的技术路线
三3 基因工程药物的特点
二2 利用微生物生产药物的优越性
一1 基因工程药物的种类
PPT课件
4
一、基因工程药物的种类
• 用于基因治疗的基因工程药物除了能杀死不正常细胞外可能同时伤害正 常的细胞。
• 当用于生产基因工程药物的重组体发生突变或对目的产品进行修饰、纯 化时，都有可能产生或带入一些与目的产品相关联的、结构相差甚微而 生物活性迥异的变异体。
PPT课件
17
六、采取的措施
• 构建基因工程药物表达载体时给目的基因组装诱导型启动子，使 其在诱导条件下才能有效表达。
PPT课件
19
• 目前对基因工程操作的后果还存在一定程度的不可预测性和不可控制性， 转基因生物有可能隐藏某些危害性。
• 基因工程药物与一般药品不同，它来源于活的生物体，在发酵、细胞培 养、产品分离纯化等生产过程有其固有的易变性，导致基因工程药物质 量的不稳定性。
• 在制备的基因工程药物中残留的抗生素有可能使病人产生对抗生素的抗 药性。
PPT课件
1
基因工程药物
• 基因工程药物是先确定对某种疾病有预防和治疗作用的蛋白质， 然后将控制该蛋白质合成过程的基因取出来，经过一系列基因操 作，最后将该基因放入可以大量生产的受体细胞中去，这些受体 细胞包括细菌、酵母菌、动物或动物细胞、植物或植物细胞，在 受体细胞不断繁殖过程中，大规模生产具有预防和治疗这些疾病 的蛋白质，即基因疫苗或药物。
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2
工程菌
• 用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌类细胞株系一 般称为“工程菌”。
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3
目录
六6 采取的措施
五5 基因工程药物的安全性及质量 检控
四4 基因工程药物的技术路线
三3 基因工程药物的特点
二2 利用微生物生产药物的优越性
一1 基因工程药物的种类
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4
一、基因工程药物的种类
• 用于基因治疗的基因工程药物除了能杀死不正常细胞外可能同时伤害正 常的细胞。
• 当用于生产基因工程药物的重组体发生突变或对目的产品进行修饰、纯 化时，都有可能产生或带入一些与目的产品相关联的、结构相差甚微而 生物活性迥异的变异体。
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17
六、采取的措施
• 构建基因工程药物表达载体时给目的基因组装诱导型启动子，使 其在诱导条件下才能有效表达。
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19
• 目前对基因工程操作的后果还存在一定程度的不可预测性和不可控制性， 转基因生物有可能隐藏某些危害性。
• 基因工程药物与一般药品不同，它来源于活的生物体，在发酵、细胞培 养、产品分离纯化等生产过程有其固有的易变性，导致基因工程药物质 量的不稳定性。
• 在制备的基因工程药物中残留的抗生素有可能使病人产生对抗生素的抗 药性。
《基因工程制药技术》课件
02
该系统可用于生产具有治疗价值 的蛋白质药物，如疫苗、抗体等
。
转基因植物表达系统的优点是生 产成本低，且易于大规模生产。
03
缺点是可能存在食品安全和环境 问题，需要加强监管和控制。
04
04 基因工程制药的挑战与前 景
安全性问题
基因工程制药产品的安全性是首要考 虑的问题，需要经过严格的临床试验 和审批程序，确保产品的安全性和有 效性。
02 基因工程制药技术的基本 原理
基因克隆与表达
基因克隆
01
通过特定的方法将目的基因从生物体中分离出来，并在体外进
行复制和扩增的过程。
基因表达
02
在细胞内，基因通过转录和翻译过程，将遗传信息转化为蛋白
质的过程。
基因克隆与表达在制药工业中的应用
03
利用基因克隆技术获取药物靶点基因，通过基因表达技术生产
未来发展前景与展望包括开发更加高效和精准的基因工程制药技术、拓展新的治 疗领域和应用范围、降低生产成本和提高可及性等，需要加强研发和创新投入， 推动基因工程制药技术的可持续发展。
பைடு நூலகம்
05 基因工程制药的案例分析
胰岛素的基因工程生产
总结词
通过基因工程技术，将胰岛素基因转入到大肠杆菌或 酵母菌中，实现大规模生产。
感谢您的观看
THANKS
具有生物活性的蛋白质药物。
重组DNA技术
01
重组DNA技术
通过人工方法将不同来源的DNA片段进行剪切、拼接和重组，形成新
的DNA分子。
02
重组DNA技术在制药工业中的应用
利用重组DNA技术构建基因表达载体，将目的基因导入受体细胞，实
现目的基因的高效表达。
《基因工程制药》课件
、改变细胞特性等。
基因治疗技术
基因治疗技术定义
基因治疗技术是指将目的基因导入到病变细胞中，以纠正 或补偿缺陷的基因，从而达到治疗疾病的目的的技术。
基因治疗技术原理
基因治疗技术基于分子生物学原理，通过将目的基因导入 到病变细胞中，实现对缺陷基因的补偿或纠正，从而改善 疾病症状。
基因治疗技术应用
基因治疗技术在遗传性疾病、肿瘤等疾病的治疗中具有广 泛的应用前景，例如用于治疗囊性纤维化、血友病等遗传 性疾病。
基因修饰技术
基因修饰技术定义
基因修饰技术是指通过特定的方 法对目的基因进行修饰，以改变
其表达水平或功能的技
基因修饰技术原理
基因修饰技术主要基于DNA的化 学修饰和酶学修饰，通过改变目 的基因的序列、启动子、增强子 等调控元件，实现目的基因的高
表达或抑制表达。
基因修饰技术应用
基因修饰技术在制药、生物治疗 、生物合成等领域具有广泛的应 用，例如用于生产重组蛋白药物
。
03
免疫反应
免疫反应是基因工程制药中另一个重要问题，可能导致免疫排斥或免疫
攻击。解决方案包括采用免疫沉默技术、降低免疫原性等。
伦理与法律问题
伦理问题
基因工程制药涉及人类基因改造，可能引发伦理争议，如人 类尊严、基因优劣等。解决方案需要遵循伦理原则，如尊重 人权、保护隐私等。
法律问题
基因工程制药涉及法律法规的制定和执行，可能存在法律空 白或法律冲突。解决方案需要完善相关法律法规，明确监管 职责和法律责任。
基因工程制药的发展历程
1970年代
基因工程的诞生，科学 家开始探索利用基因工
程技术生产药物。
1980年代
基因工程药物开始进入 临床试验阶段，如胰岛
基因治疗技术
基因治疗技术定义
基因治疗技术是指将目的基因导入到病变细胞中，以纠正 或补偿缺陷的基因，从而达到治疗疾病的目的的技术。
基因治疗技术原理
基因治疗技术基于分子生物学原理，通过将目的基因导入 到病变细胞中，实现对缺陷基因的补偿或纠正，从而改善 疾病症状。
基因治疗技术应用
基因治疗技术在遗传性疾病、肿瘤等疾病的治疗中具有广 泛的应用前景，例如用于治疗囊性纤维化、血友病等遗传 性疾病。
基因修饰技术
基因修饰技术定义
基因修饰技术是指通过特定的方 法对目的基因进行修饰，以改变
其表达水平或功能的技
基因修饰技术原理
基因修饰技术主要基于DNA的化 学修饰和酶学修饰，通过改变目 的基因的序列、启动子、增强子 等调控元件，实现目的基因的高
表达或抑制表达。
基因修饰技术应用
基因修饰技术在制药、生物治疗 、生物合成等领域具有广泛的应 用，例如用于生产重组蛋白药物
。
03
免疫反应
免疫反应是基因工程制药中另一个重要问题，可能导致免疫排斥或免疫
攻击。解决方案包括采用免疫沉默技术、降低免疫原性等。
伦理与法律问题
伦理问题
基因工程制药涉及人类基因改造，可能引发伦理争议，如人 类尊严、基因优劣等。解决方案需要遵循伦理原则，如尊重 人权、保护隐私等。
法律问题
基因工程制药涉及法律法规的制定和执行，可能存在法律空 白或法律冲突。解决方案需要完善相关法律法规，明确监管 职责和法律责任。
基因工程制药的发展历程
1970年代
基因工程的诞生，科学 家开始探索利用基因工
程技术生产药物。
1980年代
基因工程药物开始进入 临床试验阶段，如胰岛
基因工程制药ppt课件
一，酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)表达系统：
酿酒酵母(Saecharomycescerevisiae)在酿酒业和面 包业的使用已有数千年的历史，被认为是 GRAS(generally recognized as safe)生物，不产生 毒素，已被美国FDA确认为安全性生物，但酿酒 酵母难于高密度培养，分泌效率低，几乎不分泌 分子量大于30 kD的外源蛋白质，也不能使所表达 的外源蛋白质正确糖基化，而且表达蛋白质的C端 往往被截短。因此，一般不用酿酒酵母做重组蛋 白质表达的宿主菌
2018/10/23
二，甲醇营养型酵母表达系统：
甲醇酵母表达系 统是目前应用最广泛的酵母表达系统。目前甲醇酵母 主要有汉森酵母属(Hansenula)，毕赤酵母属(Pichia)， 球拟酵母属(Torulopsis)等，并以毕赤酵母属(Pichia) 应用最多。 甲醇酵母的表达载体为整合型质粒， 载体中含有与酵母染色体中同源的序列，因而比较容 易整合入酵母染色体中，大部分甲醇酵母的表达载体 中都含有甲醇酵母醇氧化酶基因—1(AOX1)，在该基因 的启动子(PAOX1)作用下，外源基因得以表达。甲醇 酵母一般先在含甘油的培养基中生长。培养至高浓度。 再以甲醇为碳源。诱导表达外源蛋白。
2018/10/23
一、原核表达系统
2018/10/23
在各种表达系统中，最早被采用进行研究的是大肠杆
菌表达系统，也是目前掌握最为成熟的表达系统，大 肠杆菌表达系统以其细胞繁殖快速产量高、IPTG诱导 表达相对简便等优点成为生产重组蛋白的最常用的系 统。
2018/10/23
于表达不同的蛋白，需要采用不同的载体。目前已知
的大肠杆菌的表达载体可分为非融合型表达载体和融 合型表达载体两种。非融合表达是将外源基因插到表 达载体强启动子和有效核糖体结合位点序列下游，以 外源基因mRNA的AUG为起始翻译，表达产物在序列 上与天然的目的蛋白一致。融合表达是将目的蛋白或 多肽与另一个蛋白质或多肽片段的DNA序列融合并在 菌体内表达。融合型表达的载体包括分泌表达载体、 带纯化标签的表达载体、表面呈现表达载体、带伴侣 的表达载体。
酿酒酵母(Saecharomycescerevisiae)在酿酒业和面 包业的使用已有数千年的历史，被认为是 GRAS(generally recognized as safe)生物，不产生 毒素，已被美国FDA确认为安全性生物，但酿酒 酵母难于高密度培养，分泌效率低，几乎不分泌 分子量大于30 kD的外源蛋白质，也不能使所表达 的外源蛋白质正确糖基化，而且表达蛋白质的C端 往往被截短。因此，一般不用酿酒酵母做重组蛋 白质表达的宿主菌
2018/10/23
二，甲醇营养型酵母表达系统：
甲醇酵母表达系 统是目前应用最广泛的酵母表达系统。目前甲醇酵母 主要有汉森酵母属(Hansenula)，毕赤酵母属(Pichia)， 球拟酵母属(Torulopsis)等，并以毕赤酵母属(Pichia) 应用最多。 甲醇酵母的表达载体为整合型质粒， 载体中含有与酵母染色体中同源的序列，因而比较容 易整合入酵母染色体中，大部分甲醇酵母的表达载体 中都含有甲醇酵母醇氧化酶基因—1(AOX1)，在该基因 的启动子(PAOX1)作用下，外源基因得以表达。甲醇 酵母一般先在含甘油的培养基中生长。培养至高浓度。 再以甲醇为碳源。诱导表达外源蛋白。
2018/10/23
一、原核表达系统
2018/10/23
在各种表达系统中，最早被采用进行研究的是大肠杆
菌表达系统，也是目前掌握最为成熟的表达系统，大 肠杆菌表达系统以其细胞繁殖快速产量高、IPTG诱导 表达相对简便等优点成为生产重组蛋白的最常用的系 统。
2018/10/23
于表达不同的蛋白，需要采用不同的载体。目前已知
的大肠杆菌的表达载体可分为非融合型表达载体和融 合型表达载体两种。非融合表达是将外源基因插到表 达载体强启动子和有效核糖体结合位点序列下游，以 外源基因mRNA的AUG为起始翻译，表达产物在序列 上与天然的目的蛋白一致。融合表达是将目的蛋白或 多肽与另一个蛋白质或多肽片段的DNA序列融合并在 菌体内表达。融合型表达的载体包括分泌表达载体、 带纯化标签的表达载体、表面呈现表达载体、带伴侣 的表达载体。
5.1基因工程制药PPT课件
• 2、下游阶段：将实验室成果产业化、商品化， 它主要包括工程菌大规模发酵最佳参数的确立， 新型生物反应器的研制，高效分离介质及装置的 开发，分离纯化的优第化14页控/共制71页，高纯度纯品的制备 技术，生物传感器等一系列仪器仪表的设计和制 造，电子计算机的优化控制等。上述（4）、 （5）、（6）、（7）、（8）等属于下游阶段。
第30页/共7表1页达用的酵母宿主菌应具备： ①菌体生长力强。 ②菌体内蛋白酶要较弱。 ③菌株性能稳定。 ④ 分泌能力强。
（四）动物细胞中的基因表达
哺乳动物细胞表达外源基因的主要优点 ——能识别和剪切外源基因中的内含子 并加工为成熟的mRNA。
❖中国仓鼠卵巢细胞（CHO） ❖猴肾细胞（COS）
CHO细胞属成纤维细胞，该细胞缺乏二氢叶酸还原 酶（DHFR），经转染第3可1页将/共7D1页HFR重组至细胞中， 含有DHFR表达载体的重组CHO细胞，经氨甲喋呤 （MTX）培养筛选后可选择出克隆表达异源基因的 重组细胞。
• 逆转录－（聚三合）酶反R应T-法P。C该R方法是mRNA经逆转录合成cDNA
第一链，不需再合成第二链，而是在特异引物的协助下，用 PCR法进行扩增，特异地合成目的cDNA链，用于重组，克隆。
第21页/共71页
二、基因表达
基因表达是指结构基因在生物体中的转录、 翻译以及所有加工过程。
基因表达研究是指外源基因在某种细胞中 的表达活动，即剪切下一个外源基因片断， 拼接到另一个基因表达体系中，使其能获得 既有原生物活性又可高产的表达产物。
常用的表达载体： （1）pBV220系统 （2）pET系统
第26页/共71页
2、影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素 （1）外源基因的拷贝数 （2）外源基因的表达效率 （①3）启表动达子产的物强的弱稳定性 （②4）核细糖胞体的结代合谢位负点荷 （③5）SD工序程列菌和的起培始养密条码件子ATG的间距
第30页/共7表1页达用的酵母宿主菌应具备： ①菌体生长力强。 ②菌体内蛋白酶要较弱。 ③菌株性能稳定。 ④ 分泌能力强。
（四）动物细胞中的基因表达
哺乳动物细胞表达外源基因的主要优点 ——能识别和剪切外源基因中的内含子 并加工为成熟的mRNA。
❖中国仓鼠卵巢细胞（CHO） ❖猴肾细胞（COS）
CHO细胞属成纤维细胞，该细胞缺乏二氢叶酸还原 酶（DHFR），经转染第3可1页将/共7D1页HFR重组至细胞中， 含有DHFR表达载体的重组CHO细胞，经氨甲喋呤 （MTX）培养筛选后可选择出克隆表达异源基因的 重组细胞。
• 逆转录－（聚三合）酶反R应T-法P。C该R方法是mRNA经逆转录合成cDNA
第一链，不需再合成第二链，而是在特异引物的协助下，用 PCR法进行扩增，特异地合成目的cDNA链，用于重组，克隆。
第21页/共71页
二、基因表达
基因表达是指结构基因在生物体中的转录、 翻译以及所有加工过程。
基因表达研究是指外源基因在某种细胞中 的表达活动，即剪切下一个外源基因片断， 拼接到另一个基因表达体系中，使其能获得 既有原生物活性又可高产的表达产物。
常用的表达载体： （1）pBV220系统 （2）pET系统
第26页/共71页
2、影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素 （1）外源基因的拷贝数 （2）外源基因的表达效率 （①3）启表动达子产的物强的弱稳定性 （②4）核细糖胞体的结代合谢位负点荷 （③5）SD工序程列菌和的起培始养密条码件子ATG的间距
基因工程制药2课件
（4）大肠杆菌中不存在翻译后的修饰系统，不能对 蛋白质产物进行糖基化. （5）大肠杆菌内的蛋白酶会对目的蛋白质造成破坏。 （6）大肠杆菌会产生内毒素，难以除去。
2、枯草芽孢杆菌
优点： （1）分泌能力很强，可以将蛋白质产物直接分 泌到培养液中。 （2）不会形成包含体。
缺点： （1）不能使蛋白质产物糖基化。 （2）枯草芽孢杆菌具有很强的胞外蛋白酶分泌 系统，常常对蛋白质产物造成破坏。
质粒pBV220的结构框：（图2－3）
ori-------复制起始点；
clts857-------抑制子基因，在31℃时，其基因产物 具有阻抑PL的活性，当温度升高时，这种阻抑活 性就丧失，PL就开始指导合成mRNA；
PR-------启动子1；PL--------启动子2； BglII、EcoRI、SmaI、BamHI、SalI、PstI、
缺点： （1）生产慢、 （2）生产率低、 （3）培养条件苛刻、费用高， （4）培养液浓度较稀。
二、大肠杆菌体系中的基因表达
（一）表达载体 （二）影响真核基因在大肠杆菌中表达的因素 （三）真核基因在大肠杆菌的中表达的形式
（一）表达载体
表达载体必须具备的条件：
（1）载体能独立地进行复制：分严紧型和松弛型，前 者在宿主细胞中拷贝数仅1~3个，后者在宿主细胞中 拷贝数可高达3000个。
表达载体必须具备的条件
（6）所产生的mRNA必须具有翻译的起始信 号，即起始密码AUG和SD序列（ShineDalgarno sequence），以便转录后能顺利翻译。
大肠杆菌表达载体的构成：
复制及选择系统 （载体）
转录系统
（目的基因）
蛋白质翻译系统 （目的蛋白）
23
外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理：
2、枯草芽孢杆菌
优点： （1）分泌能力很强，可以将蛋白质产物直接分 泌到培养液中。 （2）不会形成包含体。
缺点： （1）不能使蛋白质产物糖基化。 （2）枯草芽孢杆菌具有很强的胞外蛋白酶分泌 系统，常常对蛋白质产物造成破坏。
质粒pBV220的结构框：（图2－3）
ori-------复制起始点；
clts857-------抑制子基因，在31℃时，其基因产物 具有阻抑PL的活性，当温度升高时，这种阻抑活 性就丧失，PL就开始指导合成mRNA；
PR-------启动子1；PL--------启动子2； BglII、EcoRI、SmaI、BamHI、SalI、PstI、
缺点： （1）生产慢、 （2）生产率低、 （3）培养条件苛刻、费用高， （4）培养液浓度较稀。
二、大肠杆菌体系中的基因表达
（一）表达载体 （二）影响真核基因在大肠杆菌中表达的因素 （三）真核基因在大肠杆菌的中表达的形式
（一）表达载体
表达载体必须具备的条件：
（1）载体能独立地进行复制：分严紧型和松弛型，前 者在宿主细胞中拷贝数仅1~3个，后者在宿主细胞中 拷贝数可高达3000个。
表达载体必须具备的条件
（6）所产生的mRNA必须具有翻译的起始信 号，即起始密码AUG和SD序列（ShineDalgarno sequence），以便转录后能顺利翻译。
大肠杆菌表达载体的构成：
复制及选择系统 （载体）
转录系统
（目的基因）
蛋白质翻译系统 （目的蛋白）
23
外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理：
生物制药--基因工程制药--ppt课件可编辑全文
组建重组质粒 构建基因工程菌或细胞
前5个步骤是上游过程
培养工程菌
后4个步骤是下游过程
产物分离纯化
除菌过滤
半成品和成品鉴定
包装
基因工程制药
2.1 目的基因的获得
逆转录法
• 从真核细胞中提取产生该蛋白质的 mRNA 并纯化 （oligo-dT 亲和层析法）
• 借助于逆转录酶，以 mRNA 为模板，以 oligo-dT 为引物， 进行第一链 cDNA 的合成
• 酶解除去 mRNA 链； • 通常在合成 cDNA 第一链后直接 PCR 扩增，即“逆转录
－PCR法”
基因工程制药
2.1 目的基因的获得
逆转录法
基因工程制药
2.1 目的基因的获得
从基因组中直接分离
• 随机断裂法：将基因组 DNA 用内切酶切成多个片段，然 后将这些片段混合物随机重组入适当载体、转化、扩增， 再筛选出所需的基因片段
基因工程制药
2.2 基因载体的选择
质粒载体 —— pET-32a(+)
E. coli 中表达的优良载 体。
pET-32a(+) 具有 Ampr 抗性，酶切位点丰富。含 T7lac 启动子；含有 T7.Tag 和 His-Tag 融合标签，便于 检测和纯化目标蛋白。
基因工程制药
2.2 基因载体的选择
Escherichia coli Rye13
Hae III G GCC
Haemophilus aegyptius
Hind III A AGCTT
Haemophilus influenzae
Hpa I GTT AAC（平末端）
Haemophilus parainfluenzae
基因工程制药PPT培训课件
基因工程制 药医学课件
四种碱基互补配对原则 生命的信息全部存储在DNA列里。
发现者沃森和克里克获得了 诺贝尔奖。
真正的背后英雄 不应被遗忘，她 是富兰克林。
感 受 造 化 的 神 奇
第二步：了解基因工程制药的基本过程
放大培养 摇瓶培养
倒入离心管 或离心瓶
放入离心机
离心效果
细胞破碎
超声破碎
生化培养箱
实验室常见的人体细胞
实验室常见的微生物
高压匀浆破碎
胀破
分离纯化
亲和色谱
盐析 透析
凝ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ色谱
分离纯化
电泳槽加样
电泳
电泳结果
凝胶电泳分离
第三步：熟悉部分相关过程实体设备 和操作对象
分离纯化实体设备
色谱分离设备
透析设备
磁力搅拌器
透析效果示例
凝胶电泳设备
空白凝胶
电泳后凝胶
处理后谱图效果
其它实验室常用设备
超纯水设备
通风设备
移液枪 精密电子天平
四种碱基互补配对原则 生命的信息全部存储在DNA列里。
发现者沃森和克里克获得了 诺贝尔奖。
真正的背后英雄 不应被遗忘，她 是富兰克林。
感 受 造 化 的 神 奇
第二步：了解基因工程制药的基本过程
放大培养 摇瓶培养
倒入离心管 或离心瓶
放入离心机
离心效果
细胞破碎
超声破碎
生化培养箱
实验室常见的人体细胞
实验室常见的微生物
高压匀浆破碎
胀破
分离纯化
亲和色谱
盐析 透析
凝ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ色谱
分离纯化
电泳槽加样
电泳
电泳结果
凝胶电泳分离
第三步：熟悉部分相关过程实体设备 和操作对象
分离纯化实体设备
色谱分离设备
透析设备
磁力搅拌器
透析效果示例
凝胶电泳设备
空白凝胶
电泳后凝胶
处理后谱图效果
其它实验室常用设备
超纯水设备
通风设备
移液枪 精密电子天平
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医学PPT
21
一、反转录法
反转录法就是先分离纯化目的基因的 mRNA，再反转录成 cDNA，然后进行 cDNA 的 克隆表达。
cDNA与模板mRNA序列严格互补，而不含内 含子。
cDNA:真核基因经过转录后,经过剪切、拼 接、修饰形成的成熟的mRNA，mRNA反转录的 结果为cDNA。
医学PPT
22
第一个合成蛋白质的国家。
医学PPT
10
基因工程药物种类
基因工程技术可生产的药物和制剂包括: (1)免疫性蛋白,如各种抗原和单克隆抗体; (2)细胞因子,如各种干扰素,白细胞介素,集
落刺激生长因子,表皮生长因子,凝血因子; (3)激素,如胰岛素,生长激素,心素纳; (4)酶类,如尿激酶,链激酶,葡激酶,组织型纤
50%!
医学PPT
8
20世纪70年代基因工程诞生最先应 用在医药科学领域。
1982年第一个基因工程产品--人胰 岛素在美国问世。
优点:大量生产、应用临床、深入研 究、扩大应用。
医学PPT
9
结晶牛胰岛素：1965年9月17日，中国首次人 工合成结晶牛胰岛素。这是当时人工合成的具有 生物活力的最大的天然有机化合物，使中国成为
维蛋白溶酶原激活剂,超氧化物歧化酶.
医学PPT
11
基因工程药物：采用基因工程技术研制的， 能预防和治疗某种疾病但含量极微而难以 用传统方法制取的特殊药物。
医学PPT
12
第二节 基因工程药物生产的基本过程
基因工程技术是将重组对象的目的 基因插入载体，拼接后转入新的宿主细 胞，构建成工程菌(或细胞），实现遗 传物质的重新组合，并使目的基因在工 程菌内进行复制和表达的技术。
除菌过滤
半成品检定
成品检定
包装
医学PPT
16
基因工程药物生产的上游和下游
上游：主要指的是目的基因分离、工程菌 （或细胞）构建。上游阶段的工作主要在 实验室内完成； 下游：主要指的是从工程菌（或细胞）的大 规模培养一直到产品的分离纯化、质量控 制等。
医学PPT
17ห้องสมุดไป่ตู้
工程菌（或细胞）构建中重要的工具
该过程中重要的工具便是酶：限制性内切 酶和连接酶是将所需目的基因插入适当的载体 质粒或噬菌体中并转入大肠杆菌或其他宿主菌 （细胞）大量复制目的基因过程中的重要工具。
第二章 基因工程制药
医学PPT
1
主要内容： ➢ 基因工程制药的基本过程。 ➢ 目的基因的获得及基因的表达。 ➢ 基因工程菌的生长代谢特点，其质粒不稳定
产生的原因及提高质粒稳定性的方法。 ➢ 基因工程菌的培养方式，发酵工艺及培养设
备。 ➢ 基因工程药物的分离纯化。 ➢ 基因工程药物的质量控制。
医学PPT
医学PPT
20
工程菌（或细胞）构建中重要的工具酶
➢ 大肠杆菌DNA聚合酶I：5’—3’DNA聚合酶活 性。
➢ 逆转录酶：转录RNA为DNA的酶。
➢ 核酸酶S1：能降解单链DNA和RNA ，打开cDNA 双链的发卡结构。
➢ T4DNA连接酶：连接3’ 羟基 5’磷酸游离端。
➢ 末端脱氧核苷酰转移酶：催化一个单核苷酸转 移到一个DNA分子的3’羟基末端。
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⒊cDNA第二链的合成
除去杂交链中的mRNA链，然后以cDNA第 一链为模板合成第二链。
⒋cDNA的克隆 将cDNA与载体连接（质粒DNA,噬菌体
DNA ）
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人工接头:人工合成的，连接在目的基因两端的含有 某些限制性酶切为点的寡核苷酸片断。
⒌将重组体导入宿主细胞 噬菌体感染大肠杆菌，质粒转化大肠杆菌。
有DNA在体外反转录成cDNA，与适当的载体 常用噬菌体或质粒载体连接后转化受体菌， 则每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖扩增， 这样包含着细胞全部mRNA信息的c目的基 因要进行限制性内切酶和核苷酸序列分析。
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第三节 目的基因的获得
难点： ➢ 真核生物的单拷贝基因在整个基因中很小
部分； ➢ DNA很大，组建物理图谱和基因定位很难； ➢ 真核生物基因含内含子是断裂基因，它在
原核生物中不表达。
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克隆真核基因常用方法：反转录法， 反转录-聚合酶链反应法，化学合成法， 筛选基因和对已经发现的基因进行改造。
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基因工程基本过程
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基因工程药物制药的主要程序: ⒈目的基因的克隆， ⒉构建DAN重组体， ⒊构建工程菌， ⒋目的基因的表达， ⒌表达产物的分离纯化， ⒍产品的检验等。
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基因工程药物制药的主要程序
获得目的基因 组建重组质粒 构建工程菌（或细胞）
培养工程菌
产物分离纯化
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第一节 概 述
传统生物药物由于来源及制备上的困难、 价格等因素的影响，此外在制备过程可能 受到的病毒、衣原体、支原体等的感染等 问题，促使人们寻求安全、实用、疗效可 靠的新方法来制备生物药物。
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人体来源：人血浆中制备人血浆白蛋白； 男性尿中制备尿激酶；孕妇尿中制备绒膜促性 激素；人血白细胞中制备白细胞介素等。
动物来源：猪胰脏中制备胰岛素；新鲜猪 血中制备SOD；健康猪、牛肝制备核糖核酸 等。
植物来源：新鲜茶叶制备SOD；麸皮中制 备植物钙镁与肌醇；玉米胚芽油中制备植物不 饱和脂肪酸等。
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玉米胚芽
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麸皮
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生物技术的核心就是基因工程，基因 工程技术最成功的应用就是用于生物治 疗的新型生物药物的研制。
cDNA克隆示意图
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⒈mRNA的纯化 mRNA的特点:3‘末端含有一多聚腺苷酸组成的
末端。方法:亲和层析法
➢ 选材：mRNA丰富，目的基因表达活跃
➢ 注意点：防止RNA酶污染 ⒉cDNA第一链的合成 一般 mRNA都带有3‘-polyA,所以可以用寡聚
dT作为引物,在逆转录酶的催化下,开始cDNA链的 合成。用放射性探针法检测。
基因工程正在逐渐显示其在生物技术药 物制备上的优势。
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胰岛素是治疗糖尿病的特效药， 长期以来只能依靠从猪、牛等动物的 胰腺中提取，100Kg胰腺只能提取4-5g 的胰岛素，其产量之低和价格之高可 想而知。
将合成的胰岛素基因导 入大肠杆菌，每2000L培养液 就能产生100g胰岛素！大规 模工业化生产不但解决了这 种比黄金还贵的药品产量问 题，还使其价格降低了30%-