HIV-1P24抗原
HIV-1抗原检测技术规范
HIV-1抗原检测技术规范1 范围本章规定了HIV-1P24抗原检测的方法和用途。
适用于对人血液标本和病毒培养上清液中HIV-1P24抗原的检测。
2 规范性引用文件NIAID，Virology Manual for HIV Laboratory, NIH Publication,No.97-3828, Jan 19973 HIV－1P24抗原检测的意义3.1 HIV-1感染窗口期、HIV抗体不确定或HIV-1阳性母亲所生婴儿的鉴别诊断。
3.2 第四代HIV检测试剂的阳性结果的辅助诊断。
3.3 监测病程进展或抗病毒治疗效果。
3.4 HIV分离培养，病毒复制状况的监测。
4 实验室要求同HIV抗体检测。
5 检测方法及程序5.1 试剂：抗体夹心ELISA方法，应使用经国家药品监督管理局批准注册的试剂。
5.2 样品：血清、血浆或病毒培养上清液。
5.3 定性检测5.3.1 筛选试验按照试剂盒说明书提供的标准判断有反应或无反应。
5.3.2 确证试验是P24抗原的中和试验，用于排除筛选试验的假阳性。
待检样品先与中和剂（P24 抗原的抗体）共同孵育，如果样品中存在P24抗原，中和抗体将与之结合形成复合物，而不能与固相载体上的捕获抗体结合。
然后，用这样处理过的样品重复筛选实验的步骤，同时做一孔未中和的原始样品对照，将中和与未中和孔的OD值进行比较，如果中和孔的OD 值下降50 % 以上，认为样品中的P24 抗原是真正的阳性；如果中和孔没有出现OD值的下降，认为P24抗原的反应性可能是假阳性，需要做RNA检测或随访做进一步确证。
5.4 定量检测将 P24抗原的标准物质稀释成包含0.0和125pg/ml 二个浓度在内的六个不同浓度的系列标准，进行检测。
以横坐标为P24抗原的浓度（pg/ml ），纵坐标为OD值，绘制出标准曲线。
测出未知标本的OD值以后，在标准曲线上查出抗原的浓度。
如果未知标本的OD值超出标准曲线上最高抗原浓度的OD值，则需用正常人血清将标本稀释以后再行检测。
HIV_1 p24单链抗体的构建及其噬菌体文库筛选
文章编号:1007-4287(2006)04-0385-04HIV21p24单链抗体的构建及其噬菌体文库筛选王 波1,王贤俊2,温志国3(1.大连市第六人民医院检验科,辽宁大连116001;21温州维日康生物技术研发中心;3.内蒙古包头医学院附属三院)摘要:目的 通过噬菌体展示技术构建HIV21p24单链抗体库,从中筛选出高亲和力的抗体基因,为进一步单链抗体表达打下基础。
方法 从HIV患者的血清中提取mRNA,RTP2CR扩增出HIV21p24基因,扩增的产物用ClaⅠ和BstxⅠ双酶切消化后,连接到同样双酶切的p IRES1表达质粒,把构建的重组p IRES1-p24质粒免疫Balb/c小鼠。
1个月后,取鼠脾细胞mRNA构建出单链抗体(ScFv)cDNA文库。
该文库以噬菌粒pCAN TAB5E cDNA为载体,转化大肠杆菌TG1,最后用p24蛋白对表达的重组噬菌体单链抗体文库进行筛选。
结果 经过4轮吸附2洗脱2富集筛选,洗脱噬菌体滴度大于1010pfu/ml,EL ISA及其测序表明获取了表达抗HIV1p24单链抗体的基因。
结论 单链抗体和噬菌体展示技术成功的应用简化了获取特异性的单链抗体基因程序。
关键词:人类免疫缺陷病毒;p24;单链抗体中图分类号:R392111文献标识码:AConstruction and selection from a peptide phage display library of the single2chain Anti2HIV21P24 W A N G Bo,W A N G Xian2jun,W EN Zhi-guo.(The S ixth People’s Hospital of Dalian Clinical L aboratory,Dalian116001,China) Abstract:Objective cDNA library of anti2HIV1p24Single Chain Fragment of Variable Region(ScFv)was construct by phage display technology in order to express the ScFv in the future.Methods The template of mRNA was extracted from serum of patients,subsequently the gene of HIV21p24was amplied by RT2PCR.The amplied product was digested by ClaⅠand BstxⅠ,then the digested product was transfered into p IRES1express vector digested by the same two enzymes.The re2 combinant plasmid immuned Balb/c mice,after one month,ScFv cDNA librar y was constructed from the s pleen cell mRNA of mice.ScFv cDNA library of pCAN TAB5E plasmid carrier was transformed into E.coli TG1that of secretin g specific anti2 HIV1p24ScFv was obtained by p24protein affinity selection.R esults After four times absorb2wash2enrich selection,2×1010phage form unit(pfu)/ml was got.Both EL ISA and sequenced measures proved to succeed in secreting specific anti2 HIV1p24ScFv gene.Conclusion ScFv and phage display technologies successly applied that simplied the acquiring proce2 dure of specific ScFv gene.K ey w ords:HIV;p24;ScFv(Chin J L ab Diagn,2006,10:385) 目前对HIV21感染的筛查,以检测血中的抗体为主,但是HIV21病毒感染机体4～6周前抗体检测为阴性,此时患者体内病毒已存在。
人类免疫缺陷病毒1型p24抗原(HIV-1P24)ELISA检测试剂盒简介
人类免疫缺陷病毒1型p24抗原(HIV-1P24)ELISA检测试剂盒简介人类免疫缺陷病毒1型p24抗原(HIV1P24)ELISA检测试剂盒说明书检测原理试剂盒采用双抗一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。
往预先包被免疫缺陷病毒1型p24抗体的包被微孔中，依次加入标本、HRP标记的检测抗原，经过温育并彻di洗涤。
用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD 值），与CUT OFF值相比较，从而判定标本中人类免疫缺陷病毒1型p24抗原（HIV1 P24）的存在与否。
样品收集、处理及保存方法1. 血清：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，收集血液后，3000转离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。
2. 血浆：EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。
3000转离心30分钟取上清。
3. 细胞上清液：3000转离心10分钟去除颗粒和聚合物。
4. 组织匀浆：将组织加入适量生理盐水捣碎。
3000转离心10分钟取上清。
5. 保存：如果样本收集后不及时检测，请按一次用量分装，冻存于20℃，避免反复冻融，在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。
自备物品1. 酶标仪（450nm）2. 高精度加样器及枪头：0.510uL、220uL、20200uL、2001000uL3. 37℃恒温箱操作注意事项试剂盒保存在28℃，使用前室温平衡20分钟。
从冰箱取出的浓缩洗涤液会有结晶，这属于正常现象，水浴加热使结晶wan全溶解后再使用。
实验中不用的板条应立即放回自封袋中，密封（低温干燥）保存。
预处理后的样本请按照操作步骤用样本稀释液适当稀释以达到试剂盒的的最佳检测效果。
严格按照说明书中标明的时间、加液量及顺序进行温育操作。
所有液体组分使用前充分摇匀。
试剂盒组成名称 96孔配置 48孔配置备注微孔酶标板 12孔×8条 12孔×4条无阴性对照 0.5mL 0.5mL 无阳性对照 0.5mL 0.5mL 无检测抗原HRP 10mL 5mL 无20×洗涤缓冲液 25mL 15mL 按说明书进行稀释样本稀释液 6mL 3mL 无底物A 6mL 3mL 无底物B 6mL 3mL 无终止液 6mL 3mL 无封板膜 2张 2张无说明书 1份 1份无自封袋 1个 1个无试剂的准备20×洗涤缓冲液的稀释：蒸馏水按1：20稀释，即1份的20×洗涤缓冲液加19份的蒸馏水。
免疫PCR检测HIV-1 p24的实验研究
ｂ ｎ ｉ ｏ ｉｓ ｗａ ｅ ｅ ｔ ｄ ｂ ｍｐ ｉｙｎ ｈ ｅ ｏ ｔ ｒＤＮＡ ｓｎ ＣＲ． Ａｎ ｈ ｎ ｔ ｅ ｄ ｔ ｃ ｉ ｎ ｃ ｎ ｉ ｏ ｓ ｗｅ ｅ ｏ ｔ ｚ ｄ ａ ｄ ｔ ｅ ｙ ａ ｔｂ ｄ ｅ ｓ ｄ ｔ ｃ ｅ ｙ ａ ｌ ｉ ｇ ｔ ｅ ｒ ｐ ｒｅ ｆ ｕ ｉｇ Ｐ ｄ ｔｅ ｈ ｅｅ ｔ ｏ ｄｔ ｎ ｒ ｐ ｉ ｅ ｎ ｈ ｏ ｉ ｍｉ ｓ ｎ ｉ ｖ ｔ ｓ ａ ｌｚ ｄ ｅ ｓ ｔ ｉｙ ｗａ ｎ ｙ ｅ ．Ｒｅｕ ｔ Ｔｏ ｒ ｄ ｃ ｈ ｆｅ ｔｏ ｏ ｓ ｅ ｉ ｃ ａ ｌ ｉａ ｉ ｎ ｔ ｅ ｏ ｔ ｌｃ ｎ ｅ ｔａ ｉ ｎ ｏ ｔ ｅ ｔ ｖ ｄ ｎ ａ ｄ ｉ ｓｌ ｓ ｅ ｕ ｅ ｔ ｅ ｅ ｆ ｃ ｆｎ ｎ ｐ ｃ ｆ ｍｐ ｉ ｃ ｔ ， ｈ ｐ ｉ ｏ ｃ ｎ ｒ ｔ ｆｓ ｒ ｐ ａ ｉ ｉ ｎ ｉ ｆ ｏ ｍａ ｏ
P24在HIV感染者和艾滋病患者检测中的应用
P24在HIV感染者和艾滋病患者检测中的应用作者：乔金丽来源：《云南中医中药杂志》2011年第10期关键词：艾滋病；P24抗原；窗口期；免疫复合物中图分类号：R512.91文献标识码：A文章编号：1007-2349（2011）10-0028-03获得性免疫缺陷综合征（Acquired ImmunoDeficiency Syndrome）简称艾滋病（AIDS），是由人类免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus，HIV）感染机体所引起的一种严重的传染性疾病。
目前该疾病已从在高危人群传播逐步转化为在一般人群传播，因此艾滋病的预防与控制成为医务和研究工作的重要部分。
对HIV感染的检测方法包括抗体检测、P24抗原检测、核酸检测以及CD4+T淋巴细胞水平检测等［1］。
机体感染HIV后，P24抗原是较早能从血清中检出的病原学标志，感染后约2～3周即可检出，1～2个月左右进入抗原高峰，然后随着机体抗体的逐渐产生，由于抗体的中和作用，形成抗原抗体复合物，而游离性抗原很少，甚至会低于监测水平，机体进入无症状感染期。
疾病后期，随着病毒的复制增强，免疫系统逐渐破坏，P24抗原水平会再次提高作为HIV活动性感染的标志。
而HIV抗体的检测存在一个窗口期，一般平均为2～3个月，但95%以上HIV-1感染者产生抗体的时间是在感染后6个月以内［2］。
P24抗原在血清抗体阳转前2 d～18 d即可检测到，因此HIV-1 P24抗原检测可作为HIV抗体检测窗口期的辅助诊断［3］，也可检测疾病进展、进行药物疗效评估等。
1 P24的组成特点P24抗原是HIV的主要结构蛋白，在病毒的包装和成熟过程中起重要作用，缺失P24病毒将无法正常组装。
HIV在病毒“大家族”中的定位是逆转录病毒科慢病毒属中的人类免疫缺陷病毒组，为球形颗粒，直径约100~120 nm。
典型的HIV-1由核心和包膜两部分组成，核心包括两条正股RNA链、核心结构蛋白和病毒复制所必须的酶类，病毒复制所必须的酶类包括逆转录酶（P51，P66）、整合酶（P32）和蛋白酶（P11）。
HIV-1 P24抗原检测方法研究进展
HIV-1 P24抗原检测方法研究进展关键词：HIV-1 P24抗原；酶免疫测定法；检测方法今年是世界艾滋病流行以来的第33个年头,全球艾滋病流行与防治形势都发生了巨大的变化。
自上世纪九十年代中期高效联合抗逆转录病毒治疗（highly active antiretroviral therapy,HAART）技术应用以来,成千上万的艾滋病病人得到有效治疗。
然而，由于HIV本身的高变异率，导致临床上尚无有效的根除HIV的治疗方法。
因此，对艾滋病的防控手段仍以预防为主。
目前，对HIV感染的检测方法包括抗体检测、P24抗原检测、核酸检测以及CD4+T淋巴细胞水平检测等。
由于从感染HIV到出现可检测的抗体尚有一段时间，因此虽然抗-HIV检测的ELISA 试剂经历了4代发展[1]，但其“窗口期”问题仍不可避免；而可以进一步缩短“窗口期”问题的核酸检测和CD4+T淋巴细胞水平检测，由于其检测过程较复杂、耗时较长且需要特殊仪器而不易普及。
HIV-1侵入人体后，核心抗原P24的水平随着病毒RNA水平的发展而发展，并在急性感染期即可出现，通常被认为是病毒复制的间接标志，与病情发展密切相关。
因此，血液及其他体液标本中P24抗原的检测可以缩短窗口期，有助于HIV-1的早期诊断、预后判断及评价抗病毒治疗的效果，具有良好的实际应用价值。
1 P24抗原的生物学特性HIV属于逆转录病毒科慢病毒属中的人类慢病毒组，为直径约100-120nm的球形颗粒，由核心和包膜两部分组成。
核心包括两条单股RNA 链、核心结构蛋白和病毒复制所必须的酶类，包括逆转录酶（RT,P51/P66），整合酶（INT,P32）和蛋白酶（PI，P10）.核心外面为病毒衣壳蛋白（P24，P17）.病毒的最外层为包膜，其中嵌有gp120(外膜糖蛋白)和gp41(跨膜糖蛋白)两种糖蛋白。
HIV基因全长约9.8kbp,含有3个结构基因（gag,pol和env）、2个调节基因（tat反式激活因子、rev毒粒蛋白表达调节因子）和4个辅助基因（nef负调控因子、vpr 病毒r蛋白、vpu病毒u蛋白和vif毒粒感染性因子）。
HIV-1 p24和SIV p27两种ELISA试剂盒检测SIV p27抗原的比较
ｐ７Ｅ ＩＡ试 剂 盒 定 性 检 测 病 毒 液 和 血 浆 中 ＳＶ ｐ ７抗 原 ， 只能 定 量 检 测 病 毒 液 中 ＳＶ ｐ ７抗 原 。 ２ ＬＳ Ｉ ２ 但 Ｉ ２
【 关键 词 】 Ｈ Ｖ １ｐ４ ＳＶ ｐ７ Ｉ 一 ２ ；Ｉ ２
【 中图分类号】Ｒ ３ ３
【 文献标识码 】Ａ
Ａｎ ｍａ ｃｉｎ ｅ，Ｃｈｎｅ ｅ Ａｃ ｄ ｍｙ ｏ ｅ ｃ ｌＳ ｉｎ ｅ ｉ ｌＳ ｅ ｃ ｉ ｓ ａ ｅ ｆＭ ｄｉａ ｃｅ ｃ ｓ；Ｋｅ ｂｏ ａｏ ｆＨｕｍａ ｓ ａ ｅ ｙ Ｌａ ｒ ｔｒ ｏ ｙ ｎ Ｄｉｅ ｓ ｓＡｎｉ ｌＭ ｏ ｅｓ， ｍａ ｄｌ
２ １ 年 ２月 ０１
中国 比较 医学 杂 志
ＣＨＩ ＮＥＳ ＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＣＯＭＰ ＥＪ ＡＲＡＴＩ ＶＥ ＭＥＤＩ ＮＥ ＣＩ
Ｆｂｕｒ ｅ ｒ ａｙ，２ １ ０１ Ｖ０ ． Ｎｏ ２ １ ２ｌ ．
第２ 卷 ｌ
第 ２期
、
；
传 染病 专题
石 ＼ 写
Ｈ Ｖ １ｐ４和 ＳＶ ｐ７两种 Ｅ ＩＡ试 剂 盒 检测 Ｉ一 ２ Ｉ ２ ＬＳ ＳＶ ｐ７抗 原 的 比较 Ｉ ２
金 光 ， 王 卫 ， 丛 枯 ， 蒋 虹 ， 陈 霆 ， 魏 强
（ 国 医学 科 学 院 医学 实 验 动 物 研 究 所 ， 生 部 人 类 疾 病 比较 医学 重 点 实 验 室 中 卫 国家 中医 药 管 理 局 人 类 疾 病 动 物模 型 三 级 实 验 室 ， 京 １０ ２ ） 北 ００ １
【 摘要 】 目的 由于检测 ＳＶ ｐ ７抗原试剂盒来源 困难 ， 时不稳定 ， 于 Ｈ Ｖ １ｐ４与 ＳＶ ２ Ｉ ２ 有 鉴 Ｉ一 ２ Ｉ ｐ７有 较强 的交
HIV-1 P24抗原检测的应用范围
HIV-1 P24抗原来源: 日期：2011-3-28(共有 0 条评论) 我要评论由于检测HIV-1 p24抗原是检测HIV-1病毒的蛋白质组分，而且不受基因型的限制，拓宽了HIV-1基因型的检测范围，可缩短窗口期，提早发现病毒感染，同时还可用于抗病毒药物治疗效果的监测以及新生儿HIV感染的诊断，其具体内容如下。
1．拓宽HIV基因亚型的检测由于HIV-1逆转录酶(RT)缺乏校正功能，HIV-1的高速复制和基因重组导致大量HIV-1变异株的出现。
根据病毒的基因可变性，HIV 分为两种类型——HIV-1和HIV-2。
HIV-1包括M群(主要)、N群(非M非O)和O群(局外的)。
全世界绝大多数的HIV感染者为HIV-1 M 组，M组包括A～D和F～H、J和K亚型以及循环重组形式(CRFO1～34)。
HIV-10群主要在非洲中西部流行，而N群在喀麦隆被发现，HIV-2主要在西非流行(Brennan et a1．，1997)。
HIV包膜蛋白、gpl20、gp41或它们的前体蛋白gpl60拥有最大程度的基因变异，而HIV抗体检测主要是检测包膜蛋白的抗体，为了能够检测所有的已经存在的和已经出现的。
HIV变异株，HIV抗体检测一直具有极大的挑战性。
然而HIV p24抗原在不同的HIV类型和群中是最保守的蛋白质，因此，检测p24可以更广泛地进行HIV基因型的检测。
举例来说，针对HIV-2和HIV-1的O群，HIV-1编码p24抗原的gag区显示的同源性为6O％和70％，所以运用精心挑选的HIV-1核心蛋白的抗体的检测也能够通过交叉反应检测HIV-1的O 群和HIV-2的核心抗原。
2．缩短窗口期，从而为血源筛查和临床诊断提供早期检测在血清中，HIV感染者的病毒学和血清学指标出现的先后顺序为病毒RNA、p24抗原及抗HIV抗体(Busch，1997)。
接触HIV后的1~2周是传染性病毒血症期，在此期间病毒在区域淋巴组织中进行复制，然后才传播到外周血中。
HIV-1p24抗原抗体检测试剂盒研制重大进展
ｖ ａｉｔ Ｊ ． ｍ ｎＨｅｌ ，９ ９．８ ４）９ ｉ ｂｌｙ［ ］Ｗｏ ｅ ａｔ １９ ２ （ ：３—１３ ｖ ｉ ｈ １． ４ 蒋 国梁． 现代 肿瘤 放 射治 疗学 ［ ． 海 ： 海科 学技 术 出版社 ， Ｍ 上 上
２ ０ ５ ２． ０ ３： ４
率降至 ５ ％ 一 ０ 。因此 ， ０ ７％ 早期发现乳 腺癌 ， 不但 可提 高治愈
短甚至不哺乳 ， 这也是该人群发病率 高的原因之～。 综上所述 ， 我国女性乳腺健 康状况令 人担忧 ， 乳腺 疾病 的 早期诊断 是及时治疗 的基础 ， 了加强 键康教 育、 除 提倡母乳 喂
养 、 及 乳 腺 自检 的 方 法 等 ， 适 龄 人 群 尽 量 做 到 每 年 进 行 １ 普 对 次乳房检查 ， 特别 是 钼 靶 ｘ线 片 的 应用 ， 成 为 乳 腺 癌 早 期 诊 已
社 ，０ ２ ７ ２０ ：．
盖率 ＞ ０ ， ７ ％ 临床 诊断 ８ ％为 Ｉ ０ 期乳 腺癌 ， 死亡 率 明显 下 降。 我 国由于未 开 展 规 范 的 乳 腺 癌 筛 查 ， Ｉ 诊 断 Ｉ期 乳 腺 癌 临床
仅 ２ ％。 ０ 本 研 究 同 时 发 现 ， 腺 疾 病 的 发 病 与 职 业 密 切 相 关 Ｊ 大 乳 ，
率 ， 且 可 以做 “ 乳 ” 术 ， 后 各 种 辅 助 治 疗 也 相 对 减 少 ， 而 保 手 术
不仅 可节省医疗 费用 ， 而且可获得较 高生 活质量。在乳腺癌高
发的西方国家 ， ７ 从 ０年代 起 开 展乳 腺 癌 筛 查 ， 目前 乳 腺 普 查 覆
５ 黎 国屏 ， 松 鹤 ． 用 临 床 乳 腺 病 学 ［ ． 京 ： 国 医 药 科 技 出版 王 实 Ｍ］ 北 中
艾滋病检测
筛查试验呈阴性反应可出具HIV1/2抗体阴性报告，见于未被HIV感染的个体，但处于窗口期的新近感染者筛查试验也可呈阴性反应。若呈阳性反应，应用原有试剂和另外一种不同原理或不同厂家的试剂进行重复检测，或另外两种不同原理或不同厂家的试剂进行重复检测，如两种试剂复测均呈阴性反应，则为HIV抗体阴性;如有一种或两种试剂呈阳性反应，需进行HIV抗体确证试验。确证试验无HIV特异性条带产生，报告HIV1/2抗体阴性。确证试验出现HIV1/2抗体特异带，但不足以判定阳性，报告HIV1/2抗体不确定，可在4周后随访。如带型没有进展或呈阴性反应，则报告阴性;如随访期间发生带型进展，符合HIV抗体阳性判定标准则为HIV抗体阳性，如带型仍不满足阳性标准，继续随访到8周。如带型没有进展或呈阴性反应则报告阴性;满足HIV阳性诊断标准则报告阳性，不满足阳性标准可视情况决定是否继续随访。经确证试验HIV1/2抗体阳性者，出具HIV1/2抗体阳性确认报告，并按规定做好咨询、保密和报告工作。
HIV-1_p24抗原ELISA检测试剂盒说明书
HIV-1 p24抗原ELISA检测试剂盒说明书本试剂盒采用夹心法原理检测人血清/血浆、培养物上清中的HIV-1 p24抗原，预先采用p24单克隆抗体包被固相微孔板。
若样本中含有HIV-1 p24抗原，则与包被板结合，再加入生物素（Biotin，Btn）标记p24多克隆抗体，反应后再加入辣根过氧化物酶标记的亲和素（SA-HRP），结合形成夹心复合物，洗涤除去未结合的酶标记物，加入HRP底物液，读数测量，根据临界值判断样本中是否含有HIV-1 p24抗原。
[试剂组分]1.包被板：包被有抗HIV -1 p24抗体的96孔酶标板， 2～8℃保存。
2.阴性对照：1.0mL/瓶；含正常人血清，防腐剂和色素，2～8℃保存。
3.P24抗原阳性对照：1.0mL/瓶×1瓶；含基因工程P24抗原的人血清，防腐剂和色素，2～8℃保存。
4.结合物1：含有生物素标记的P24多克隆抗体（Btn-P24抗体）5.结合物2：含有辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素（SA-HRP）6.底物液A：7.底物液B：8.终止液：9.浓缩洗涤液：10.封板膜：11.说明书：1份。
[操作程序]1．实验设计：将包被板从密封袋中取出，根据所需数量在板架上放好微孔板条。
设空白对照一孔，阴性对照两孔，P24抗原阳性对照2孔，HIV抗体阳性对照2孔。
2．加结合物1：每孔加入结合物1 25μL。
3．加样：依次加入样品、阴性对照、P24抗原阳性对照75μL。
4．温育：用微量震荡器充分振荡混匀，用封板膜封盖反应板，37℃温育60分钟；5．洗板：撕去封板膜，吸干微孔板中所有液体，每孔加入稀释好的洗涤液400μL，浸泡至少30秒，吸干。
如此洗板5次，最后在干净的吸水纸上拍干。
6．加酶：空白孔除外，每孔加入结合物2 100μL。
7．温育：用新的封板膜封盖反应板，37℃温育30分钟。
8．洗板：撕去封板膜，如上述洗板方法洗涤5次，最后在干净的吸水纸上拍干。
9．加底物液：每孔加入底物液A 50μL，底物液B 50μL，用微量震荡器充分振荡混匀，37℃避光温育15分钟。
HIV-1p24抗原不同位区的抗体应答.
HIV-1 p24抗原不同位区的抗体应答HIV-1病毒编码3种结构蛋白，即核心区（gag区）、包膜区（env）及酶区（pol）。
在病毒感染机体后，体内的免疫系统对不同的编码蛋白产生应答，目前研究较多的为抗体应答〔1〕。
研究HIV-1核心区蛋白的抗体应答，对了解分析核心区的免疫原性及选择优势抗原位区等基础研究，及在抗体检测试剂中优选抗原均有重要的作用。
我们利用HIV-1 p24抗体阳性者血浆对HIV-1p24单克隆抗体与抗原结合的抑制，了解自然感染状态下的机体对核心区p24抗原的抗体应答，为HIV-1病毒蛋白的基础研究奠定了基础。
材料与方法小鼠抗HIV-1 p24单克隆抗体：基因工程HIV-1 p24抗原免疫制备的单克隆抗体9株；病毒免疫制备的单克隆抗体2株（2-3、2E4）。
HIV-1感染者血浆：64份HIV-1感染者血浆，分别购自河南、成都等地，经抗HIV ELISA筛查，并以抗HIV p24免疫印迹法确证。
实验方法：固相抗原的间接竞争抑制法，主要步骤如下：（1）基因工程HIV-1 p24抗原固相；（2）50μl适当稀释的单抗腹水，50μl HIV-1感染者血浆，37℃ 1h；（3）2000倍稀释的羊抗鼠HRP结合物，37℃ 30min；（4）OPD显色，测定A492。
正常人血浆作抑制阴性对照，以HIV-1抗体阳性血浆A/正常人血浆对照A≤0.5判为抑制阳性。
结果与讨论1.HIV抗体阳性血浆对11株单抗的抑制：表1所示为64份HIV-1抗体阳性血浆分别抑制11株单抗与抗原结合的结果。
由表1可见，对单抗2C7的抑制血浆样品数最多为63/64（98.4%）；对6G11、3H10、2及10也分别达到60%以上；对2-3单抗抑制的血浆数最少为17/64。
2.HIV抗体阳性血浆对不同单抗的抑制：表2所示为64份HIV抗体阳性血浆抑制不同单抗的结果。
由结果可见，有8份血浆可抑制全部11株单抗的反应；可抑制5株以上单抗反应的血浆48份，占75%；8号血浆仅抑制1株单抗的反应。
人类免疫缺陷病毒1型p24抗原
Microwell 人类免疫缺陷病毒1型p24抗原酶联免疫试剂盒说明书【产品名称】通用名：人类免疫缺陷病毒1型p24抗原酶联免疫试剂盒英文名：ENZYME IMMUNOASSAY FOR DETECTION OF HUMAN IMMUNODEFICIENCY VIRUS TYPE I P24 ANTIGEN IN HUMAN SERUM, PLASMA AND CELL CULTURESUPERNATANT【包装规格】96人份/盒。
【预期用途】本试剂盒用于人类免疫缺陷病毒1型p24抗原（Human Immunodeficiency Virus Type 1 p24 Antigen）的定量检测，适用于人血清（或血浆）及细胞培养上清液等标本，仅供研究使用。
【检验原理】本产品采用固相酶联免疫吸附分析法（Enzyme-linked Immunosorbent Assay，ELISA）检测人血清（或血浆）中的游离HIV-1 p24抗原和细胞培养上清液等标本中的HIV-1 p24抗原。
本分析方法是基于双抗体夹心的非竞争性免疫分析。
校准品和样品中HIV-1 p24抗原与固相抗- p24单克隆抗体和生物素标记的抗-p24多克隆抗体通过免疫反应，形成固相抗-p24单克隆抗体—p24抗原—抗-p24多克隆抗体-生物素复合物；温育后洗涤，洗去非特异或多余的抗原和多余的生物素标记的抗- p24多克隆抗体；然后加入HRP （Horseradish Peroxidase，辣根过氧化物酶）标记的链亲和素，形成固相抗- p24单克隆抗体—p24抗原—抗-p24多克隆抗体-生物素—链亲和素-HRP复合物；温育后洗涤，洗去多余的HRP标记的链亲和素。
加入TMB-H2O2底物溶液，HRP催化H2O2氧化TMB生成蓝色的产物（最大吸收峰655nm），加入终止液终止酶催化反应，生成黄色产物（最大吸收峰450nm）。
其吸光度与校准品和样品中的HIV-1 p24抗原浓度成正相关。
HIV_AIDS病人肝脏HIV_1RNA和p24抗原的检测
本研究在所有肝组织切片中肝细胞和 4 例凋亡 肝细胞的胞 浆内检 测到 H IV-1p24 抗 原 , 初步提 示 HIV 直接感染了肝脏细胞 。 进一步进行原位杂交实 验研究 , 结果进一步印证 H IV-1 可能直接感染肝细 胞 , 与既往某些研究结果类似 。 有报道[ 9] 称 , 在 HIV 感染者口腔黏膜的上皮细胞内 , 采用原位杂交技术检 测到 H IV-1 RN A , 并且一些体外实验模型[ 10] 也提示
Abstract :Objective T o detect H IV-1RN A and p24 antig en in the liver bio psy specimens of peo ple living w ith HI V/ A IDS.Methods T he p24 antig en and HI V-1RN A o f liv er biopsy sam ples of 14 pa tients with HIV/ AIDS w ere examined by immuno histochemistry a nd in situ hy bridizatio n, respectiv ely. Result Intracellular ex pression o f p24 antigen w as detected in K upffer cells, ly mphocy tes, endo thelial cells a nd hepatocy tes of all specime ns.In the in situ hy bridizatio n te st , Kupffer cells a nd lymphocy tes were labeled in all specimens. Fur thermo re , in 4 specimens the mor pho log y o f the HIV RN A po sitiv e cells w as reproducidly consistent with that of hepatocy te s.Conclusion T hese finding s indica te that HIV-1 could replicate in the liver of H IV-infected individuals and might be re lated to the damag ed liv er cells.
p24抗原检测原理
p24抗原检测原理今天咱们来唠唠这个P24抗原检测的原理，可有趣儿啦。
咱先来说说这个P24抗原是啥。
P24抗原呀，它是艾滋病病毒（HIV）的一种核心蛋白。
就像是HIV这个小坏蛋身体里的一个小零件，但是这个小零件可重要啦。
当一个人感染了HIV之后呢，这个P24抗原就会在身体里出现，而且在感染的早期，它出现得还挺明显的呢。
那这个检测是怎么发现这个P24抗原的呢？这就像是一场小小的侦探游戏。
检测试剂就像是个小侦探。
这个试剂里面有一种特殊的东西，叫做抗体。
这个抗体呀，就像是一把专门能抓住P24抗原这个小坏蛋的小钳子。
当我们采集了检测者的血液或者其他体液样本，把这个样本放到检测试剂里的时候呢，就像是把藏着小坏蛋的地方给暴露出来了。
如果样本里有P24抗原，那这个抗原就会和试剂里的抗体发生反应。
这种反应就像是两块拼图正好拼在一起一样，严丝合缝的。
一旦它们发生反应了呢，就会产生一种信号。
这个信号就像是小侦探发现小坏蛋之后发出的警报一样。
在一些检测方法里，这个信号可能是颜色的变化。
比如说，如果没有P24抗原，那这个检测的小窗口可能就是一种颜色，但是一旦有抗原和抗体结合了，这个小窗口就会变成另外一种颜色。
就像变魔术一样，从无色变成有色，或者从一种颜色变成另一种颜色。
那为啥要检测这个P24抗原呢？这是因为呀，在感染HIV的早期，身体里还没有产生足够多的能被常规检测方法发现的抗体的时候，P24抗原就已经在那儿了。
所以检测P24抗原就像是一个早期预警系统。
就好比是在敌人刚刚潜入的时候，我们就有个小哨兵（P24抗原检测）发现了他们的踪迹。
而且哦，这个P24抗原检测还挺快的呢。
不像有些检测要等好久才能出结果。
它就像是一个急性子的小助手，能比较快地告诉我们身体里是不是可能有HIV这个大麻烦。
不过呢，宝子们也要知道，P24抗原检测也不是完美的。
有时候可能会有假阳性或者假阴性的情况。
假阳性呢，就像是小侦探认错人了，把不是小坏蛋的东西当成了P24抗原。
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HIV-1 P24抗原检测感染HIV-1后，机体针对HIV-1基因编码的抗原性物质产生相应抗体，在临床上具有重要诊断学意义的主要是对抗结构基因编码抗原(如gpl60，gpl20，gp41，p66，p55，p51，p31，p24，p17等)的抗体。
由于个体差异、各种病毒蛋白的浓度和抗原性强弱不同及不同个体对不同抗原成分的反应性均有所不同，因此相应抗体的产生时间和不同个体对相同抗原成分的免疫应答强度等存在一定差别，此外，检测方法和使用试剂的敏感性不同对HIV-l抗体的检出时间产生一定影响。
在感染HIV-1后，患者血清中最先出现p24抗原，继之，各种HIV-1抗原可达到高峰；2-6周后，随着HIV-l抗体产生及浓度的不断增加，HIV-l抗原渐趋降低或检测不出。
在HIV感染后期，抗原量不断增加，往往预后不佳，至少约有50%左右的病人发展为艾滋病。
目前用于HIV抗体检测的第三代ELISA试剂窗口期为3-4周，在该期病毒抗体不能被检出，但可检测到病毒相关抗原或分离出病毒，故在窗口期检测P24抗原是早期辅助诊断和进一步缩短窗口期的一种方法。
P24抗原的检测，大约可以使抗体窗口期缩短1周，因为估计检测P24抗原到检出P24抗体间隔只有1周时间。
有助于多数急性感染者血清HIV抗体阳转之前的诊断，还适用于：HIV-1 阳性母亲所生婴儿的早期辅助鉴别诊断；第四代 HIV-1 抗原 / 抗体 ELISA 试剂检测呈阳性反应、但 HIV-1 抗体确认阴性者的辅助诊断；监测病程进展和抗病毒治疗效果。
但由于不是所有新近感染的人都可以检出P24抗原，加上该项检测费用较高，所以一般不作为常规诊断项目。
HIV-1 P24抗原检测一般用ELISA双抗体夹心法试剂，必须经过 SDA 批准注册。
阳性结果必须经中和试验确认，该结果才可作为HIV感染的辅助诊断依据，不能据此确诊；HIV-1 P24抗原检测阴性，只表示在本试验中无反应，不能排除HIV 感染。
在感染早期和发病期抗原检出率相对较高。
基本概述本病毒为艾滋病人（Aids）的病原体，系引起细胞病变的灵长类逆转录病毒之一，属逆转录病科(Retroviridae)慢病毒亚科(Lentivirinae)。
它于1983年Montaginer 等首先从1例淋巴腺病综合征患者分离到，命名为淋巴腺病综合征相关病毒(Lympha denopathy Associated Virus,LAS) 。
随后1984年美国Gallo等从艾滋病人分离到逆转录病毒，命名为嗜人类T淋巴细胞病毒Ⅲ型(Human T Cell Lymphotropic Viru s Type Ⅲ, HTLV-Ⅲ) ，后来证明这二种病毒是一样的。
至1986年国际病毒命名委员统一称为人类免疫缺陷病毒(Human Immunodificidncy Virus ,HIV) 。
HIV主要型别为HIV-1和HIV-2，艾滋病大多由HIV-1引起。
生物学诊断形态结构病毒呈球形，直径100～120nm，电镜下可见一致密的圆锥状核心，内含病毒R NA分子和酶（逆转录酶、整合酶、蛋白酶），病毒外层囊膜系双层脂质蛋白膜，其中嵌有gp120和gp41，分别组成刺突和跨膜蛋白。
囊膜内面为P17蛋白构成的衣壳，其内有核心蛋白（P24）包裹RNA（图30-1）。
基因结构及编码蛋白的功能HIV基因组长约9.2～9.7kb，含gag、Pol、env、3个结构基因，及至少6个调控基因（TaT Rev、Nef、Vif、VPU、Vpr）并在基因组的5′端和3′端各含长末端序列（图30-2）。
HIV LTR含顺式调控序列，它们控制前病毒基因的表达。
已证明在LTR 有启动子和增强子并含负调控区。
1．gag基因能编码约500个氨基酸组成的聚合前体蛋白（P55），经蛋白酶水解形成P17，P24核蛋白，使RNA不受外界核酸酶破坏。
2．Pol基因编码聚合酶前体蛋白（P34），经切割形成蛋白酶、整合酶、逆转录酶、核糖核酸酶H，均为病毒增殖所必需。
3．env基因编码约863个氨基酸的前体蛋白并糖基化成gp160，gp120和gp4 1。
gp120含有中和抗原决定簇，已证明HIV中和抗原表位，在gp120 V3环上，V3环区是囊膜蛋白的重要功能区，在病毒与细胞融合中起重要作用。
gp120与跨膜蛋白gp41以非共价键相连。
gp41与靶细胞融合，促使病毒进入细胞内。
实验表明gp41亦有较强抗原性，能诱导产生抗体反应。
4．TaT 基因编码蛋白（P14）可与LTR结合，以增加病毒所有基因转录率，也能在转录后促进病毒mRNA的翻译。
5．Rev基因产物是一种顺式激活因子，能对env和gag中顺式作用抑制序(Ci s-Acting repression sequance,Crs) 去抑制作用，增强gag和env基因的表达，以合成相应的病毒结构蛋白。
6．Nef基因编码蛋白P27对HIV基因的表达有负调控作用，以推迟病毒复制。
该蛋白作用于HIV cDNA的LTR，抑制整合的病毒转录。
可能是HIV在体内维持持续感集体所必需。
7．Vif基因对HIV并非必不可少，但可能影响游离HIV感染性、病毒体的产生和体内传播。
8．VPU基因为HIV-1所特有，对HIV的有效复制及病毒体的装配与成熟不可少。
9．Vpr基因编码蛋白是一种弱的转录激活物，在体内繁殖周期中起一定作用。
HIV-2基因结构与HIV-1有差别：它不含VPU基因，但有一功能不明VPX基因。
核酸杂交法检查HIV-1与HIV-2的核苷酸序列，仅40%相同。
env基因表达产物激发机体产生的抗体无交叉反应。
培养特性将病人自身外周或骨髓中淋巴细胞经PHA刺激48～72小时作体外培养（培养液中加IL2）1～2周后，病毒增殖可释放至细胞外，并使细胞融合成多核巨细胞，最后细胞破溃死亡。
亦可用传代淋巴细胞系如HT-H9、Molt-4细胞作分离及传代。
HIV动物感染范围窄，仅黑猩猩和长劈猿，一般多用黑猩猩做实验。
用感染HIV 细胞或无细胞的HIV滤液感染黑猩猩，或将感染HIV黑猩猩血液输给正常黑猩猩都感染成功，边续8个月在血液和淋巴液中可持续分离到HIV，在3～5周后查出HIV 特异性抗体，并继续维持一定水平。
但无论黑猩猩或长臂猿感染后都不发生疾病。
抵抗力HIV对热敏感。
56℃30min灭活，但在室温保存7天，仍保持活性。
不加稳定剂病毒-70℃冰冻失去活性，而35%山梨醇或50%胎牛血清中-70℃冰冻3个月仍保持活性。
对消毒剂和去污剂亦敏感，0.2%次氯酸钠0.1%漂白粉，70%乙醇，35%异丙醇、50%乙醚、0.3%H2O20.5%来苏尔处理5′能灭活病毒，1%NP-40和0.5% triton -X-100能灭活病毒而保留抗原性。
外紫外线、γ 射线有较强抵抗力。
病毒性与免疫性传染源和传播途径HIV感染者是传染源，曾从血液、精液、阴道分泌液、眼泪、乳汁等分离得HIV。
传播途径有：1．性传播：通过男性同性恋之间及异性间的性接触感染。
2．血液传播：通过输血、血液制品或没有消毒好的注射器传播，静脉嗜毒者共用不经消毒的注射器和针头造成严重感染，据我国云南边镜静脉嗜毒者感染率达6 0%。
3．母婴传播：包括经胎盘、产道和哺乳方式传播。
致病机制HIV选择性地侵犯带有CD4分子的，主要有T4淋巴细胞、单核巨噬细胞、树突状细胞等。
细胞表面CD4分子是HIV受体，通过HIV囊膜蛋白gp120与细胞膜上C D4结合后由gp41介导使毒穿入易感细胞内，造成细胞破坏。
其机制尚未完全清楚，可能通过以下方式起作用：1．由于HIV包膜蛋白插入细胞或病毒出芽释放导致细胞膜通透性增加，产生渗透性溶解。
2．受染细胞内CD-gp120复合物与细胞器（如高尔基氏体等）的膜融合，使之溶解，导致感染细胞迅速死亡。
3．HIV感染时未整合的DNA积累，或对细胞蛋白的抑制，导致HIV杀伤细胞作用。
4．HIV感染细胞表达的gp120能与未感染细胞膜上的CD4结合，在gp41作用下融合形成多核巨细胞而溶解死亡。
5．HIV感染细胞膜病毒抗原与特异性抗体结合，通过激活补体或介导ADCC效应将细胞裂解。
6．HIV诱导自身免疫，如gp41与T4细胞膜上MHCⅡ类分子有一同源区，由抗gp41抗体可与这类淋巴细胞起交叉反应，导致细胞破坏。
7．细胞程序化死亡（programmed cell death ）：在艾滋病发病时可激活细胞凋亡(Apoptosis) 。
如HIV的gp120与CD4受体结合；直接激活受感染的细胞凋亡。
甚至感染HIV的T细胞表达的囊膜抗原也可启动正常T细胞，通过细胞表面CD4分子交联间接地引起凋亡CD+4细胞的大量破坏，结果造成以T4细胞缺损为中心的严重免疫缺陷，患者主要表现：外周淋巴细胞减少，T4/T8比例配置，对植物血凝素和某些抗原的反应消失，迟发型变态反应下降，NK细胞、巨噬细胞活性减弱，IL2、γ干扰素等细胞因子合成减少。
病程早期由于B细胞处于多克隆活化状态，患者血清中lg水平往往增高，随着疾病的进展，B细胞对各种抗原产生抗体的功能也直接和间接地受到影响。
艾滋病人由于免疫功能严重缺损，常合并严重的机会感染，常见的有细胞（鸟分枝杆菌）、原虫（卡氏肺囊虫、弓形体）、真菌（白色念珠菌、新型隐球菌）、病毒（巨细胞病毒、单纯疱疹病毒，乙型肝炎病毒），最后导致无法控制而死亡，另一些病例可发生Kaposis肉瘤或恶性淋巴瘤。
此外，感染单核巨噬细胞中HIV呈低度增殖，不引起病变，但损害其免疫功能，可将病毒传播全身，引起间质肺炎和亚急性脑炎。
HIV感染人体后，往往经历很长潜伏期（3～5年或更长至8年）才发病，表明HIV在感染机体中，以潜伏或低水平的慢性感染方式持续存在。
当HIV潜伏细胞受到某些因素刺激，使潜伏的HIV激活大量增殖而致病，多数患者于1-3年内为死亡。
免疫性HIV感染后可刺激机体生产囊膜蛋白（Gp120,Gp41）抗体和核心蛋白（P24）抗体。
在HIV携带者、艾滋病病人血清中测出低水平的抗病毒中和抗体，其中艾滋病病人水平最低，健康同性恋者最高，说明该抗体在体内有保护作用。
但抗体不能与单核巨噬细胞内存留的病毒接触，且HIV囊膜蛋白易发生抗原性变异，原有抗体失去作用，使中和抗体不能发的应有的作用。
在潜伏感染阶段，HIV前病毒整合入宿主细胞基因组中，不被免疫系统识别，逃避免疫清除。
这些都与HIV引起持续感染有关。
微生物学诊断检测HIV感染者体液中病毒抗原和抗体的方法，操作方便，易于普及应用，其中抗体检测尤普通。
但HIV P24抗原和病毒基因的测定，在HIV感染检测中的地位和重要性也日益受到重视。
抗体检测主要有酶联免疫吸附试验（ELISA）和免疫荧光试验（IFA）。
ELISA用去污剂裂解HIV或感染细胞液提取物作抗原，IFA用感染细胞涂片作抗原进行抗体检测，如果发现阳性标本应重复一次。