酶工程课件笔记整理
酶工程笔记和期末重点
第五章生物药物的酶学分析法酶学分析法原理：利用酶作为分析工具，测定样品中待测物质含量的方法称作酶法分析。
待测物质应是酶的底物，或者是酶的抑制剂、活化剂或酶的辅因子，否则不能采用酶法进行分析检查。
酶法分析可分为终点法和反应速度法。
（一）终点法，又称总变量法基本原理：利用酶的生物催化反应，使待测物质发生转化，然后测定产物产量或底物残余量，通过定量分析，从而明确待测物质的含量。
可以是单酶反应，也可以是几种酶构成的偶联酶反应。
在生物药物分析中，终点法是最常用的酶法分析。
终点法的条件必须有专一地作用该被测物质的酶，并能得到它的制品。
能够确定使这种酶反应接近进行完全的条件。
反应中底物的减少或产物的增加或辅酶物质的改变等可以借助某种简单的方法进行测定。
在能满足这些条件的情况下，最好是采用单一酶反应就能进行定量检测。
使用终点法应注意的问题1．酶的底物专一性：绝对专一性相对专一性立体异构专一性对于酶法分析来说，最理想的酶是具有绝对专一性的酶。
若样品中存在除待测物质外其他可作为底物的物质时，可利用偶联酶的专一性进行区别定量分析。
2．反应的平衡对于终点法来说，要求反应接近进行完全，故对不同的酶反应须采取不同的措施使反应进行到接近完全。
若酶反应平衡十分偏向进行方向，则可方便的用终点法进行检测，不需进行任何处理。
若反应的平衡并不十分偏向进行方向，或偏向逆方向，那么由于反应不能完全，因而也就不能正常定量。
为了解决这一问题，通常采取以下一些措施：对于双底物反应尽可能提高第二底物的浓度对氧化还原之类与H＋有关的反应要选择适当的pH设法除去产物用具有不同平衡常数的辅酶类似物代替原有的辅酶和第二底物的再生系统偶联，则第一底物可能完全转化为反应产物3．反应液中的酶量对于一个具体的测定来说不同的酶反应有不同的Km值，通过米氏方程和均相溶液反应的动力学推算和分析，可以大致得到如下的结论：对于单酶反应的酶法分析：所加入的酶量（u/ml）相当于Km（mmol）对于偶联反应的酶法分析，所加入的酶量如下：第一反应为酶量（u/ml）相当于Km1（mmol）第二反应为酶量（u/ml）相当于（1～2）×Km2（mmol）4.反应产物抑制若产物对反应本身有抑制作用，则就会妨碍反应进行，在这种情况下可采取将该产物除去或者和再生系统偶联的办法解决。
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酶工程的知识点总结课题3 探讨加酶洗衣粉的洗剂效果一、实验原理1．加酶洗衣粉是指含有酶制剂的洗衣粉，目前常用的酶制剂有四类：蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶和纤维素酶，其中，应用最广泛、效果最明显的是碱性蛋白酶和碱性脂肪酶。
b5E2RGbCAP 2．碱性蛋白酶能将血渍、奶渍等含有的大分子蛋白质水解成可溶性的氨基酸或小分子的肽，使污迹从衣物上脱落。
脂肪酶、淀粉酶和纤维素酶也能分别将大分子的脂肪、淀粉和纤维素水解为小分子物质，使洗衣粉具有更好的去污能力。
p1EanqFDPw3．在本课题中，我们主要探究有关加酶洗衣粉的三个问题：一是普通洗衣粉和加酶洗衣粉对衣物污渍的洗涤效果有什么不同；二是在什么温度下使用加酶洗衣粉效果最好，三是添加不同种类的酶的的洗衣粉，其洗剂效果有哪些区别。
DXDiTa9E3d二、实验步骤1探究用加酶洗衣粉与普通洗衣粉洗涤的效果的不同①在2个编号的烧杯里，分别注入500mL清水。
②取2块大小相等的白棉布，用滴管在每块白布上分别滴上等量的墨水，分别放入烧杯里，用玻璃棒搅拌。
③将2个烧杯分别放入同等温度的温水中，保温5分钟。
④称取5克加酶洗衣粉和5克普通洗衣粉2份，分别放入2个烧杯中，用玻璃棒均匀搅拌。
保温10分钟。
⑤观察并记录2个烧杯中的洗涤效果RTCrpUDGiT 2探究用加酶洗衣粉洗涤的最佳温度条件①在3个编号的烧杯里，分别注入500mL清水。
②取3块大小相等的白棉布，用滴管在每块白布上分别滴上一滴食用油、鸡血、牛奶，分别放入烧杯里，用玻璃棒搅拌。
③将3个烧杯分别放入50摄氏度的热水、沸水和冰块中，保温5分钟。
④称取5克加酶洗衣粉3份，分别放入3个烧杯中，用玻璃棒均匀搅拌。
保温10分钟。
⑤观察并记录3个烧杯中的洗涤效果。
3探究不同种类的加酶洗衣粉洗涤的效果5PCzVD7HxA污染物蛋白酶洗衣粉脂肪酶洗衣粉复合酶洗衣粉普通洗衣粉油渍汗渍血渍观察并记录四种洗衣粉分别洗涤三种污染的洗涤效果。
三、注意事项1．变量的分析和控制影响加酶洗衣粉洗涤效果的因素有水温、水量、水质、洗衣粉的用量，衣物的质料、大小及浸泡时间和洗涤的时间等。
酶学与酶工程学习重点知识整理
2012年10月酶学与酶工程复习重点酶的定义与化学本质定义:酶---活细胞产生的，能在细胞内外起作用的(催化)生理活性物质。
酶的化学本质: 酶是生物体内一类具有催化活性和特殊空间构象的生物大分子物质，包括蛋白质和核酸等酶催化作用的特点1.催化效率极高反应速度比无催化剂时高108~1020倍，比其他催化剂高107~1013倍。
常用分子比来表示,即每摩尔的酶催化底物的摩尔数。
Kcat:每秒每个酶分子能催化多少个微摩尔的底物发生转化。
2.高度的专一性酶对反应物(底物)具有严格的选择性。
一种酶只能催化某一种或某一类特定的底物发生反应。
绝对专一性：有些酶只作用于一种底物，催化一个反应，而不作用于任何其它物质。
相对专一性：这类酶对结构相近的一类底物都有作用。
包括键专一性和簇(基团)专一性。
立体异构专一性：这类酶能辨别底物不同的立体异构体，只对其中的某一种构型起作用，而不催化其他异构体。
包括旋光异构专一性和几何异构专一性。
3.反应条件温和酶在强酸、强碱、高温、高压等条件下会变性失活，故催化反应一般在常温、常压、接近中性的溶液中进行。
4.酶的催化活性是受调节控制的易受各种因素的影响，在活细胞内受到精密严格的调节控制,这是酶与非生物催化剂的本质区别。
酶的国际系统分类法及编号1.氧化还原酶2.转移酶3.水解酶4.裂合酶5.异构酶6.合成酶酶活力、酶单位、比活力酶活力(也称酶活性)：指酶专一催化一定化学反应的能力。
酶单位(u): 在酶作用最适底物、最适pH、最适缓冲液的离子强度及25 ℃下，每分钟内催化1.0微摩尔底物转化为产物底酶量为一个国际酶活力的单位(IU)。
比活力(specific activity):每mg蛋白质所具有的酶活力单位数，用（U/mg蛋白）来表示。
酶活力测定方法单体酶，寡聚酶(oligomeric enzyme )，多酶体系(multienzyme system) ,多酶复合体单体酶：它是一个具有完整生物功能、独立三级结构的单酶蛋白部分只有一条多肽链的酶称为单体酶。
酶工程重点整理总结
.第一章绪论1、何为酶工程，试述其主要内容和任务。
答：（1）酶工程：酶的生产、改性与应用的技术过程称为酶工程。
（2）主要内容：微生物细胞发酵产酶，动植物细胞培养产酶，酶的提取与分离纯化，酶分子修饰，酶、细胞、原生质体固定化，酶非水相催化，酶定向进化，酶反应器和酶的应用等。
（3）主要任务：经过预先设计，通过人工操作获得人们所需的酶，并通过各种方式使酶的催化特性得以改进，充分发挥其催化功能。
2、酶有哪些显著的催化特性？答：（1）酶催化作用的专一性强（①绝对转移性：一种酶只能催化一种第五进行一种反应；②相对专一性：一种酶能够催化一类结构相似的底物进行某种相同类型的反应）；（2）酶催化作用的效率高（10~10倍）；137（3）酶催化作用条件温和。
3、简述影响酶催化作用的主要因素。
答：（1）底物浓度的影响：决定酶催化作用的主要因素。
酶催化反应速度随底物浓度增加现增加在逐步趋向平衡再反而下降。
（2）酶浓度的影响：底物浓度足够高的条件下，酶催化反应速度与酶浓度成正比。
（3）温度的影响：适宜温度范围内，酶能进行催化反应，最适温度条件下，酶的催化反应速度达到最大。
一般60°C以上易失活，5°C以下活性极低，Taq聚合酶95°C下仍稳定。
（4）PH的影响：适宜PH范围内，酶才能显示其催化活性，最适pH条件下，酶催化反应速度达到最大。
（5）抑制剂的影响：在抑制剂的影响下，酶的催化活性降低甚至丧失，从而影响酶的催化功能，有竞争性抑制、非竞争性抑制、反竞争性抑制。
（6）激活剂的影响：在激活剂的作用下，酶的催化活性提高或者由无活性的酶生成有催化活性的酶。
如Ca、Mg、Co、Zn、Mn、等金属离子和Cl等无机负离子。
5、简述酶活力单位的概念和酶活力的测定方法。
答：概念：在特定条件下（温度可采用25°C，pH等条件均采用最适条件），每1min催化1μmol 的底物转化为产物的酶量定义为1个酶活力单位（IU）。
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网格型：包埋在高分子凝胶细微网格中。
将块状聚合形成的凝胶切成小块，或直接包埋在珠 状聚合物中，后者可以使固定化酶机械强度提高 10倍，并改进酶的脱落的情况。
常用的材料：
聚丙烯酰胺、聚乙烯醇和光敏树脂等合成高分子物 质
淀粉、明胶、胶原、海藻酸和角叉胶等天然高分子 物质。
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五、酶促动力学 六、酶的分离纯化与酶的活力测定
1 酶的分离纯化
细胞外酶和细胞内酶 在生物细胞内除了目标酶还有很多其他的酶，因
此需要分离和纯化的步骤。 基本步骤： ① 破碎细胞膜 ② 抽提 ③ 纯化
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比活力：纯度的量度，指每毫克质量的蛋白 质中所含的某种酶的催化活力，一般用单 位/毫克蛋白（U/mg蛋白质表示）。酶的比 活力越高，酶的纯度也就越高。
20世纪60年代，以色列科学家发现酶的固定化现象。 1969年，千畑一郎等将固定化氨基酰化酶应用于生产L-氨 基酸，开创了固定化酶应用于工业生产的先例； 1971年召开的第一届国际酶工程会议上，建议采用统一的 英文名称Immobilized Enzyme； 1973年，固定化大肠杆菌菌体中的天冬氨酸酶连续生产L天冬氨酸。 1986年，利用固定化原生质体发酵生产碱性磷酸酶和葡萄 糖氧化酶等相继获得成功。
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酶活性中心的特点：
a) 活性中心在酶分子总体积中只占相当小的部分 （1-2%），相当于2-3个氨基酸。
b) 都是酶分子表面的一个凹穴，有一定的大小和形 状，但不是刚性的，而具有一定的柔性。
c) 活性中心为非极性的微环境，有利于与底物结合。
d) 底物与酶通过形成较弱键力的次级相互作用并结 合到酶的活性中心。
酶工程笔记和期末重点教案
一、前言【教学目标】1. 了解酶工程的定义、发展历程及应用领域。
2. 掌握酶的特性，包括高效性、专一性和易受环境影响的特性。
【教学内容】1. 酶工程的定义和发展历程。
2. 酶的应用领域，如食品工业、医药工业、环境保护等。
3. 酶的特性及其在催化反应中的优势。
【教学方法】采用讲解、案例分析、小组讨论等方式进行教学。
【教学时长】45分钟二、酶的性质与酶活性【教学目标】1. 掌握酶的化学本质和结构特点。
2. 了解酶活性的影响因素，如温度、pH、酶浓度等。
【教学内容】1. 酶的化学本质和结构特点。
2. 酶活性的定义及其单位。
3. 温度对酶活性的影响及最适温度的确定。
4. pH对酶活性的影响及最适pH的确定。
5. 酶浓度对酶活性的影响。
【教学方法】采用讲解、实验演示、小组讨论等方式进行教学。
【教学时长】90分钟三、酶的分离与纯化【教学目标】1. 掌握酶的分离与纯化的方法和技术。
2. 了解酶的纯化程度及其在催化反应中的重要性。
【教学内容】1. 酶的分离与纯化的方法，如凝胶过滤、离子交换、亲和层析等。
2. 酶的纯化程度及其判断方法。
3. 酶的纯化在催化反应中的重要性。
【教学方法】采用讲解、实验演示、小组讨论等方式进行教学。
【教学时长】90分钟四、酶的固定化技术【教学目标】1. 掌握酶的固定化技术及其分类。
2. 了解固定化酶的优势和局限性。
【教学内容】1. 酶的固定化技术，如物理吸附、共价结合、包埋等。
2. 固定化酶的优势，如易于回收、可重复使用等。
3. 固定化酶的局限性，如酶活性降低、传质效率降低等。
【教学方法】采用讲解、实验演示、小组讨论等方式进行教学。
【教学时长】90分钟五、酶工程的应用【教学目标】1. 掌握酶工程在各个领域的应用。
2. 了解酶工程的发展趋势和前景。
【教学内容】1. 酶工程在食品工业中的应用，如面包制作、乳品制作等。
2. 酶工程在医药工业中的应用，如药物合成、基因工程等。
3. 酶工程在环境保护中的应用，如废水处理、生物降解等。
酶工程总结PPT课件
酶的分子改造技术
酶的分子改造技术是通过化学或生物 方法对酶的分子结构进行修饰和改造， 从而改变酶的催化性质和功能的技术。
酶的分子改造技术包括化学修饰、定 向进化、点突变等关键技术，这些技 术的应用能够优化酶的催化性能和稳 定性，提高酶的生产效率和降低成本。
THANKS
生物能源开发
酶工程技术可用于生物能源开发，如生物柴油、生物 酒精等。
06
酶工程的前景与挑战
酶工程的发展前景
酶工程在工业生产中的应用前景广阔，特别是在生物制药、生物燃料、环保等领域。
随着酶工程技术的不断进步，酶的产量、活性和稳定性将得到进一步提高，为工业 生产提供更高效、环保的解决方案。
酶工程在医疗领域的应用前景也十分看好，例如用于药物设计和开发、疾病诊断和 治疗等。
环保领域的应用
有毒有害物质降解
01
酶工程技术可用于降解有毒有害物质，如重金属、有机污染物
等。
废水处理
02
酶工程技术可以用于废水处理，通过酶促反应将废水中的有机
物转化为无害物质。
生物修复
03
酶工程技术可用于生物修复，通过酶促反应降解污染物，恢复
生态环境。
食品工业领域的应用
食品添加剂生产
酶工程技术在食品添加剂生产中发挥着重要作用，如生产甜味剂、 防腐剂等。
专一性
一种酶通常只能催化一种或一类化学反应，具有明显的专一性。
不稳定性
大多数酶是蛋白质，容易受温度、pH、重金属离子等环境因素的影响，表现出不稳定性。
酶的活性调节
1 2
共价修饰
《酶工程》王金胜版 1-4章 笔记
酶工程第一节概述一、酶的概念和作为生物催化剂的特点1、酶的概念：酶是由生物产生的具有催化作用的生物大分子，大部分在体内，小部分在体外，具有活性中心和特殊构象2、作为催化剂的特点1）极高的催化效率2）高度专一性——绝对专一性（一种酶只作用于一种底物）相对专一性（作用于一类底物或一种化学键）立体异构专一性（对底物立体构型的特异要求）3）活性可调节性（合成的诱导和阻碍、降解的促进、激活物和抑制物的调节作用，代谢物对酶的反馈调节，酶的变构调节、酶的化学修饰）4）酶的不稳定性（一定的ph和温度）二、酶的化学组成、结构和催化机理1.酶的化学本质和组成：本质是蛋白质（检测高度纯化和结晶的酶一级结构）根据组成分为：单纯酶（组成成分仅为氨基酸的一类酶）和结合酶（蛋白质-酶蛋白+非蛋白的小分子-辅助因子）全酶=酶蛋白+辅助因子2.酶的辅助因子酶蛋白—酶反应的专一性辅助因子—传递电子、原子、某些化学基团酶含有的金属离子—酶活性中心组成部分、连接底物盒酶分子的桥梁、稳定酶蛋白分子构像的必需品：常见的有k，na，mg，cu,Zn,Fe等3.酶结构与功能结构特征：一级结构：酶蛋白的20种氨基酸种类、数目和排列顺序（-sh参与组成酶活性中心）空间结构—维持酶活性中心所必需的构象。
肽链ß折叠—保持酶分子的球状椭圆状为主，折叠结构之间å以及折叠肽段相连功能部位：酶分子表面多种功能性区域。
酶活性中心与必需基团：酶活性中心：活性部位。
由在一级结构上可能很远但在空间结构上彼此靠近的氨基酸残基，集中在一起形成的，具有一定空间结构的区域，该区域与底物相结合并催化底物转化为产物。
活性中心的必须基团：分为结合基团、催化基团。
是酶发挥催化作用与底物直接接触的基团。
诱导契合作用：底物接近酶是，诱导酶分子的构象变得能与底物配合，进而催化底物分子发生化学变化。
4.催化机理：降低反应活化能、中间产物学说、酶作用高效率机理（邻近效应、定向效应、底物分子变形或扭曲、酸碱催化、共价催化、金属离子的催化、活性中心的低介电信、协同催化）活化能：从初态到活化态所需的能量5.酶的分类：氧化还原酶（乳酸脱氢酶、琥珀酸脱氢酶、细胞色素氧化酶、过氧化氢酶、过氧化物酶）转移酶类（甲级转化酶、氨基转化酶、己糖激酶、磷酸化酶）水解酶类裂合酶类异构酶类连接酶类三、酶的分类和命名第二节酶促反应动力学（反应速度规律和因素）一、底物反应动力学1.单底物反应动力学-异构、裂解酶（仅底物浓度变化，与酶促反应关系——一级反应-混合级反应-零级反应）米氏方程km米氏常数=酶促反应为最大速度一半时的底物浓度mol／L2.双底物反应动力学（1）序列反应二、抑制反应动力学抑制剂-不变性，活性下降1不可逆抑制作用的抑制剂以共价键与酶的必需基团进行结合专一性不可抑制剂非专一性不可你抑制剂（一类或者几类基团）2.可逆抑制作用抑制剂以解离平衡为基础，非共价结合，物理方法去除后，活性恢复（1）竞争性抑制作用—与底物结构相似，竞争酶活性中心（2）非竞争性抑制作用—与活性中心以外的必需基团结合，不影响酶和底物。
酶学与酶工程重点总结
第二章酶学基础一、酶的活性中心(active center，active site)（一）活性中心和必需基团1、与酶活性显示有关的，具有结合和催化底物形成产物的空间区域，叫酶的活性中心，又叫活性部位。
2、活性中心可分为结合部位和催化部位。
3、结合部位决定酶的专一性，催化部位决定酶所催化反应的性质。
4、酶结构概述（1）活性中心是一个三维实体。
（2）是有一些一级结构上可能相距较远的氨基酸侧链基团组成，有的还包含辅酶或辅基的某一部分基团。
（3）在酶分子表面呈裂缝状。
（4）酶活性中心的催化位点和结合位点可以不止一个。
（5）酶活性中心的基团都是必需基团，但必需基团还包括活性中心以外的基团。
5、酶分子中的氨基酸残基或其侧链基团可以分为四类1．接触残基2．辅助残基3．结构残基4．非贡献残基（二）酶活性中心中的化学基团的鉴别1．非特异性共价修饰：某些化学试剂能使蛋白质中氨基酸残基的侧链基团反应引起共价结合、氧化或还原修饰反应，使基团结构和性质发生变化。
如果某基团修饰后不引起酶活力的变化，就可初步认为此基团可能是非必需基团；反之，如修饰后引起酶活力的降低或丧失，则此基团可能是酶的必需基团。
2．亲和标记共价修饰剂是底物的类似物，可专一性地引入酶的活性中心，并具有活泼的化学基团(如卤素)，可与活性中心的基团形成稳定的共价键。
因其作用机制是利用酶对底物类似物的亲和性而将酶共价标记的，故称为亲和标记。
3．差别标记在过量底物或可逆抑制剂遮蔽活性中心的情况下，加入共价修饰剂，使后者只修饰活性中心以外的有关基团；然后去除底物或可逆抑制剂，暴露活性中心，再用同位素标记的向一修饰剂作用于活性中心的同类基团；将酶水解后分离带有同位素的氯基酸，即可确定该氨基酸参与活性中心。
4．蛋白质工程这是研究酶必需基闭和活性中心的最先进方法，即将酶蛋白相应的互补DNA(cDNA)定点突变，此突变的cDNA表达出只有一个或几个氨基酸被置换的酶蛋白，再测定其活性，可以知道被置换的氨基酸是否为活力所必需。
酶工程第一章酶学基础知识PPT课件
酶的生产方式
01 02
微生物发酵
通过微生物发酵生产酶是一种常见的方法。不同微生物具有不同的代谢 途径和酶系，可以产生不同类型的酶。通过选择适当的微生物和发酵条 件，可以大规模生产酶。
酶的分离纯化
通过各种分离纯化技术手段，从生物材料中 提取和纯化酶。
酶的改造
通过基因工程技术手段对酶进行改造，以提 高酶的催化效率和稳定性。
酶的固定化
将游离酶或细胞固定在特定载体上，实现酶 的重复利用和连续化生产。
酶的生产与应用
通过生物工程技术手段实现酶的工业化生产， 并将其应用于各个领域。
酶工程的应用领域
1980年代
随着分子生物学和生物工程技术的迅速发展，酶 工程领域取得了重大突破，实现了酶的大规模生 产和应用。
02
酶的结构与功能
酶的活性中心
02
01
03
酶的活性中心是酶分子中与底物结合并催化反应的区 域，通常由少数几个氨基酸残基组成。
这些氨基酸残基在空间结构上相互接近，形成一个凹 陷的空腔，能够与底物特异结合。
酶的活性中心具有催化作用，能够降低反应的活化能 ，加速化学反应速率。
酶的专一性
酶的专一性是指酶只能催化一 种或一类化学反应的性质。
酶的专一性分为绝对专一性和 相对专一性，绝对专一性是指 酶只催化一种底物反应，相对 专一性是指酶对底物的结构有 一定选择性。
酶的专一性是由酶的活性中心 决定的，活性中心的空间结构 和化学组成决定了酶对底物的 选择性。
03
拓展酶的应用领域，将酶应用 于生物医药、食品工业、纺织 工业等领域，提高产品质量和 降低环境污染。
酶工程复习整理
固定化的方法有哪些
1．载体结合法：将酶结合于水不溶性载体的一种固定化方法。
根据结合的方式不同，又可分为物理吸附、离子结合和共价结合三种。
A．物理吸附：作用力：氢键、范德华力、疏水键等。吸附剂包括无机吸附剂（高岭土、皂土、硅酸、氧化铝等）和有机吸附剂（纤维素、胶原等）比较受重视。
b.序列随机机制：两种底物不按一定的顺序结合，产物的释放也是随机的。某些激酶例如肌酸激酶等就服从随机反应机理。
乒乓机制：酶首先和一个底物结合，释放出一个产物以后，再与另一个底物结合，并释放出产物，不形成三元配合物。转氨酶、某些黄素酶在内的许多酶都具乒乓反应机制
酶抑制作用的类型：
A.可逆抑制作用（reversible inhibition）：抑制剂与酶以非共价键结合，用透析、超滤或凝胶过滤等方法可以除去抑制剂，恢复酶活性。
几何异构专一性：酶能识别顺反异构体。
键专一性：酶只要求作用于一定的键，对键两端的基团无要求。
基团专一性(族专一性)：除了对键要求以外，还要求键一侧的基团为特定的基团。
绝对专一性：对唯一的底物催化唯一的反应。
酶活性中心的构成：
酶的活性中心(active center)：酶分子上与催化活性直接相关的少数氨基酸残基组成的催化区域。包括结合部位Binding site：酶分子中与底物结合的部位或区域（结合部位决定酶的专一性）以及活性中心－催化部位catalytic site：酶分子中促使底物发生化学变化的部位（催化部位决定酶所催化反应的性质。）
Kcat型不可逆抑制剂（自杀底物）：既能与活性中心结合，又能被活性中心催化反应，反应后在抑制剂分子上产生活性基团，再与活性中心的必需基团反应，产生共价修饰。专一性高
Chapter 1 酶与酶工程(整理)
第一章酶与酶工程第一节酶的底子概念与开展史〔一〕酶与酶工程酶〔enzyme〕：由活细胞发生的具有生物催化功能的生物大分子。
酶工程(enzyme engineering)：酶的出产、应用的技术过程。
★酶工程已在工业、农业、医药、食品等方面有广泛应用，并在资源、能源、环保等方面起着举足轻重的作用。
〔二〕酶的开展史1、酶在古代的应用★早在4000年前的周朝，我国人们就不自觉地将酶的催化作用应用于酿酒、制酱工业。
★一种古老的酶技术〔酒曲〕从远古时代被用于豆成品调味料 (豆面酱) 和发酵饮料 (米酒、酒精) 的出产，而且一直沿用到今天。
★蒸过的米参加霉菌混合物就能得到酒曲，这项技术世代相传。
2、酶学研究的历史★最早的酶学尝试：1783年，意大利科学家Spallanzani发现鸟的胃液能分解消化肉类。
斯帕兰扎尼〔Spallanzani〕他用本身饲养的山鹰做了一个十分耐人寻味的尝试。
他将一块生肉塞进一个上面布满许多孔眼的金属小管子里，管子两端盖紧，不使肉掉下来，然后迫使山鹰吞下小管。
过一段时间再设法取出小管。
小管依然完好无损，盖子仍牢牢地固定在小管上，但是管中的肉不见了，只留下一些淡黄色的液体，这使斯巴兰沙尼惊讶不已。
这恐怕要算最早的酶学尝试。
虽然他未说明此物为酶，但后来有人还是把他看作是酶的最早发现者。
★酶水解作用的发现： 1814年，德国物理学家 Kirchhoff研究了酶的水解现象。
基尔霍夫〔Kirchhoff〕发现淀粉经稀酸加热后可水解为葡萄糖，而某些谷物种子在发酵时也能生成复原糖。
假设把种子抽芽时的水提取物加到泡在水里的谷物中，也能发生不异的水解反响，很显然，活的谷物种子的水解能力取决于包含在此中的水溶性物质，这种水溶性物质脱离了生物体后仍能阐扬作用。
★最早的酶制剂：1833年，法国化学家Payen和Persoz得到了diastase。
佩恩〔Payen〕和帕索兹 (Persoz) 他们从麦芽的水抽提物中，用酒精沉淀得到一种可使淀粉水解成可溶性糖的物质，称之为淀粉酶〔diastase['daiəsteis]〕。
《酶工程》总复习整理
《酶工程》总复习整理生物酶工程主要研究内容（1）用基因工程技术大量生产酶（克隆酶）如：尿激酶原和尿激酶是治疗血栓病的有效药物。
用DNA重组技术将人尿激酶原的结构基因转移到大肠杆菌中，可使大肠杆菌细胞生产人尿激酶原，从而取代从大量的人尿中提取尿激酶。
（2）用蛋白质工程技术定点改变酶结构基因（突变酶）如：酪氨酰－tRNA合成酶，用Ala5（第5位的丙氨酸）取代Thr51（第51位的丝氨酸），使该酶对底物ATP的亲和力提高了100倍。
（3）设计新的酶结构基因，生产自然界从未有过的性能稳定、活性更高的新酶。
酶工程原理和基本过程菌种→扩大培养→发酵→发酵酶液→酶的提取→酶成品↓原料→前处理→杀菌→酶反应器←酶的固定化↓反应液→产品提取→产品●世界三大酶制剂公司Novo Nordisk （丹麦）Genencor International(美国杰能科国际公司）Cuitor(芬兰）●三大公司销售额占世界总额的70%2、米氏常数的意义Km：米氏常数，物理意义为反应速率为最大速率Vmax一半时底物的浓度，单位与底物浓度同（1）Km 是酶的一个特性常数，Km大小只与酶性质有关，而与酶浓度无关。
当底物确定，反应温度，pH及离子强度一定时，Km值为常数，可用来鉴别酶。
Km一般在1×10-6~10-1mol/L之间不同的酶Km 值不同，测定Km要在相同测定条件（pH、温度、离子强度）下进行。
（2）Km 值可用于判断酶的专一性和天然产物，若一个酶有几种底物就有几个Km值，其中Km值最小的底物称为该酶的最适底物，又称天然底物。
（3）可近似表示酶与底物亲和力的大小。
真正表示酶与底物亲和力为Ks =k2/k1(注 Km = k2+k3/ k1)（4）已知Km可由[S]计算v，或由v计算[S]。
酶活力是指一定条件下，酶所催化的反应初速度;酶催化反应速度用单位时间内底物的减少量或产物的增加量来表示。
V=-dS/dt=dP/dt二、酶的活力单位：表示酶活力大小所用的两个国际单位1IU：在最适反应条件下，每分钟催化1μmol底物转化为产物所需的酶量，称一个IU。
酶工程笔记——精选推荐
基因工程：用“剪刀+糨糊”创造新物种的工程。
细胞工程：微观水平的嫁接技术。
酶工程：让工厂高效、安静、美丽如画的工程。
发酵工程：把微生物或细胞造就成无数微型工厂，将神话变为现实的桥梁。
酶——活细胞产生的，能在细胞内外起作用的（催化）生理活性物质提取分离法微生物细胞发酵产酶酶的生产方法生物合成法植物细胞发酵产酶化学合成法动物细胞发酵产酶转录定义：以DNA为模板，以核苷三磷酸为底物，在RNA聚合酶（转录酶）的作用下，生成RNA分子的过程。
RNA的转录过程(三步)1.起始2.延长3.终止翻译定义：以mRNA为模板，以氨基酸为底物，在核糖体上通过各种tRNA、酶和辅助因子的作用，合成多肽链的过程蛋白质的合成过程：氨基酸的活化：1 肽链合成的起始，2肽链的延伸，3肽链合成的终止与释放在核糖体上合成多肽（三阶段）；1、起始阶段2、延伸阶段3、终止阶段1.进位:氨基酰-tRNA进入受位;2.转肽:形成肽键,在转肽酶作用下,给位与受位结合;3.移位:核蛋白体向3’端移动一个密码子的位置,空出受位,不断地进位、转肽、移位,使肽链延长。
肽链合成的终止阶段；1.出现终止密码并与终止因子结合;2.肽键水解,多肽释放;3.tRNA,mRNA,大小亚基解离酶生物合成的调节：通过调节酶合成的量来控制微生物代谢速度的调节机制，是在基因转录水平上进行的。
意义:通过阻止酶的过量合成，节约生物合成的原料和能量调节基因(regulator gene)：可产生一种组成型调节蛋白(regulatory protein) （一种变构蛋白），通过与效应物(effector) （包括诱导物和辅阻遏物）的特异结合而发生变构作用，从而改变它与操纵基因的结合力。
调节基因常位于调控区的上游启动基因（promotor gene）（启动子）：有两个位点：（1）RNA聚合酶的结合位点（2）cAMP-CAP的结合位点。
CAP：分解代谢产物基因活化蛋白（catabolite gene activator protein），又称环腺苷酸受体蛋白(cAMP receptor protein，CRP）。
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抗生素）
菌种纯化：平板划线法，稀释法
产酶性能测定：包括初筛和复筛，初筛是从已分离出来的菌
种中挑出包含目的酶的菌株，复筛是在初筛的基础上筛选产
酶量高、性能更符合要求的菌株。初筛要求检出方法快速、
简便；复筛则要求测定方法相对地精确。
酶活检测定义:是对酶功能的检测.
酶活检测是探测酶催化反应的化学机理,并使其可视化.如光信 号,底物颜色变化,或者是生物选择. 所得即所筛! 笔记：一微生物菌种的分离：1含菌样品的收集 2富集培养 3菌种纯化 二 微生物菌种的筛选：1.初筛 2.复筛 酶工程的四个目标：认识酶，改造酶，创造酶， 二、发酵工艺条件及控制 • 1.酶的发酵生产要求 • ①性能优良菌种（产率，稳定性，发酵周期，营养要求，副产 物，安全性） • ②满足菌种生长需求(菌体是物质基础）； • ③满足菌种产酶需求（不同条件：温度pH等）。 • 2．酶发酵生产的工艺流程 • 保藏菌种（方法）菌种活化（复壮）菌种扩大培养发酵分离纯化 酶 发酵过程中培养基pH的变化由菌种的特性、培养基组分、发酵条件等 决定，引起pH变化的主要原因：微生物对培养基营养成份的利用和代 谢产物的积累。
适用性
吸附法 物理吸 附法 容易 弱
易流失 可能 低 不变
小
广泛
包埋法
离子键 格子型（凝
法
胶型）可能 小 不
小
高
不可能 低 小分子 （不）
大
广泛 小分子底物
共价结 微胶囊型 合
交联法
较难
难
强
强
强
强
高
低
不 低 小分子 （不）
不 高
可变
大
较大
小分子底 物
较广
中等 不 中等 可变
较大
2.发酵代谢调节：理想诱导物的添加，解除反馈阻遏和分解代谢物阻遏
（难利用的碳氮源的使用，补料发酵）。
3. 降低产酶温度。
课堂考试题：
为了提高产酶率和缩短发酵周期，你认为最理想的酶合成模式是什么？
策略措施是什么？
第三章：酶的分离工程 1.酶提取和分离纯化技术路线
第一节 预处理：机械破碎，物理破碎，化学破碎，酶促破碎 第二节 酶的提取：盐溶液提取，酸溶液提取，碱溶液提取，有机溶剂 提取 第三节 酶的分离纯化：1.离心分离，2.沉淀分离，3.过滤与膜分离，4.萃
第五章：化学酶工程 1.通过融合蛋白的方法我们可以得到杂合酶，用以下哪种化学修饰方法 也可以达到同样的目的。 (b)
A、分子内交联 B、分子间交联 C、酶蛋白主链修饰 D、肽链伸 展后的修饰 2.酶分子表面化学修饰 1）化学固定化 2）小分子修饰
3）酶的大分子化学修饰 4）分子内交联 5）分子间交联 6）脂质体包裹 7）反相胶团微囊化
合成也随着停止。 酶的生物合成受到阻遏，而且其所对应的mRNA不稳定。
4. 滞后合成型 Image
只有当细胞生长进入稳定期后，酶开始合成并大量积累。
酶的生物合成受分解代谢物阻遏作用，这类酶所对应的mRNA稳定性
高。
酶生物合成的模式：总结
mRNA的稳定性，培养基中诱导物，反馈阻遏物，分解代谢物的存在是
1. 菌种的选育 2. 培养基的成分和条件的调控 3. 发酵方法 4. 特殊措施
1.某些商业酶的诱导
酶
底物
诱导
α-淀粉酶
淀粉
淀粉或麦芽 糊精
葡萄糖淀粉 淀粉
麦芽糖或异 2.酶的生产方法：
酶
麦芽糖
提取分离法，生物合成
法，化学合成法
3. 产酶菌种的基本要求
不是致病菌
发酵周期短,产酶量高
不易变异退化
最好是产生胞外酶的菌种,利于分离
非极性有机溶剂-PEG修饰酶单相体系； 反胶束体系； （正）胶束体系。 二. 有机介质中酶促反应的影响因素 水的影响 有机溶剂 pH 固定化 酶的形态 温度 添加物
水对有机介质中酶促反应的影响 微量水： 1.酶在完全非水环境中没有催化活性。 2.一定量的水对维持酶催化活性是必需的。 3.水直接或间接参与了酶天然构象中所有的非共价相互作用 4.水充当了酶结构的“润滑剂”，使酶分子的柔性增强 水过多： 酶的热稳定性降低，不利 1.含水量低于最适含水量时，酶活性构象过于“刚性”，使活性降 低。酶活并随着含水量的增大和增大 2.含水量高于最适含水量时，酶结构的柔性过大，酶的构象将向疏 水环境下热力学稳定性的状态变化，引起酶结构的改变和失活。 3.只有在最适的含水量时蛋白质的动力学刚性和热力学稳定性之间 达到最佳平衡点，酶表现出最大活力。
应基团因酶的催化而暴露或活化，作用于酶的活性中心或辅 基，使酶被共价修饰而失活。 1.2 非专一性不可逆抑制剂
密度大，可以提高酶 催化反应的速度。在 工业生产中普遍使 用。 流化床反应器具有混 合均匀，传质和传热 效果好，温度和pH 值的调节控制比较容
易，不易堵塞，对粘 度较大反应液也可进 行催化反应。
反应器类型 适用的操作方式 适用的酶
搅拌罐式反应器 分批式,
游离酶
流加分批式 固定化酶
连续式,
填充床式反应器 连续式
第九章：酶抑制剂 IC50：酶的活性抑制50%时所需的酶抑制剂浓度。 1.1专一性不可逆抑制
（1）Ks型不可逆抑制剂：根据底物的化学结构而设计的抑制 剂，具有和底物类似的结构，可以和相应的酶相结合，同时 所带活泼化学基团化学修饰酶分子中必需基团从而抑制酶的 活性。又称亲和标记试剂。 （2）Kcat型不可逆抑制剂(自杀性底物)：具有与天然底物相 类似的结构，本身也是酶的底物，被酶催化后，潜伏性的反
取分离，5.层析分离，6.电泳分离
第四章：固定化酶和固定化细胞 1.酶的固定化方法：吸附法， 共价结合法， 交联法， 包埋法 海藻酸钠包埋法：优点：成形方便。缺点：孔径大，易漏失。 交联法：借助双功能或多功能试剂 2．各类固定化方法的特点比较
性质
制备 固定化 程度 活力回 收率 再生 费用 底物专 一性 空间位 阻
较广
3. 固定化酶性质 1．稳定性 （一般）储存和操作过程中稳定性增强，主要表现在：
1 热稳定性(构象稳定） ，②蛋白质水解酶的抗性，③变性剂的耐受 性，④保存期延长
2 （一般）最适温度比天然酶高。 (1) 载体性质
载体（-） 载体（＋） (2) 产物性质
微环境 吸引H＋，pH↓ 吸引OH-，pH↑
细胞固定化方法：1载体固定法：吸附法；包埋法；共价交联法 2. 无载体固定法：自絮凝法；物理处理法；共价交联法
包埋法的最大优点是能较好的保持细胞内多酶系统的活力 1）固定化酶和主体溶液组成
固液非均相体系 微环境：固定化酶颗粒附近的环境 宏观体系：主体溶液体系
糖 甜度 葡萄糖 74 蔗糖 100 果糖 173.3
微环境
最适pH 偏高 偏低
最适pH
产物（酸性）
pH↓
偏高
产物（碱性）
pH↑
偏低
4. 底物特异性 底物专一性：由于空间位阻效应，固定化酶对高分子量底物的活性降 低，对低分子量底物的反应速率变化不大
5．酶活力 酶经固定化后大部分活力下降！
题目：戊二醛用于固定酶，该方法属于那种酶的固定化方法？为什么？ 常用的交联剂是戊二醛
4.细胞在一定条件下培养生长， 其生长过程一般经历延迟期、指数生长 期、稳定期和衰亡期等4个阶段 5.通过分析比较细胞生长与酶产生的关系, 可以把酶生物合成的模式分 为4种类型。即同步合成型，延续合成型，中期合成型和滞后合成型。
酶生物合成的模式： 1. 同步合成型
特点：酶的合成与生长同步进行。 酶的生物合成可以诱导，但不受分解代谢物阻遏和反应产物阻 遏。这类酶所对应的mRNA很不稳定。
生物的）都可以应用于定向进化中突变体的产生。
第七章：酶反应器和酶传感器
各种酶反应器的特点
反应器类型 适用的操作方式 适用的酶
搅拌罐式反应器 分批式,
游离酶
流加分批式 固定化酶
连续式,
填充床式反应器 连续式
固定化酶
流化床反应器 分批式 流加分批式 连续式
固定化酶
特点 反应比较完全，反应 条件容易调节控制。
提高有机底物的溶解度，酶不溶于有机溶剂，易回收再利 用； 酶的热稳定性和储存稳定性增加； 改变反应平衡方向，催化水中不能进行的反应； 抑制依赖水的不利反应和副产物（肽水解）； 低沸点的溶剂中产物易于分离； 有机溶剂的凝固点低于水，利于对温度敏感的酶催化反应； 防止微生物的污染； 改变酶选择性，包括底物专一性，对映和区域选择性 有机介质反应体系 酶在含有一定量水的有机溶剂中进行催化反应的体系。 与水互溶的有机溶剂---水单相体系； 与水不溶性有机溶剂组成的两相或多相体系； 非极性有机溶剂-酶悬浮体系；
第六章：生物酶 定向进化不是定点突变
定向进化：突变 筛选 突变位点是随机的，不确定的； 突变位点的数目也是不确定的； 突变的效应更是不可预知的； 理论上讲，凡是能够引起突变的因素（物理的，化学的，
生物的）都可以应用于定向进化中突变体的产生。 定向进化：突变 筛选 突变位点是随机的，不确定的； 突变位点的数目也是不确定的； 突变的效应更是不可预知的； 理论上讲，凡是能够引起突变的因素（物理的，化学的，
2. 延续合成型
酶的合成伴随着细胞的生长而开始，但在细胞生长进入稳定期 后，酶还可以延续合成较长的一段时间。 酶的生物合成可以诱导，但不受分解代谢物阻遏和反应产物阻 遏。这类酶所对应的mRNA相当稳定，在生长稳定期以后相当长 的一段时间内继续用于酶的合成
3. 中期合成型
酶合成在细胞生长一段时间以后才开始，而在细胞进入稳定期后，酶的
影响酶生物合成模型的主要因素。
mRNA稳定性 代谢调节
同步合成型 (-)
诱导
延续合成型 (+) 诱导
中期合成型 (-) 反馈阻遏
滞后合成型 (+) 分解代谢物阻遏