酶工程课件笔记整理

第六章：生物酶 定向进化不是定点突变
定向进化：突变 筛选 突变位点是随机的，不确定的； 突变位点的数目也是不确定的； 突变的效应更是不可预知的； 理论上讲，凡是能够引起突变的因素（物理的，化学的，
生物的）都可以应用于定向进化中突变体的产生。 定向进化：突变 筛选 突变位点是随机的，不确定的； 突变位点的数目也是不确定的； 突变的效应更是不可预知的； 理论上讲，凡是能够引起突变的因素（物理的，化学的，
固定化酶
流化床反应器 分批式 流加分批式 连续式
固定化酶
特点 反应比较完全，反应 条件容易调节控制。
密度大，可以提高酶 催化反应的速度。在 工业生产中普遍使 用。 流化床反应器具有混 合均匀，传质和传热 效果好，温度和pH 值的调节控制比较容 易，不易堵塞，对粘 度较大反应液也可进 行催化反应。
第八章：非水相酶催化 非水相酶催化的特点和优势
1. 菌种的选育 2. 培养基的成分和条件的调控 3. 发酵方法 4. 特殊措施
1.某些商业酶的诱导
酶
底物
诱导
α-淀粉酶
淀粉
淀粉或麦芽 糊精
葡萄糖淀粉 淀粉
麦芽糖或异 2.酶的生产方法：
酶
麦芽糖
提取分离法，生物合成
法，化学合成法
3. 产酶菌种的基本要求
不是致病菌
发酵周期短,产酶量高
不易变异退化
最好是产生胞外酶的菌种,利于分离
较广
3. 固定化酶性质 1．稳定性 （一般）储存和操作过程中稳定性增强，主要表现在：
1 热稳定性(构象稳定） ，②蛋白质水解酶的抗性，③变性剂的耐受 性，④保存期延长
2 （一般）最适温度比天然酶高。 (1) 载体性质
载体（-） 载体（＋） (2) 产物性质
微环境 吸引H＋，pH↓ 吸引OH-，pH↑
提高有机底物的溶解度，酶不溶于有机溶剂，易回收再利 用； 酶的热稳定性和储存稳定性增加； 改变反应平衡方向，催化水中不能进行的反应； 抑制依赖水的不利反应和副产物（肽水解）； 低沸点的溶剂中产物易于分离； 有机溶剂的凝固点低于水，利于对温度敏感的酶催化反应； 防止微生物的污染； 改变酶选择性，包括底物专一性，对映和区域选择性 有机介质反应体系 酶在含有一定量水的有机溶剂中进行催化反应的体系。 与水互溶的有机溶剂---水单相体系； 与水不溶性有机溶剂组成的两相或多相体系； 非极性有机溶剂-酶悬浮体系；
微环境
最适pH 偏高 偏低
最适pH
产物（酸性）
pH↓
偏高
产物（碱性）
pH↑
偏低
4. 底物特异性 底物专一性：由于空间位阻效应，固定化酶对高分子量底物的活性降 低，对低分子量底物的反应速率变化不大
5．酶活力 酶经固定化后大部分活力下降！
题目：戊二醛用于固定酶，该方法属于那种酶的固定化方法？为什么？ 常用的交联剂是戊二醛
第五章：化学酶工程 1.通过融合蛋白的方法我们可以得到杂合酶，用以下哪种化学修饰方法 也可以达到同样的目的。 (b)
A、分子内交联 B、分子间交联 C、酶蛋白主链修饰 D、肽链伸 展后的修饰 2.酶分子表面化学修饰 1）化学固定化 2）小分子修饰
3）酶的大分子化学修饰 4）分子内交联 5）分子间交联 6）脂质体包裹 7）反相胶团微囊化
取分离，5.层析分离，6.电泳分离
第四章：固定化酶和固定化细胞 1.酶的固定化方法：吸附法， 共价结合法， 交联法， 包埋法 海藻酸钠包埋法：优点：成形方便。缺点：孔径大，易漏失。 交联法：借助双功能或多功能试剂 2．各类固定化方法的特点比较
性质
制备 固定化 程度 活力回 收率 再生 费用 底物专 一性 空间位 阻
对医药和食品用酶,还应考虑安全性
凡从可食部分或食品加工中传统使用的微生物生产的酶,安全!
由非致病微生物制取的酶,需作短期毒性实验
非常见微生物制取的酶,需做广泛的毒性实验,包括慢性中毒实
验
4.菌种的分离
高产酶的菌种收集：土壤；发酵生产材料；菌种保藏中心
ATCC
富集培养：预处理-选择性培养基，抑制剂（霉菌-青霉素等
非极性有机溶剂-PEG修饰酶单相体系； 反胶束体系； （正）胶束体系。 二. 有机介质中酶促反应的影响因素 水的影响 有机溶剂 pH 固定化 酶的形态 温度 添加物
水对有机介质中酶促反应的影响 微量水： 1.酶在完全非水环境中没有催化活性。 2.一定量的水对维持酶催化活性是必需的。 3.水直接或间接参与了酶天然构象中所有的非共价相互作用 4.水充当了酶结构的“润滑剂”，使酶分子的柔性增强 水过多： 酶的热稳定性降低，不利 1.含水量低于最适含水量时，酶活性构象过于“刚性”，使活性降 低。酶活并随着含水量的增大和增大 2.含水量高于最适含水量时，酶结构的柔性过大，酶的构象将向疏 水环境下热力学稳定性的状态变化，引起酶结构的改变和失活。 3.只有在最适的含水量时蛋白质的动力学刚性和热力学稳定性之间 达到最佳平衡点，酶表现出最大活力。
2.发酵代谢调节：理想诱导物的添加，解除反馈阻遏和分解代谢物阻遏
（难利用的碳氮源的使用，补料发酵）。
3. 降低产酶温度。
课堂考试题：
为了提高产酶率和缩短发酵周期，你认为最理想的酶合成模式是什么？
策略措施是什么？
第三章：酶的分离工程 1.酶提取和分离纯化技术路线
第一节 预处理：机械破碎，物理破碎，化学破碎，酶促破碎 第二节 酶的提取：盐溶液提取，酸溶液提取，碱溶液提取，有机溶剂 提取 第三节 酶的分离纯化：1.离心分离，2.沉淀分离，3.过滤与膜分离，4.萃
密度大，可以提高酶 催化反应的速度。在 工业生产中普遍使 用。 流化床反应器具有混 合均匀，传质和传热 效果好，温度和pH 值的调节控制比较容
易，不易堵塞，对粘 度较大反应液也可进 行催化反应。
反应器类型 适用的操作方式 适用的酶
搅拌罐式反应器 分批式,
游离酶
流加分批式 固定化酶
连续式,
填充床式反应器 连续式
合成也随着停止。 酶的生物合成受到阻遏，而且其所对应的mRNA不稳定。
4. 滞后合成型 Image
只有当细胞生长进入稳定期后，酶开始合成并大量积累。
酶的生物合成受分解代谢物阻遏作用，这类酶所对应的mRNA稳定性
高。
酶生物合成的模式：总结
mRNA的稳定性，培养基中诱导物，反馈阻遏物，分解代谢物的存在是
抗生素）
菌种纯化：平板划线法，稀释法
产酶性能测定：包括初筛和复筛，初筛是从已分离出来的菌
种中挑出包含目的酶的菌株，复筛是在初筛的基础上筛选产
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酶量高、性能更符合要求的菌株。初筛要求检出方法快速、
简便；复筛则要求测定方法相对地精确。
酶活检测定义:是对酶功能的检测.
酶活检测是探测酶催化反应的化学机理,并使其可视化.如光信 号,底物颜色变化,或者是生物选择. 所得即所筛! 笔记：一微生物菌种的分离：1含菌样品的收集 2富集培养 3菌种纯化 二 微生物菌种的筛选：1.初筛 2.复筛 酶工程的四个目标：认识酶，改造酶，创造酶， 二、发酵工艺条件及控制 • 1.酶的发酵生产要求 • ①性能优良菌种（产率，稳定性，发酵周期，营养要求，副产 物，安全性） • ②满足菌种生长需求(菌体是物质基础）； • ③满足菌种产酶需求（不同条件：温度pH等）。 • 2．酶发酵生产的工艺流程 • 保藏菌种（方法）菌种活化（复壮）菌种扩大培养发酵分离纯化 酶 发酵过程中培养基pH的变化由菌种的特性、培养基组分、发酵条件等 决定，引起pH变化的主要原因：微生物对培养基营养成份的利用和代 谢产物的积累。
1. 生长繁殖最适pH（一般情况下） 细菌、放线菌6.5～8.0; 霉菌、酵母菌 4.0～6.0，植物细胞 5～6 2.发酵方法：1. 固体培养 2. 液体深层发酵 3分批发酵（传统发酵） 4连续
发酵 5. 补料分批发酵（半连续发酵） 3.提高产酶的措施：添加诱导物 ，控制阻遏物的浓度，添加表面活性剂 ，添加产酶促进剂。
生物的）都可以应用于定向进化中突变体的产生。
第七章：酶反应器和酶传感器
各种酶反应器的特点
反应器类型 适用的操作方式 适用的酶
搅拌罐式反应器 分批式,
游离酶
流加分批式 固定化酶
连续式,
填充床式反应器 连续式
固定化酶
流化床反应器 分批式 流加分批式 连续式
固定化酶
特点 反应比较完全，反应 条件容易调节控制。
2. 延续合成型
酶的合成伴随着细胞的生长而开始，但在细胞生长进入稳定期 后，酶还可以延续合成较长的一段时间。 酶的生物合成可以诱导，但不受分解代谢物阻遏和反应产物阻 遏。这类酶所对应的mRNA相当稳定，在生长稳定期以后相当长 的一段时间内继续用于酶的合成
3. 中期合成型
酶合成在细胞生长一段时间以后才开始，而在细胞进入稳定期后，酶的
第九章：酶抑制剂 IC50：酶的活性抑制50%时所需的酶抑制剂浓度。 1.1专一性不可逆抑制
（1）Ks型不可逆抑制剂：根据底物的化学结构而设计的抑制 剂，具有和底物类似的结构，可以和相应的酶相结合，同时 所带活泼化学基团化学修饰酶分子中必需基团从而抑制酶的 活性。又称亲和标记试剂。 （2）Kcat型不可逆抑制剂(自杀性底物)：具有与天然底物相 类似的结构，本身也是酶的底物，被酶催化后，潜伏性的反
细胞固定化方法：1载体固定法：吸附法；包埋法；共价交联法 2. 无载体固定法：自絮凝法；物理处理法；共价交联法
包埋法的最大优点是能较好的保持细胞内多酶系统的活力 1）固定化酶和主体溶液组成
固液非均相体系 微环境：固定化酶颗粒附近的环境 宏观体系：主体溶液体系
糖 甜度 葡萄糖 74 蔗糖 100 果糖 173.3
4.细胞在一定条件下培养生长， 其生长过程一般经历延迟期、指数生长 期、稳定期和衰亡期等4个阶段 5.通过分析比较细胞生长与酶产生的关系, 可以把酶生物合成的模式分 为4种类型。即同步合成型，延续合成型，中期合成型和滞后合成型。
酶生物合成的模式： 1. 同步合成型
特点：酶的合成与生长同步进行。 酶的生物合成可以诱导，但不受分解代谢物阻遏和反应产物阻 遏。这类酶所对应的mRNA很不稳定。
影响酶生物合成模型的主要因素。
mRNA稳定性 代谢调节
同步合成型 (-)
诱导
延续合成型 (+) 诱导
中期合成型 (-) 反馈阻遏
滞后合成型 (+) 分解代谢物阻遏
酶生物合成的模式：理想的酶合成模式
目的：提高产酶率和缩短发酵周期
最理想的合成模式：延续合成型
策略措施：
1. 菌种选育：提高mRNA的稳定性，解除分解代谢物阻遏和反馈阻遏。
适用性
吸附法 物理吸 附法 容易 弱
易流失 可能 低 不变
小
广泛
包埋法
离子键 格子型（凝
法
胶型）
易
较难
中等 强
高 可能 小 不
小
高
不可能 低 小分子 （不）
大
广泛 小分子底物
共价结 微胶囊型 合
交联法
较难
难
强
强
强
强
高
低
不 低 小分子 （不）
不 高
可变
大
较大
小分子底 物
较广
中等 不 中等 可变
较大
应基团因酶的催化而暴露或活化，作用于酶的活性中心或辅 基，使酶被共价修饰而失活。 1.2 非专一性不可逆抑制剂