动物乳腺生物反应器

动物乳腺生物反应器动物物乳腺生物反应器是基于转基因技术平台，使外源基因导入动物基因组中并定位表达于动物乳腺，利用动物乳腺天然、高效合成并分泌蛋白的能力，在动物的乳汁中生产一些具有重要价值产品的转基因动物的总称。

乳腺生物反应器生产的外源蛋白种类广泛，从小分子肽到大分子复杂蛋白质，从生物活性酶到抗体、病毒抗原蛋白均可有效生产。

利用动物乳腺生物反应器生产重组蛋白的优点有：（1）生物活性高，无污染。

动物乳腺有完整的蛋白质翻译后修饰系统，包括糖基化、磷酸化、羧基化等，从而保证了产品的高生物活性。

（2）易分离提纯，成本低廉。

现有的一些人药物蛋白之所以昂贵，除了原料难以收集外，另一原因是分离提纯极为困难成本极高。

而动物乳腺生物反应器的产物直接经乳汁分泌出体外，只需用常规方法除去酪蛋白沉淀乳清，再经层析即可得到重组蛋白，已经建立起完整的分离纯化生产程序。

（3）产量高。

外源基因在动物乳腺中的表达量可以达到每升几克到几十克，小群转基因大家畜的产量即可满足全世界市场的需求。

动物乳腺生物反应器已经成为生物技术领域最具开发应用前景的尖端方向。

动物乳腺生物反应器发展简史转基因动物的研究始于20世纪80年代初。

1980年，Gordon等将重组DNA用显微注射法导入小鼠受精卵原核，首次获得了整合有外源基因的小鼠。

1982年，Palmiter等将大鼠生长激素基因显微注射到小鼠受精卵中，首次获得了体重为正常小鼠2 倍以上的“超级小鼠”并提出了从转基因动物中提取药物蛋白的设想。

此后几年的许多研究奠定了转基因动物技术体系的基础，但真正的乳腺生物反应器研究则始于1987 年Gordon 等的工作，他们将组织型纤溶酶原激活剂（tPA）与小鼠乳清酸蛋白（WAP）基因的启动子构成重组基因，成功地培育出了37只在乳汁中能表达tPA 的转基因小鼠，同年，世界上第一只能从乳汁中分泌α1-抗胰蛋白酶（AAT）的转基因绵羊在英国罗斯林研究所诞生。

从此，开始了乳腺生物反应器的实用性研究。

Simons等（Simons等，1987年）将带MT启动子的β-乳球蛋白-凝血因子IX （BLG-FIX）、BLG-AAT 等重组DNA片段注射到绵羊受精卵中，获得了在乳汁中有外源基因表达的转基因后代。

Wilmut等将羊乳球蛋白基因片段与F-IX和AAT-cDNA 融合质粒注入小鼠及绵羊受精卵中，获得乳汁中含F-IX 和AAT 的转基因小鼠及绵羊。

Wright 等将绵羊BLG基因调控区与人AAT基因相连，获得了 4 只转基因绵羊。

Velander 等利用WAP 基因启动子与人蛋白质C（hPC）cDNA 重组基因获得的转基因猪，重组hPC的表达量（1g/L）比人血中hPC 浓度还高200倍。

Ebert等用β-CA基因的启动子引导tPA 在山羊乳汁中得到表达（1-3g/L）。

Wilmut等（Wilmut等，1997年）首创体细胞克隆技术并成功构建了表达人F-IX的转基因克隆绵羊。

2000年，英国PPL 公司将人类AAT 基因定点整合到胎儿成纤维细胞的前胶原基因座，用转基因细胞生产的转基因打靶绵羊（McCreath等；2000年）；2001年，他们又利用基因打靶技术生产出了AAT、3-GT 和朊病毒双剔除的克隆绵羊。

上述研究可以看出，乳腺生物反应器研究从模式动物——小鼠的转基因开始，逐步建立起了大动物乳腺生物反应器制备的技术平台。

我国的施履吉院士在20世纪80年代初就提出了乳腺生物反应器的构想并获得了表达乙肝病毒表面抗原的转基因兔。

1996 年10 月，复旦大学遗传所和上海医学遗传所合作成功地获得了表达有活性的F-IX蛋白的转基因小鼠和5只转基因绵羊，真正开始了我国的乳腺反应器构建工作。

1998年，上海医学遗传研究所构建成以牛酪蛋白基因启动子驱动F-IX基因表达的表达载体，显微注射到山羊受精卵的雄原核，成功制备了5头转基因羊。

上海医学遗传研究所于1999年2月，得到一头带有人血清白蛋白基因的转基因牛。

2000年，中国农大和北京兴源生物科技中心合作，将改造的人AAT 基因显微注射到山羊受精卵原核中，获得了3只带有人AAT 的转基因山羊。

近几年来的成功报道仍限于显微注射等常规方法，离国外尚有一定差距。

表达载体制备乳腺生物反应器的关键是保证目的蛋白特异性在乳腺中的高效表达，传统表达载体都是选用某种乳蛋白基因的调控序列作为启动子元件。

目前，已经克隆并用作构建载体的乳蛋白基因主要有β-乳球蛋白（BLG）基因、aS1-酪蛋白基因、β-酪蛋白基因、乳清酸蛋白（WAP）以及乳清白蛋白基因。

目的基因十多年来，已有数种高价值的产品在大动物乳汁中生产出来，于小鼠乳腺中获得表达的产品更是多达数百种。

从国际大公司开发的情况可以看出，高经济价值的医用蛋白和营养蛋白是重要的研发对象，如AT一Ⅲ、AAT、蛋白C、乳铁蛋白、乳糖酶等都已进入了三期或二期临床试验阶段。

选择目的基因应当首先考虑那些正常情况下来源困难或浓度低，其他表达系统难以生产且I临床应用前景广阔的蛋白基因。

可以预见，由于细胞工程和基因治疗技术的发展，细胞因子类产品将不会通过动物乳腺反应器生产，而用途更广、需求量更大的治疗性抗体、营养蛋白和工程酶将成为制备乳腺生物反应器的首选靶蛋白。

另外，若能建立起稳定的转基因家畜群，以乳腺反应器生产基因工程疫苗，不仅生产效率可观，而且可直接以乳汁进行临床免疫，达到方便快捷的目的。

动物乳腺生物反应器的关键技术：转基因技术现有的应用于动物乳腺生物反应器制备的转基因技术主要有：1 显微注射法2 逆转录病毒介导法3 配子介导法4 胚胎干细胞（ES）介导法5 核移植介导法还有利用同源重组原理发展起来的基因打靶（敲除）技术，结合体细胞克隆，正成为动物乳腺生物反应器制备的新研究热点。

在乳腺反应器研制中尚存在下述待解决的难题：（1）转基因动物的成功率低。

（2）目的蛋白的表达水平远低于乳汁中总蛋白含量。

（3）目的基因的分离、改造、载体构建、体细胞克隆等技术环节还不够成熟。

（4）“位置效应”与“剂量效应”目前无法克服。

（5）乳汁蛋白基因表达调控机理、目的基因在宿主染色体上整合的详细机制、基因表达调控元件在不同家畜表现差异的原因、乳腺细胞对蛋白质的加工修饰机理等还未弄清。

（6）产品的安全性的问题，外源基因侵入对动物和基因药物对人体正常功能有何影响，否会造成基因污染，尚难定论。

虽有这些问题存在，但许多国家政府和大型制药企业仍竞相投入巨资资助乳腺生物反应器产品的开发和生产，使乳腺反应器研制和产业化呈现日益加速的趋势。

利用乳腺反应器生产营养活性蛋白，如需求量极大的护肤品中的活性蛋白，或者改造奶质而使其具备营养和药用双重功能，或者直接生产口服生物制品，都具有极大的市场潜力。

我们相信乳腺生物反应器产业不仅会成为有高额利润回报的新型行业，而且将会带动整个国民经济的发展，形成全新的产业结构模式。

因此，我们应当抓住机遇，增加投资力度，大力兴办乳腺反应器产业，以在未来的生物高技术竞争中夺得主动权。

2006年6月2日，对于欧洲患有先天性抗凝血酶缺失症的病人们是一个好日子，世界上第一个利用转基因动物乳腺生物反应器生产的基因工程蛋白药物——重组人抗凝血酶Ⅲ（商品名：ATryn ）的上市许可申请获得了欧洲医药评价署人用医药产品委员会肯定批准意见，该重组蛋白药物将在未来3个月内开始销售。

ATryn 的主要成分——重组人抗凝血酶Ⅲ具有抑制血液中凝血酶活性，预防和治疗急慢性血栓血塞形成，对治疗抗凝血酶缺失症有显著效果，据估计该药全球潜在市场每年高达1.5亿美元。

人抗凝血酶Ⅲ是一种人血液中重要的抗凝血因子，但是，作为药物很难从人血中提取该酶，而且由于该酶分子结构复杂，利用微生物发酵系统往往不能表达出这种酶或者表达出的重组蛋白活性丧失，而利用哺乳动物细胞培养体系则成本太高，产量也较低，无法满足该药的临床需求。

20世纪80年代中后期发展起来的转基因动物乳腺生物反应器体系则为生产这些分子结构复杂而且临床需求大的重组蛋白药物提供了可靠途径。

ATryn 是由全球最著名的动物乳腺生物反应器研发企业美国Genzyme转基因公司研制成功的，该药物最神奇之处在于重组人抗凝血酶Ⅲ不是从天然物质中提取，也不是通过微生物发酵或哺乳动物细胞培养基因工程制药体系生产，而是从转基因山羊奶液中生产出来的，即利用一种新的基因工程制药技术——转基因动物乳腺生物反应器制药技术生产的。

美国Genzyme转基因公司从1990年开始即致力于发展转基因山羊乳腺生物反应器技术生产重组人抗凝血酶Ⅲ，攻克了从转基因绵羊生产、重组蛋白表达研究、重组蛋白纯化、临床试验、上市申请到产品生产等环节的诸多技术和非技术障碍，最终使得ATryn 成为世界上第一个动物乳腺生物反应器生产的基因工程新药。

而该药物一旦上市，将掀起制药业的一场革命，也将开辟生物制药业的新纪元——即转基因动物乳腺生物反应器制药将逐渐取代低效的细菌发酵制药和高成本的哺乳动物细胞制药，成为最主要的基因工程制药技术。

动物乳腺生物反应器制药技术是一种利用基因工程技术将目的基因与奶蛋白基因启动子构建成新的重组基因，然后将该重组基因转入动物细胞或受精卵基因组中并发育成转基因动物，发育成熟后在其乳腺中分泌出重组蛋白，这些重组蛋白可开发成重组药物的高新技术。

为什么转基因动物乳腺生物反应器制药将成为最主要的基因工程制药技术呢？那是因为该制药技术具有其他技术无与伦比的优势。

一是产出高产品活性高：乳腺组织是一种高效的产奶器官，一头奶牛一年可产奶8000～10000升，而一只绵羊和山羊也可产奶800～1000升，以最低表达量1克/升的重组蛋白计算（即转基因动物奶液中重组蛋白的含量，一般为1～20克/升），一头奶牛一年就可生产8～10公斤重组蛋白，而哺乳动物细胞培养系统重组蛋白表达量为0.1～1克/升，一头奶牛重组蛋白年产量相当于1000升的发酵罐；而且动物乳腺生物反应器可以生产结构复杂分子量大的蛋白，而且生产的重组蛋白药物生理活性好，与人同源性高，非常接近天然产品。

二是成本低、周期短：由于动物乳腺生物反应器生产重组蛋白不需要昂贵的生产设备（如发酵罐），动物饲养和繁殖成本都比较低，国外经济学家曾算过一笔账，若用其他生产工艺（如哺乳动物细胞培养方法）来生产1克药物蛋白质，成本需800～5000美元，而利用转基因动物只需0.02～0.5美元；目前一种新药由研制开发到上市，需15～20年，转基因动物制药则可缩短到5年。

三是不耗能、无污染：该技术基本上为一畜牧业过程，虽饲养环境要求特别洁净，但仍是给牛羊草料，由牛羊奶中提取药品，因此蛋白生产过程不需昂贵设备，不消耗能源，不会产生工业废料，也不会对环境产生污染，因此动物乳腺生物反应器制药技术是一种可持续发展的新型生物制药技术。