DNA修复与重组解析演示教学
第二章 DNA的结构、复制和修复(共47张PPT)
第一节 染色体
〔2〕核小体结构要点 每个核小体单位包括200bp左右的DNA、 一个组蛋白八聚体以及一个分子的组蛋白H1；组蛋白八聚体构 成核小体的核心结构，分子量100kD，由H2A、H2B、H3和H4各两 个分子所组成；DNA分子以左手方向盘绕八聚体两圈，每圈83bp， 共166bp。用微球菌核酸酶水解，可得到不含组蛋白H1的146bp 的DNA片段(1.75圈)。一个分子的组蛋白H1与DNA结合，锁住核 小体DNA的进出口，从而稳定了核小体的结构；两个相邻核小体 之间以连接DNA(1inkerDNA)相连，长度为0～80bp不等〔图22〕。
第一节 染色体
二、原核生物的染色体
1．细菌染色体形态结构
大肠杆菌染色体长为1 333μm，而要装入长约2μm宽1μm的细胞 中，为此DNA必定以折叠或螺旋状态存在。有实验证明：在DNA分子进 行折叠或螺旋过程中还依赖于RNA分子的作用。如300μm的环状DNA 〔图2-1A〕，通过RNA分子的连接作用将DNA片段结合起来形成环 〔loop〕，从而导致DNA长度缩小成为25μm〔图2-1B〕，在活体大肠 杆菌染色体上约有50多个这样的环。接着每个环内DNA进一步螺旋， 使DNA长度进一步缩短为1.5μm，而形成更高级结构的染色体〔图21C〕。因此，细菌的染色体不是一条裸露的DNA链，而是以高度的组 装形式存在，同时这种组装不仅为了适应细菌细胞的狭小空间，而且 还要有利于染色体功能的实现，便于染色体复制和基因表达。
非组蛋白的功能：①能帮助DNA分子折叠，以形成不同的结构 域，从而有利于DNA的复制和基因的转录；②协助启动DNA复制； ③特异性地控制基因转录，调节基因表达。非组蛋白和组蛋白一 样可以被磷酸化，这被认为是基因表达和调控的重要环节。
《DNA的修复》PPT课件
• DNA分子中一旦产生了 AP位点，AP核酸内切酶 就会切开Ap位点附近的磷 酸二酯键，并移去包括AP 位点核苷酸在内的小片段 DNA。
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Base Excision Repair
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---TAGC-----ATCG---
---TAGC--AU CG
---TAGC-----ATCG---
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回复突变
回复突变：
基因第二次突变时，在第一次突变位点上 恢复成原来碱基的现象。这种几率在自然界很 小。
A--------a
a-------------A
习惯上说的“回复突变”，确切地说是
“校正突变”。
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基因校正
基因的第二个位点突变，来 抑制第一个位点突变的表现型 效应。使第二次表现型恢复为 野生型、或成为有活性的突变 体。
• Causes of Mutations
– Spontaneous Replication Errors – Spontaneous Chemical Changes – Chemically Induced Mutations – Radiation
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化学因素： 常见的化学诱变剂
化合物类别
CC
CC
相邻的胸腺嘧啶
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光复活(photoreactivation)
可见光存在的条件下，在光复活酶作用下将UV引起嘧啶二 聚体分解为单体的过程。
过程 ①光复活酶与T=T结合形成复合物; ②复合物吸收可见光切断T=T之间的C-C共价键,使二
聚体变成单体; ③光复活酶从DNA链解离。
重组DNA技术讲解培训课件
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（一）碱性磷酸酶能去除核酸分子末端的 磷酸基团
来自于大肠杆菌（bacterial alkaline phosphatase，BAP） 或小牛肠（calf intestinal alkaline phosphatase，CIP）。用于 脱去DNA（RNA）5′末端的磷酸基团，使5′ -P成为5′ -OH，该 过程称核酸分子的脱磷酸作用。
表达载体(expression vector) 为使插入的外源DNA序列可转录和翻译
PCR是一种高效快速的体外DNA聚合程序
重组DNA技术讲解
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五、通过特异杂交系统获取某些转录因子的编码DNA
A. 无转录因子：报告基因不表达
报告基因
酵
“诱饵”DNA序列
母 B. 有转录因子：报告基因表达 .
单
转录因子
杂
交
系
报告基因
统 C. 有转录因子 AD/DNA结合蛋白－融合蛋白：报告基因表达
另外，Taq DNA聚合酶具有末端转移酶作用， 能在所合成DNA链的3′末端加上一个单独的腺苷酸 残基（A）。
重组DNA技术讲解
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（七）多核苷酸激酶可使寡核苷酸链5´ 羟基末端磷酸化
常 用 的 是 T4 多 核 苷 酸 激 酶 （ T4 polynucleotide kinase），该酶含5′多核苷酸激酶 和3′磷酸酶活性，能催化ATP的γ-位磷酸向DNA 和RNA的5′-羟基转移。
转化细胞内 由克隆载体 所携带的所 有 cDNA 片 段的集合29从基因组DNA或cDNA中筛选 目的DNA的策略
（亲和筛选法）筛选
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四、经PCR获取目的DNA
如果已经知道目的基因的序列，就能很 方便地用PCR反应，从基因组DNA或cDNA中 获得目的基因，可不必要经过复杂的DNA文 库构建过程。
DNA的损伤修复及突变ppt课件
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1
第一节 DNA的损伤
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2
DNA损伤：一切使DNA结构和功能发生
改变的DNA变化，都可称为基因的损伤 。
根据受损的部位，DNA损伤可以为两种： 碱基损伤 DNA链的损伤
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DNA损伤修复的重要性：
• DNA存储着生物体赖以生存和繁衍的遗传信息，维 护DNA分子的完整性对细胞至关紧要；
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➢ DNA链断裂 脱氧核糖破坏或磷酸二酯键断开而导致DNA链断裂。 一条链断裂称单链断裂（single strand broken）； DNA双链在同一处或相近处断裂称为双链断裂（double strand broken ）。
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➢交联（binding） 同一条DNA链上或两条DNA链上的碱基间以共价
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2. 电辐射引起的DNA损伤
➢ 碱基变化
细胞中的水经辐射解离后产生大量OH-自由基，使 DNA链上的碱基氧化修饰、形成过氧化物的、导致碱 基环的破坏和脱落等。
➢ 脱氧核糖变化
脱氧核糖上的每个碳原子和羟基上的氢都能与OH-反
应，导致脱氧核糖分解，最后会引起DNA链断裂。
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4. 活性氧引起的碱基修饰与链断裂
细胞呼吸的副产物O2-, H2O2造成DNA损伤，产 生一些碱基修饰物（胸腺嘧啶乙二醇、羟甲基尿嘧 啶等），还可引起DNA单链断裂等损伤; 这些损失 的积累可导致老化。
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二、物理因素引起的DNA损伤
1. 紫外线（UV）引起的DNA损伤 2. 电辐射引起的DNA损伤
DNA重组的操作PPT课件
不足：
目的基因的正反向插入 载体或目的基因片段会自身环化 载体与多个目的基因片段之间重组
.
5
（二）不同种酶产生的黏性末端的连接
.
6
二、平末端（blunt end）的连接
（一） 直接连接
T4 DNA连接酶虽然能连接平末端，但效率很低， 只有粘性末端的1~10%。
5’ P3’ HO-
-OH 3’ 5’ P-P 5’ 3’ HO-
平末端连接存在一些缺陷：
（1）连接效率低； （2）破坏限制性内切酶原有的识别位点； （3） 插入没有方向性； （4） 高底物浓度下会产生多拷贝外源片段插 入载体。
（二） 人工加尾形成 “粘性末端”
（1）同聚物加尾法
① 原理： DNA末端转移酶能在没有模板的情况下给DNA 的3’-OH端加上脱氧核苷酸。
3-’ 互补序列 复性
GCTAGCCGG -5’ BamH I 位点
5’
模板
3’- 互补序列 GCTAGCCGG -5’
延伸
5’
模板
3’-
PCR产物 互补序列
.
GCTAGCCGG -5’ 20
带酶切位点的PCR产物
5’- GCAGAATTC PCR产物 GGATCCGCG -3’
3’- CGTCTTAAG PCR产物 CCTAGGCGC -5’
T4 ligase
nick缺口
5’HO-GATCCCGGGGCC
CCGG -GGCCCTAG-OH5’
nick缺口
虽然有缺口，但仍然能与DNA片断连接
T4多核苷酸激酶处理使5’磷酸化
三、PCR产物的连接
1.在引物的5’端设计酶切位点
（1）设计原则 符合载体的多克隆位点；
分子生物学课件DNA的修复和转座
DNA修复和转座：在生 物技术中具有重要的研 究价值，如基因表达调 控、基因进化等
汇报人：
转座子元件（Transposable element）：可移动 的DNA序列，可在基因组中插入和删除
转座子复合体（Transposon complex）：由转座子和 转座酶组成的复合体，可在基因组中插入和删除
转座子家族（Transposon family）：具有相似序列 和功能的转座子集合
转座子：一பைடு நூலகம்可以在基因组中移动 的DNA序列
光修复：通过光修复酶修复受损的DNA
核酸内切酶：切 割DNA双链，形 成单链缺口
DNA聚合酶：填 补单链缺口，形 成新的DNA双链
连接酶：连接 DNA双链，形成 完整的DNA分子
拓扑异构酶：改变 DNA拓扑结构，使 DNA能够顺利复制 和转录
识别损伤：识别 DNA损伤的位置和 类型
切除损伤：切除损 伤的DNA片段
端粒缩短： DNA端粒 缩短，导 致细胞衰 老和死亡
碱基切除修复：切除受损的碱基，再通过 DNA聚合酶填补空缺
核苷酸切除修复：切除受损的核苷酸，再 通过DNA聚合酶填补空缺
重组修复：通过同源重组修复受损的DNA
非同源末端连接修复：通过非同源末端连 接酶修复受损的DNA
错配修复：通过错配修复酶修复受损的DNA
DNA修复：保 持遗传信息的 稳定性，避免
突变积累
DNA转座：增 加基因多样性， 促进生物进化
修复和转座： 共同作用，推
动生物进化
修复和转座： 对生物适应环 境变化具有重
要意义
DNA修复和转座是细 胞正常生理过程的一 部分，如果发生异常， 可能导致疾病发生。
DNA修复和转座异 常可能导致基因突 变，从而引发癌症 等疾病。
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第四章 DNA修复与重组一、填空题1．在大肠杆菌中发现了——----种DNA聚合酶。
DNA修复时需要DNA聚合酶——---。
2．真核生物中有5种DNA聚合酶，它们是：(1)—-----—(2)—---—(3)—---—(4)—-----—(5)—------—。
3．在DNA修复过程中，需要第二种酶，—--------—，作用是将DNA中相邻的碱基—---------—起来。
————————DNA聚合酶具有外切核酸酶的活性。
有两种外切核酸酶的活性，它们分别从—-----------—和—----------—降解DNA。
DNA聚合酶—---------—只有———————外切核酸酶活性。
4．只有真核DNA聚合酶—------—和—------—显示—-----—外切核酸酶活性。
5． DNA大多数自发变化都会通过称之为—----------—的作用很快被校正。
仅在极少情况下，DNA将变化的部分保留下来导致永久的序列变化，称为—-------—。
6．偶然情况下，在同一基因两个稍微不同拷贝(等位基因)间发生重组的过程中，一个等位基因经过—----------—过程会被另一等位基因代替。
7．通过—---------—基因重组，游动DNA序列和一些病毒可进人或离开一条目的染色体。
8． DNA修复包括3个步骤：—-----------—酶对DNA链上不正常碱基的识别与切除，—-------—酶对已切除区域的重新合成，—--------—酶对剩下切口的修补。
9．一种主要的DNA修复途径称—---------—，包括一系列—----—酶，它们都能识别并切去DNA上不正常碱基。
10．—----—途径可以切去任何造成DNA双螺旋大片段改变的DNA损伤。
11．大肠杆菌中，任何由于DNA损伤造成的DNA复制障碍都会诱导—-----—的信号，即允许跨过障碍进行复制，给细胞一个生存的机会。
12．在—----—中，基因交换发生在同源DNA序列间，最常见是发生在同一染色体的两个拷贝间。
13．在交换区域，一个DNA分子的一条链与另一个DNA分子的一条链相互配对，在两个双螺旋间形成一个—--------—。
14．通过—-------—，两个单链的互补DNA分子一起形成—个完全双链螺旋,人们认为这个反应从一个慢的—-----—步骤开始。
15．大肠杆菌的染色体配对需要—-------—；它与单链DNA结合并使同源双链DNA与之配对。
16．一般性重组的主要中间体是—---------—，也用它的发现者名字命名为—-----—。
二、选择题(单选或多选)1．关于DNA的修复，下列描述中，哪些是不正确的?( )(a)UV照射可以引起嘧啶碱基的交联(b)DNA聚合酶Ⅲ可以修复单链的断裂(c)双链的断裂可以被DNA聚合酶Ⅱ修复(d)DNA的修复过程中需要DNA连接酶(e)细菌可以用一种核酸内切酶来除去受损伤的碱基(f)糖苷酶可以切除DNA中单个损伤的碱基2． DNA最普遍的修饰是甲基化，在原核生物中这种修饰的作用有： ( )(a)识别受损的DNA以便于修复(b)复制之后区分链，以确定是否继续复制(c)识别甲基化的外来DNA并重组到基因组中(d)保护它自身的DNA免受核酸内切酶限制(e)识别转录起始位点以便RNA聚合酶能够正确结合3．单个碱基改变是DNA损伤的一种形式，它们： ( )(a)影响转录但不影响复制，在此过程中一个ATG起始密码可能被修改(b)影响DNA序列但不影响DNA的整个结构(c)将继续引起结构变化但不影响复制循环(d)可能由错配复制或酶的DNA修饰(如脱氨基)所引起(e)可以由UV照射(如嘧啶二聚体)或加成化合物形成(如烷基化)所引起4．错配修复是基于对复制期间产生的错配的识别。
下列叙述正确的是：( )(a)UvrABC系统识别并靠DNA聚合酶I促使正确核苷酸的引人而使错配被修复(b)假如识别发生在被重新甲基化的半甲基化DNA之前，那么修复可能偏向野生型序列(Dam甲基化，MutH，MutSL)(c)错配一般由单链交换所修复，这要靠RecA蛋白恢复正常拷贝序列的能力(d)错配修复也可被认为是对DNA的修饰活动，如去烷基化或再氨基化，但是不会替换损伤的核苷酸(e)错配修复是靠正常情况下被LexA蛋白抑制的修复功能完成的(SOS反应)5．非均等交换：( )(a)发生在同一染色体内(b)产生非交互重组染色体(c)改变了基因组织形式，未改变基因的总数(d)在染色体不正常配对时发生(e)减少一个基因簇的基因数，同时增加另一个基因簇的基因数6．许多细菌在它们的基因组中几乎平均分配重组敏感热点，这些热点在大肠杆菌E.coli中称为chi,它们是：( )(a)是双链经常断裂的部位，它可来诱导重组(b)是单链经常断裂的部位，导致单链同化作用(c)是RecBCD复合物作用的位点，在这些位点，受双链断裂激活的RecBCD复合物切开一个自由3’-OH端(d)是顺式作用元件，在该元件内可以产生—个单链的自由3’—OH末端(e)是RecA蛋白结合的DNA位点，RecA蛋白从该位点沿着DNA移动直到断裂点三、判断题1．拓扑异构酶I和Ⅱ可以使DNA产生正向超螺旋。
2．拓扑异构酶I解旋需要ATP酶。
3． RNA聚合酶I合成DNA复制的RNA引物。
4．线粒体DNA的复制需要使用DNA引物。
5．λ噬菌体整合到大肠杆菌基因组上是由一个位点专一的拓扑异构酶(丸整合酶)催化的，它可以识别在两条染色体上短的特异DNA序列。
6．在真核生物染色体DNA复制期间，会形成链状DNA。
7．所有已知的基因转变都需要一定量的DNA合成。
8．根据不同物种同一蛋白质中氨基酸的不同来估计突变率往往较实际的突变率低，因为一些突变体由于危及蛋白质功能，在选择压力下从种群中消失。
9．因为组蛋白H4在所有物种中都是一样的，可以预期该蛋白基因在不同物种中也是一样的。
10．DNA修复机制有很多种，但所有这些机制都依赖于二倍体染色体上两套遗传信息的存在。
11．自发的脱嘌呤作用和由尿嘧啶DNA糖基化酶切去一个已脱碱基的胞嘧啶都会产生可被无嘌呤嘧啶内切核酸酶作为底物识别的同样的中间产物。
12．DNA修复的第一步是由专用于修复过程的酶催化的，下面的步骤由DNA代谢过程中的常用酶催化。
13．大肠杆菌中SOS反应的最主要作用是通过在原始DNA损伤区附近导人补偿突变来提高细胞存活率。
14．DNA中四个常用碱基自发脱氨基的产物，都能被识别出来。
15．在细菌细胞中，短片段修复是由损伤诱导的。
相反，长片段修复是组成型的，且往往涉及长约1500—9000bp损伤DNA片段的替换。
16．真核生物中DNA的修复没有原核生物重要，这是因为体细胞的二倍体特征。
17．一般性重组需要交换的双方都有一长段同源DNA序列，而位点专一重组仅需要短而专一的核苷酸序列，某些情况下，只需要交换双方中的一方具有该序列即可。
18．一般性重组包括DNA片段的物理交换，该过程涉及DNA骨架上磷酸二酯键的断裂和重新形成。
19．RecA蛋白同时具有位点专一的单链切割的活性和将单链从双螺旋DNA分子上脱离的解旋酶的功能，但需要依赖于ATP活性。
20．大肠杆菌的单链结合蛋白通过与糖—磷酸骨架结合并使碱基暴露，从而解开单链上的短发夹结构。
21．RecA蛋白同时与单链、双链DNA结合，因此它能催化它们之间的联会。
22．交叉链互换包括交叉链和未交叉链，至少其中一条链的磷酸骨架断裂才可能使这个过程逆转。
23．基因转变是真菌类偶然改变性别的方式；正常情况下，一次接合产生等量的雄性与雌性孢子，但偶然也会出现1：3或3：1的比例。
·四、简答题1．假如发生了碱基对的错配会产生什么表型，它们怎样被修复?2．为什么DNA的甲基化状态可以为复制的调节和DNA的修复所利用?3，错配修复的方向可以怎样被调节(突变型到野生型或野生型到突变型)?4． RecA蛋白是怎样调节SOS反应的?5，以图4.1A为例，画出图4.1B所示分子同源区域交叉重组的产物，图中用一条单线表示DNA双螺旋，同源重组的靶位点用箭头标出。
图6．图4.2所示为两条同源的亲代双螺旋和两套可能的重组产物。
请画图表示两亲代双螺旋间可以产生指定重组产物的Holliday连接，在每条链的左端标明Holliday连接的3’或5’端，这样亲代和重组双螺旋间的关系就比较清楚。
请指明为了产生每套重组产物哪些链应被切去。
最后，画出经过一轮DNA复制后的重组产物.图7．为什么基因内互补只发生在：(1)某一基因座的等位基因间；(2)这些基因座的特殊等位基因对间?五、分析题1．实验结果表明所研究细菌的一个操纵子具有三个相似拷贝，它编码一个关键酶的亚基。
由于没有检测到第三个碱基简并性(摇摆性)现象，由此说明接近的相同性(99％)是由于DNA 修饰作用的结果。
请问这涉及哪些可能的机理?2．根据对细菌限制和修复系统的知识，设计一个简单的实验来检测你收集的菌株是否有原噬菌体的存在。
3．大肠杆菌中的几个基因包括uvrA、 uvrB、uvrC和recA都与紫外线损伤的修复有关，含有一个有缺陷的上述基因的大肠杆菌细胞系比起野生型细胞对紫外光的射线更敏感，就如图4.3A所示的uvrA与recA突变株。
单个不同基因的突变可以成对联合起来形成所有可能的双突变体。
比起单突变体，双突变体的敏感性变化很大。
相对uvr单突变体，两个uvr突变形成的双突变体对紫外光的敏感性并无多大增加，但recA缺陷和任一种uvr突变体形成的双突变体却使一个细胞株对紫外光极度敏感，如图4.3B所示的uvrArecA双突变体放大图。
(1)为什么一个recA突变和一个uvr突变的结合会产生一个对紫外光极其敏感的细菌菌株，而不同uvr基因突变的结合却和单个突变没有差别?(2)根据泊松分布，当一个细菌种群平均受到一个致命“轰击”，37％(e—1的个体将存活下来，因为它们实际上并没有受到轰击。
对于uvrArecA双突变体，0．04J／m2的剂量使37％的个体存活(如图4.3B)。
计算对uvrArecA双突变体细胞株来说，多少嘧啶二聚体会组成致死轰击，假设大肠杆菌的基因组有4×106个碱基对，包括50％的GC，而且把DNA暴露在400J／m2的紫外线下，会使1％的嘧啶对(TT、TC、CT和CC)变成嘧啶二聚体。
图图4.3 紫外光不同剂量作用下的细胞存活曲线(A)野生型，uvrA、recA单突变体，uvrArecA双突变体的存活曲线(B)uvrArecA存活曲线的放大图4．除了uvrABC内切核酸酶修复、重组修复和SOS修复，细菌还具备一种对嘧啶二聚体更有效的修复系统。
这个现象是在一个关于紫外线对细菌影响的调查中为了确定一个失控的数量而发现的。