芽孢杆菌检测方法及注意事项

枯草、地衣芽孢杆菌检测方法及注意事项
一、检测方法
1.试剂和培养基
1.1 样品稀释液：准确移取1mL吐温80，9gNacl用水定溶1000mL，分装400mL每瓶，
灭菌备用。

1.2 芽孢杆菌培养基：
蛋白胨：10g
酵母浸粉：5g
NaC1盐：10g
琼脂粉：15g
PH值：7.0～7.2
蒸馏水：1000mL
分装，121℃，30分钟蒸汽灭菌后备用。

2.检测步骤
2.1样品处理（每个样品至少重复检测2次）
a) 称取1～3g(准确至0.0002g)的试样或标样于250 mL内置磁性棒的中性瓶中（1000亿称1 g左右，2000亿称3 g左右，3000亿称2 g左右，5000亿称1.2 g左右，称样量视具体芽孢数而定）。

b) 加100 mL稀释液到已称样的中性瓶内。

c) 把上述中性瓶放在磁力搅拌器平台上,混合15min；之后再猛烈摇动1min，再次磁力搅拌混合15min。

d) 将已混合好的试样放入超声波水浴器中（超声波的水平面与试样液面平齐，试样瓶应放在超声波振源处），共超声20min（10min时停止，猛烈摇动试样瓶1 min，然后再超声10min）。

e)超声之后，再次用磁力搅拌混合60min.
2.2样品的稀释
a）向无菌试管分别加入4.5mL稀释液(1000亿6支，2000亿、3000亿、5000亿7支)。

b)吸取0.5mL已处理好的试样溶液于第1支试管中，再从第1支试管吸取0.5mL试样溶液于第2支试管，依此进行到倒数第二支试管(每次加液后,需混合均匀，再进行下一次操作)。

c) 将已混好的倒数第二支试管放入70℃水浴锅中水浴30min。

冷却至室温后准确吸取
0.5mL该试管试样溶液于最后一支试管，混匀、备用。

每次操作必须使用无菌枪头，枪头不可重复使用。

2.3 涂平板及培养
从最后一支试管中准确移取0.1 mL的试样到每个营养琼脂平板中（共4个平板），各平板均标记上分析号、日期、稀释度。

使用1支涂棒，将已放在平板中的试样扩展开（从中心往外移，成辐射状扩展）；在扩展完4个试样平板后，涂棒在1个空白营养琼脂平板上进行涂布（保证涂棒上沾附的活芽胞数也能进行培养、计数）。

扩展完成之后，将其放在37℃恒温箱中培养16—20小时（注：平板使用前应在37℃培养箱中培养二天，以保证平板干燥、无污染）。

2.4计数
a)培养16—20小时后，计平板上的菌落数。

b)小于30或大于200个菌落的平板不计数。

2.5计算
试样中芽胞杆菌的芽胞数N （单位为cfu/g ）,按式(1)计算：
N= c m × 10n
(1)
式中： c ——几个有效平板的平均菌落数,单位为个；
m ——试样的称样量,单位为克（g ）；
10n ——试样稀释倍数。

3 允许差
两次平行测定之相对偏差不大于10%，结果取平均值；否则重新检测。

二、注意事项
1、 移液器每次使用前需校正（谁使用谁校正），减少人和量器引起的误差。

2、 高含量菌剂样品称样量不少于1 g ，确保样品的代表性。

3、 样品处理过程中每次稀释均要保证样品充分悬浮，确保均匀一致。

4、 样品稀释过程中移液前混匀，移液要迅速，以免样品沉降。

5、 稀释过程中，移液器中的液体要完全移入下一浓度，不能有挂壁现象。

6、 平板使用前应在37℃培养箱中培养二天，以保证使用平板干燥、无污染。

7、 平行样品偏差大于允许值，偏差分析并重新检测；菌落数不在规定范围或大部分不在规
定范围重新检测。

三、针对客户疑问的说明
1、 本公司应客户要求，微生物检测室曾对枯草和地衣粉剂产品分别做了80℃10分钟水浴
和70℃30分钟水浴处理的对照试验，检测结果无显著差异。

2、 本公司芽孢菌剂产品为液体深层发酵，经浓缩后进行喷雾干燥，喷雾干燥进料温度210℃
左右，出口温度87℃左右，虽说时间较短，但营养体基本没有。

此是经过验证的。

我们发酵液检测水浴温度是80℃20分钟，原因就是去除营养体。